張佳琪，劉曉冉，陳佳茜，郭廣洋，譚新杰，趙杏利，胥華偉，劉 浩，侯典云*

參與連翹苯丙烷合成途徑的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的篩選與鑒定

張佳琪1, 2，劉曉冉1, 2，陳佳茜1, 2，郭廣洋1, 2，譚新杰1, 2，趙杏利1, 2，胥華偉1, 2，劉 浩1, 2，侯典云1, 2*

1. 河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023 2. 洛陽(yáng)市道地藥材繁育與創(chuàng)新利用工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023

篩選出參與連翹苯丙烷合成途徑的WRKY轉(zhuǎn)錄因子并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過(guò)對(duì)從連翹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選出的62條連翹WRKY基因序列進(jìn)行鑒定；通過(guò)采用蛋白理化性質(zhì)和基序分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、功能注釋、蛋白互作分析、外源激素處理后實(shí)時(shí)熒光定量分析等方式進(jìn)行相關(guān)分析。最終篩選出52條具有WRKY結(jié)構(gòu)域的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的氨基酸數(shù)目在105～728，相對(duì)分子質(zhì)量在12 277.95～80 321.99。蛋白基序分析顯示其均有WRKY結(jié)構(gòu)域，與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹將連翹52個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)一步分為3大類；篩選出5個(gè)可能參與連翹苯丙烷合成途徑的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并推測(cè)其可能以被MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)所調(diào)控的方式介導(dǎo)連翹中苯丙烷合成途徑。通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，從52個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子中篩選出5個(gè)可能參與連翹苯丙烷合成途徑的轉(zhuǎn)錄因子，其表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，且對(duì)不同濃度茉莉酸甲脂表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供研究方向。

連翹；次生代謝產(chǎn)物；WRKY；轉(zhuǎn)錄因子；苯丙烷合成途徑

連翹(Thunb.) Vahl為木犀科連翹屬落葉灌木，多見于中國(guó)河南、河北、山東、陜西、山西等地區(qū)[1]，其干燥果實(shí)入藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱等功效，用于風(fēng)熱感冒、溫病初起、高熱煩渴、神昏發(fā)斑、熱淋澀痛等癥治療[2]。據(jù)報(bào)道[3]，連翹作為傳統(tǒng)中藥，在新型冠狀病毒肺炎的預(yù)防和治療中，也具有較好的療效。研究表明，連翹中有多種次生代謝產(chǎn)物發(fā)揮藥理作用，如類黃酮及萜類、酚酸類等[4]，其中，通過(guò)苯丙烷途徑產(chǎn)生的木脂素類（如連翹苷）和苯乙醇苷類（如連翹脂苷）是連翹的主要活性成分[3]。苯丙烷途徑含有豐富的苯丙烷類化合物和天然化合物。超過(guò)70%的醫(yī)藥產(chǎn)品是以植物代謝物為基礎(chǔ)的，其中許多來(lái)自苯丙烷途徑，包括木質(zhì)素、黃酮類、香豆素、醌和木脂素，它們是許多結(jié)構(gòu)聚合物的基本成分，也是調(diào)節(jié)生物相互作用的花色素、香味化合物或信號(hào)分子等[5]。在許多中藥植物中，如唇形科植物丹參、豆科植物黃芪等，其主要生物活性成分為苯丙烷類化合物，已被證明具有抗氧化劑、自由基清除劑、抗炎和抗癌化合物的作用[6]。

茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）被證實(shí)可作為一種外源誘導(dǎo)因子對(duì)藥用植物體內(nèi)藥理成分的積累產(chǎn)生影響，如雷公藤經(jīng)MeJA誘導(dǎo)之后，顯著提高了愈傷中雷公藤紅素的合成[7]，另外在連翹中也證明了茉莉酸甲脂噴施后連翹葉中連翹苷、連翹脂苷等都有不同程度影響[8]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，僅存在于高等植物中，自1994年Ishiguro等[9]在甘薯中第一次發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子以來(lái)，越來(lái)越多的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在多種植物中被鑒定和驗(yàn)證。據(jù)報(bào)道，WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族在多種植物中參與苯丙烷代謝途徑，在次生代謝物質(zhì)合成中起到重要的調(diào)控作用，如生姜WRKY轉(zhuǎn)錄因子Zo WRKY1[10]、葡萄WRKY轉(zhuǎn)錄因子Vv WRKY2[11]和Vv WRKY26[12]、苜蓿WRKY轉(zhuǎn)錄因子Mt WRKY 100630和Mt WRKY 108715[13]均參與調(diào)控苯丙烷代謝途徑，但在連翹中未見報(bào)道。

本研究在課題組對(duì)連翹噴施200 μmol/L茉莉酸甲脂12 h和未做處理的連翹果實(shí)、葉片進(jìn)行比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，通過(guò)采用蛋白理化性質(zhì)和基序分析、蛋白結(jié)構(gòu)分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析等方式最終篩選出52條連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子，此外，通過(guò)進(jìn)化樹分析、功能注釋、蛋白互作分析、外源激素處理后實(shí)時(shí)熒光定量分析等方式，篩選出5個(gè)可能參與連翹苯丙烷合成途徑的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并推測(cè)其可能以被絲裂原活化蛋白激酶（mitogen- activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)所調(diào)控的方式介導(dǎo)連翹中次生代謝物質(zhì)的合成，而其表現(xiàn)出組織特異性表達(dá)，且對(duì)不同濃度茉莉酸甲脂表現(xiàn)出不同的響應(yīng)，為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供研究方向。

1 材料與儀器

1.1 材料

研究所用的樣品采自河南洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣連翹種植基地，由侯典云教授鑒定為連翹(Thunb.) Vahl。

1.2 儀器

5415R型低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）、JY04S-3D型凝膠成像分析系統(tǒng)（君意電泳公司）、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Lightcycler96, Roche公司，瑞士）等。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

7月下旬，選擇生長(zhǎng)環(huán)境一致，生長(zhǎng)狀況良好的連翹植株掛簽標(biāo)明噴施濃度和日期，于7: 00時(shí)對(duì)葉片進(jìn)行噴施不同濃度茉莉酸甲脂，噴施濃度為50、200、400 μmol/L，每濃度噴施10株連翹。用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的材料為200 μmol/L噴施12 h后的連翹葉片和果實(shí)及其對(duì)照。擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族序列來(lái)源于TAIR（https://www.arabidopsis.org/ index.jsp）。

2.2 連翹WRKY轉(zhuǎn)錄本的篩選與功能注釋

從連翹轉(zhuǎn)錄組序列中篩選獲得62條WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列，通過(guò)結(jié)構(gòu)域在線分析軟件SMART（http://smart.embl.de/）對(duì)保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，使用ORF Finder在線分析網(wǎng)站（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/orffinder/）分析預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子的開放閱讀框（open reading frame，ORF），獲得連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族全長(zhǎng)氨基酸序列。將從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中篩選到的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子比對(duì)到基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行注釋與分析。

2.3 連翹WRKY家族蛋白理化性質(zhì)和蛋白基序分析鑒定

利用在線工具Expasy ProtParam tool（https:// web.expasy.org/protparam/）分析連翹WRKY蛋白的基本理化性質(zhì)。利用SOPMA和signaIP 5.0對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)特征和蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)。通過(guò)CELLO在線預(yù)測(cè)蛋白亞細(xì)胞定位。利用The MEME Suite 5.4.1（https://meme-suite.org/meme/tools/ meme）在線分析連翹WRKY家族蛋白的基序，基序數(shù)量設(shè)置為10，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

2.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

從TAIR擬南芥數(shù)據(jù)庫(kù)中下載完整的擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列。利用MEGA7.0軟件構(gòu)建連翹與擬南芥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列進(jìn)化樹，利用Clustal W進(jìn)行多序列比對(duì)分析，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，設(shè)置重復(fù)次數(shù)為1000，其余參數(shù)選擇默認(rèn)值。

2.5 連翹苯丙烷合成途徑相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能分析

通過(guò)查閱文獻(xiàn)獲得與苯丙烷合成途徑相關(guān)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因序列，與連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，推測(cè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能。利用String在線蛋白互作數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)篩選出的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，物種參數(shù)選擇擬南芥。

2.6 連翹苯丙烷合成途徑相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的驗(yàn)證

使用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾維贊生物科技股份有限公司）對(duì)以上預(yù)測(cè)出的苯丙烷合成途徑相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證，分析連翹葉片、果實(shí)中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量隨著茉莉酸甲脂噴施不同濃度12 h后的變化趨勢(shì)。熒光定量反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、10 s，退火60 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系20 μL：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)至20 μL。所用引物見表1。

3 結(jié)果與分析

3.1 連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子篩選

從本實(shí)驗(yàn)室連翹轉(zhuǎn)錄組序列中篩選出62條WRKY轉(zhuǎn)錄因子序列，通過(guò)ORF預(yù)測(cè)全長(zhǎng)氨基酸及SMART分析序列保守結(jié)構(gòu)域結(jié)果見圖1，發(fā)現(xiàn)ORF長(zhǎng)度為321～2304 bp，10條不具有完整的WRKY結(jié)構(gòu)域的序列，52條具有完整ORF和完整WRKY結(jié)構(gòu)域的序列。

3.2 連翹WRKY家族蛋白理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析

連翹WRKY家族蛋白理化性質(zhì)見表2，連翹WRKY蛋白的氨基酸數(shù)量為105～728，相對(duì)分子質(zhì)量介于12 277.95～80 321.99。51.9%的蛋白等電點(diǎn)小于7.00，且親水性系數(shù)均小于零，說(shuō)明該家族蛋白大多數(shù)為酸性、親水蛋白。同時(shí)，82.7%的蛋白不穩(wěn)定系數(shù)大于40，該家族蛋白大多數(shù)為不穩(wěn)定蛋白。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，連翹WRKY家族蛋白均有α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、無(wú)規(guī)則卷曲和延伸鏈，其中，無(wú)規(guī)則卷曲占64.1%，是最主要的二級(jí)結(jié)構(gòu)形式。信號(hào)肽和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明52個(gè)連翹WRKY家族蛋白均不具有信號(hào)肽，且除TRINITY_DN1857_c0_g1（定位在葉綠體）、TRINITY_DN9153_c0_g2（定位在葉綠體）、TRINITY_DN37721_c0_g1（定位在細(xì)胞外間隙）外，其它的均定位在細(xì)胞核中。

表1 qRT-PCR引物

Table 1 Primers for qRT-PCR

基因ID引物序列（5’-3’） TRINITY_DN14046_c0_g1CCTGCCCGTGACACTAACAT CACCTGCTTCTGCCCATACT TRINITY_DN25488_c0_g1ATCCCGACAGAGTTCCACCG GGTTCATCGCCTTCTGCCTC TRINITY_DN28667_c0_g1TTTTCAGGGCTCCAGATGTC GCTAAGCGTGTCGGTAAAGG TRINITY_DN3231_c0_g1TGCTAGTCTACTGCCCAAGGAT CATAGATGAAGAAGTGGGTGGC TRINITY_DN6456_c0_g2CAAAGGTTCTCCTCACCCAAG GGATCATCCAAGCATTTCTCA UKNCAGACCAGCTTTGAGGAGTATC GGCCAGAAACCAGTAGTCAATA

3.3 連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域鑒定

利用在線軟件MEME對(duì)連翹WRKY家族蛋白序列進(jìn)行分析（圖2），發(fā)現(xiàn)5個(gè)蛋白序列具有5個(gè)motif，52個(gè)連翹WRKY蛋白均具有WRKY結(jié)構(gòu)域（motif 1、motif 3），進(jìn)一步證實(shí)其均為WRKY家族蛋白。

3.4 連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的功能注釋與分析

3.4.1 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析 GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋與分析結(jié)果表明，連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子中有52個(gè)注釋到細(xì)胞組分（cellular component，CC），2個(gè)注釋到分子功能（molecular function，MF），1個(gè)注釋到生物過(guò)程（biological process，BP），見圖3。

3.4.2 KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果統(tǒng)計(jì)與KEGG代謝通路分析 由圖4可以看出有6條序列被注釋到環(huán)境信息處理（environmental information processing， EIP）中的植物MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway-plant）中，11條序列被注釋到OS中的植物-病原相互作用（plant-pathogen interaction）中。

圖1 連翹WRKY蛋白家族結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

表2 連翹WRKY蛋白理化性質(zhì)分析

Table 2 Analysis of physical and chemical properties of WRKY protein from F. suspensa

UnigenORF長(zhǎng)度/bp氨基酸數(shù)目等電點(diǎn)不穩(wěn)定系數(shù)脂肪系數(shù)親水平均系數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu) α-螺旋/%β-轉(zhuǎn)角/%無(wú)規(guī)則卷曲/%延伸鏈/% TRINITY_DN32638_c0_g110473486.6547.1159.43?0.96928.451.4460.34 9.77 TRINITY_DN15730_c0_g1 7682574.9953.3158.02?0.60512.063.1173.9310.89 TRINITY_DN92_c0_g110473487.0749.1863.05?0.480 5.752.8775.8615.52 TRINITY_DN130_c0_g121877285.5352.2252.90?0.79410.992.8875.6910.44 TRINITY_DN31960_c0_g1 8672885.2070.5744.69?1.09121.182.7865.9710.07 TRINITY_DN17865_c0_g1 9033006.0656.6452.00?0.96420.001.3371.00 7.67 TRINITY_DN5195_c0_g216625536.1163.0865.37?0.97412.842.7170.7113.74 TRINITY_DN26114_c0_g1 6692228.9956.0252.30?0.75631.982.2550.4515.32 TRINITY_DN7278_c0_g2 5491828.6838.7747.64?0.86226.374.9552.2016.48 TRINITY_DN3781_c0_g113444476.8460.0261.25?0.61510.512.0176.7310.74 TRINITY_DN19770_c0_g1 5191729.6735.0465.06?0.81925.006.4051.7416.86 TRINITY_DN36133_c1_g210623476.1454.4969.71?0.77438.901.4448.9910.66 TRINITY_DN32493_c0_g1 6992328.2046.5451.21?0.99311.217.3361.6419.83 TRINITY_DN15948_c0_g1 5701898.2350.8055.71?1.02820.115.8258.2015.87 TRINITY_DN2185_c0_g117103045.9075.8844.93?1.043 7.572.6381.58 8.22 TRINITY_DN9835_c0_g1 4291844.7567.8352.34?1.09229.351.6359.78 9.24 TRINITY_DN34934_c0_g1 3631217.7831.5378.18?0.88944.635.7940.50 9.09 TRINITY_DN11182_c0_g2 8072688.6350.4063.69?0.74731.723.3654.4810.45 TRINITY_DN17876_c0_g211494536.5956.5061.06?0.93515.452.8771.0810.60 TRINITY_DN1015_c1_g2 7772655.4460.7052.72?0.70910.193.0276.6010.19 TRINITY_DN10738_c0_g1 8942977.6869.7044.31?1.00524.921.6863.64 9.76 TRINITY_DN130_c0_g221217065.8254.5658.16?0.71811.612.8374.65 2.83 TRINITY_DN28667_c0_g114974986.0950.8565.30?0.58930.322.6157.23 9.84 TRINITY_DN13376_c0_g111731469.3047.0272.19?0.22426.034.1147.2622.60 TRINITY_DN3231_c0_g123042098.9248.6043.35?1.362 8.134.7875.6011.48 TRINITY_DN17876_c0_g111493976.00.60.4265.04?0.88217.382.0269.5211.08 TRINITY_DN25488_c0_g112394128.9134.9162.48?0.84513.112.6772.3311.89 TRINITY_DN6456_c0_g210383459.1956.7864.70?0.77522.614.0664.35 8.99 TRINITY_DN3962_c0_g1 5761719.2554.6768.95?0.61733.336.4350.29 9.94 TRINITY_DN3381_c0_g1 4171859.8969.1162.70?0.90815.683.2474.05 7.03 TRINITY_DN17815_c0_g110503494.9747.7563.41?0.69720.064.0167.91 8.02 TRINITY_DN33631_c0_g111281649.1466.9363.54?0.55215.242.4475.00 7.32 TRINITY_DN1051_c0_g1 5821934.6952.9267.15?0.52518.652.0769.95 9.33 TRINITY_DN53314_c0_g1 5371799.5444.3655.98?0.93030.177.8253.07 8.94 TRINITY_DN18337_c0_g1 9063015.7358.1256.38?0.81027.912.3362.46 7.31 TRINITY_DN7399_c0_g1 6902337.6761.5542.66?0.95920.603.4362.6613.30 TRINITY_DN11067_c0_g3 3691229.3833.5141.39?1.13322.957.3850.8218.85

續(xù)表2

UnigenORF長(zhǎng)度/bp氨基酸數(shù)目等電點(diǎn)不穩(wěn)定系數(shù)脂肪系數(shù)親水平均系數(shù)二級(jí)結(jié)構(gòu) α-螺旋/%β-轉(zhuǎn)角/%無(wú)規(guī)則卷曲/%延伸鏈/% TRINITY_DN56780_c0_g11725330 9.2542.0065.18?0.52221.821.2166.0610.91 TRINITY_DN5090_c0_g11443325 5.2643.5156.74?0.71616.922.7768.9211.38 TRINITY_DN18709_c0_g3 981326 6.3750.2951.75?0.85822.091.8469.63 6.44 TRINITY_DN37721_c0_g1 52516110.0369.8746.65?1.027 7.452.4875.7814.29 TRINITY_DN37541_c0_g12187728 5.8150.1859.05?0.75011.542.7575.6910.03 TRINITY_DN48409_c0_g2 351105 9.4077.4449.24?1.109 8.571.9066.6722.86 TRINITY_DN9153_c0_g2 579156 9.6861.1286.92?0.42432.693.8550.6412.82 TRINITY_DN13886_c0_g1 573190 4.8444.9650.84?0.73124.212.6367.89 5.26 TRINITY_DN1857_c0_g11299432 5.7959.2248.10?0.923 7.643.2479.86 9.26 TRINITY_DN41966_c0_g11002333 6.6875.6652.43?0.84919.222.1069.07 9.61 TRINITY_DN9289_c0_g1 489162 9.1536.3078.77?0.28333.956.1740.1219.75 TRINITY_DN14046_c0_g11587528 6.5861.2755.80?0.89413.263.2270.8312.69 TRINITY_DN20171_c0_g1 573190 5.8435.5586.00?0.16324.212.6350.5322.63 TRINITY_DN49536_c0_g1 573190 9.2140.0068.26?0.58930.006.3252.1111.58 TRINITY_DN10845_c0_g1 591196 5.0534.5465.10?0.61425.004.0861.22 9.69

圖2 連翹WRKY蛋白家族保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

Fig.2 Analysis of conserved motifs and gene structure of WRKY protein family in F. suspensa

3.5 連翹WRKY蛋白進(jìn)化樹分析

利用MEGA 7.0構(gòu)建連翹和擬南芥WRKY蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示，參考擬南芥WRKY分類依據(jù)，將連翹WRKY家族分為3大類，第I類包含12個(gè)連翹WRKY家族蛋白，其中有9個(gè)蛋白具有2個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域；第II類包含33個(gè)連翹WRKY家族蛋白，根據(jù)其鋅指結(jié)構(gòu)的不同進(jìn)一步分為IIb（5個(gè)）、IIc（17個(gè)）、IId（1個(gè)）、IIe（10個(gè)），連翹WRKY蛋白不具有IIa成員；第Ⅲ類包含7個(gè)連翹WRKY家族蛋白，且皆與擬南芥對(duì)應(yīng)類蛋白在同一分支。

圖3 連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子GO二級(jí)分類圖

圖4 連翹WRKY的KEGG代謝通路富集圖

3.6 連翹苯丙烷合成途徑相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能分析

基于NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，連翹TRINITY_DN14046_c0_g1、TRINITY_DN3231_c0_g1、TRINITY_DN25488_c0_g1、TRINITY_DN28667_c0_ g1、TRINITY_DN6456_c0_g2分別與Vv WRKY2、Mt WRKY 108715、Vv WRKY26、Mt WRKY 100630和Zo WRKY1聚為一支（圖6），預(yù)測(cè)這些連翹WRKY蛋白也可能參與苯丙烷合成途徑，繼而調(diào)控連翹次生代謝物質(zhì)的合成。

圖5 連翹和擬南芥WRKY蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6 連翹與其他參與苯丙烷途徑WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化樹

3.7 連翹WRKY蛋白互作分析

利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)檢索構(gòu)建了篩選出的5個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子互作蛋白網(wǎng)絡(luò)（圖7）。與其互作的蛋白有MPK3、MPK4、SIB1、SIB2、MKS1等，其中MPK3在丹參中被證實(shí)Sm MPK3（可能與At MPK3同源）通過(guò)MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)控Sm AREB1、Sm MYB36、Sm MYB39、Sm MYB111、Sm PAP1參與酚酸合成途徑[14]。因此推測(cè)篩選出的與MAPK3互作的3個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子可能參與苯丙烷途徑的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子與MPK3相互作用來(lái)調(diào)控連翹中次生代謝物質(zhì)的形成。

3.8 連翹苯丙烷合成途徑相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的驗(yàn)證分析

為驗(yàn)證5個(gè)可能參與連翹苯丙烷合成途徑相關(guān)的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子，分析了不同濃度茉莉酸甲脂處理12 h后，5個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子對(duì)不同濃度茉莉酸甲脂處理12 h后的相對(duì)表達(dá)量變化。結(jié)果見圖8，連翹的5個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)和葉片中均有表達(dá)，除TRINITY_DN3231_c0_g1外，其余4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在葉片中的表達(dá)量均高于果實(shí)。

在50、200、400 μmol/L茉莉酸甲脂處理12 h后，5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子均表現(xiàn)出對(duì)不同濃度茉莉酸甲脂的響應(yīng)，結(jié)果見圖9，除TRINITY_DN14046_c0_g1在葉片中表現(xiàn)出隨著激素濃度的升高，表達(dá)量也升高外，其余均為低濃度促進(jìn)，高濃度抑制，圖10在果實(shí)中也呈現(xiàn)出不同程度的低濃度促進(jìn)、高濃度抑制現(xiàn)象，且有研究表明，在外源激素處理后，參與植物次生代謝的基因均對(duì)其有不同程度的響應(yīng)。因此，進(jìn)一步推測(cè)5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能參與連翹苯丙烷合成途徑。

圖7 連翹5個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白互作分析

不同字母表示差異顯著，P＜0.05，下同

圖9 5個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同濃度MeJA處理12 h后葉片中相對(duì)表達(dá)量

圖10 5個(gè)連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子在不同濃度MeJA處理12 h后果實(shí)中相對(duì)表達(dá)量

4 討論

植物可以采用多種方法應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫，其中許多防御機(jī)制是基于次生代謝物的產(chǎn)生[15]。其中一些次生代謝物質(zhì)還具有營(yíng)養(yǎng)或藥理活性（抗生素、抗癌、抗糖尿病等）[16]。據(jù)估計(jì)，目前使用的治療化合物中至少有30%來(lái)自藥用植物的次生代謝物[17]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，WRKY轉(zhuǎn)鐵蛋白調(diào)節(jié)植物的抗逆性和次生代謝的同時(shí)也可調(diào)節(jié)植物對(duì)非生物脅迫的相應(yīng)，從而影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[18]。且有研究表明，通過(guò)調(diào)控植物轉(zhuǎn)錄因子，可以改變次生代謝物的含量[19]。

MAPK級(jí)聯(lián)普遍存在于真核細(xì)胞中。這些級(jí)聯(lián)反應(yīng)涉及4種不同類型的激酶：MAPKs、MAPKKs、MAPKKKs和MAPKKKs[20]。MAPK級(jí)聯(lián)對(duì)于植物的生長(zhǎng)、發(fā)育以及防御生物脅迫和非生物脅迫都很重要[21]。此外，MAPK級(jí)聯(lián)很可能參與次生代謝，包括駱駝蓬蛋白和吲哚硫代葡萄糖苷、尼古丁、花青素、植保素[22]。同時(shí)，MAPK級(jí)聯(lián)調(diào)控SA、JA、生長(zhǎng)素（in，AUX）和乙烯[23]等植物激素的生物合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Yang等[6]研究表明，連翹噴施不同濃度茉莉酸甲脂后，可對(duì)連翹中次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生不同程度的影響，即總黃酮含量隨著MeJA濃度的升高而增長(zhǎng)；木脂素類化合物連翹苷含量表現(xiàn)出低濃度抑制，高濃度增加；苯乙醇苷類化合物連翹脂苷A積累整體上呈現(xiàn)抑制作用。因此推測(cè)，MAPK級(jí)聯(lián)可能會(huì)對(duì)外源MeJA處理后連翹的次生代謝物合成途徑產(chǎn)生影響。

連翹作為我國(guó)傳統(tǒng)中藥材，以果實(shí)入藥，產(chǎn)生的化合物能夠有效的治療一些疾病。本研究基于該條件通過(guò)對(duì)連翹轉(zhuǎn)錄組篩選出52個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析，蛋白一、二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等一系列生物信息學(xué)分析，篩選出5個(gè)可能參與連翹苯丙烷合成途徑的連翹WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并通過(guò)STRING分析得到了5個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能被MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)所調(diào)控，而具體蛋白互作情況仍不清楚，需后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其作用方式。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening and identification of transcription factors WRKY involved in phenylpropane synthesis pathway in

ZHANG Jia-qi1, 2, LIU Xiao-ran1, 2, CHEN Jia-xi1, 2, GUO Guang-yang1, 2, TAN Xin-jie1, 2, ZHAO Xing-li1, 2, XU Hua-wei1, 2, LIU Hao1, 2, HOU Dian-yun1, 2

1. College of Agricultural, Henan University of Science and Technology, Luoyang 471023, China 2. Luoyang Engineering Research Center of Breeding and Utilization of Dao-di Herbs, Luoyang 471023, China

To screen out the WRKY transcription factors involved in the phenylpropane synthesis pathway ofand conduct bioinformatics analysis.A total of 62 WRKY gene sequences screened fromtranscriptome data were identified. Then the correlation analysis was carried out by means of protein physical and chemical properties and motif analysis, protein structure analysis, phylogenetic analysis, functional annotation, protein interaction analysis, real-time fluorescence quantitative analysis after exogenous hormone treatment.A total of 52 WRKY transcription factors with WRKY domain were screened. The number of amino acids of the protein encoded by WRKY transcription factor ranged from 105 to 728, and its molecular weight ranged from 12 277.95 to 80 321.99. The analysis of protein motif showed that all of them had WRKY domains, and the phylogenetic tree was constructed withWRKY transcription factors to further divide 52 WRKY transcription factors ofinto three categories; FiveWRKY transcription factors that may participate in the phenylpropane synthesis pathway ofwere screened, and it was speculated that they may mediate the phenylpropane synthesis pathway ofin a way regulated by MAPK cascade reaction.By analyzing the transcriptome sequencing results, this study screened five transcription factors that may participate in the phenylpropane synthesis pathway ofWRKY from 52 transcription factors, which showed tissue-specific expression and different responses to different concentrations of methyl jasmonate, providing a research direction for the further study of its mechanism of action.

(Thunb.) Vahl; secondary metabolites; WRKY; transcription factor; phenylpropane synthesis pathway

R286.12

A

0253 - 2670(2023)18 - 6055 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.023

2023-02-03

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（U1404829）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目“名貴中藥資源可持續(xù)利用能力建設(shè)項(xiàng)目”（2060302）；河南省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（202102110156）；河南省中藥材產(chǎn)業(yè)科技特派員服務(wù)團(tuán)、河南省中藥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助

張佳琪（1998—），碩士研究生，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E-mail: 799535911@qq.com

侯典云（1975—），教授，博士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源評(píng)價(jià)與利用。Tel: (0379)6428230 E-mail: dianyun518@163.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]