張 璐，劉辰鵬，王瑞琪，焦偉華，張小坡*

海綿共生木霉屬真菌綠木霉中1個(gè)新的倍半萜類(lèi)化合物

張 璐1, 2，劉辰鵬1，王瑞琪1，焦偉華2，張小坡1*

1. 海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 ?？?571199 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 藥學(xué)部海洋藥物研究中心（癌基因及相關(guān)基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），上海 200127

研究海綿共生真菌綠木霉（CMB-TN16）的次級(jí)代謝產(chǎn)物及其腫瘤細(xì)胞毒活性。利用硅膠柱色譜、半制備液相色譜等現(xiàn)代色譜技術(shù)方法進(jìn)行分離純化，結(jié)合核磁共振和質(zhì)譜等現(xiàn)代譜學(xué)手段鑒定化合物結(jié)構(gòu)，同時(shí)通過(guò)體外MTT法測(cè)定化合物的腫瘤細(xì)胞毒活性。從海綿共生真菌綠木霉醋酸乙酯提取物中分離得到7個(gè)倍半萜類(lèi)化合物，分別鑒定為二綠木霉烯醇H（1）、二綠木霉烯醇D（2）、二綠木霉烯醇G（3）、黏埽霉酸（4）、(＋)-氫化萜烯七脂酸（5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸A（6）和木聚酸D（7）?；衔?體外對(duì)人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞、人骨髓瘤NCI-H929細(xì)胞及人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為11.8、7.7和13.5 μmol/L?；衔?為新化合物，對(duì)以上3株腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒活性。

海綿；綠木霉；倍半萜；抗腫瘤；細(xì)胞毒活性；二綠木霉烯醇H；(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸

由于海洋微生物生存環(huán)境的特殊性，其生態(tài)系統(tǒng)的高壓、高鹽、低氧、低溫、無(wú)光照等特點(diǎn)，形成了有別于陸地微生物的獨(dú)特的新陳代謝途徑、生存繁殖方式、適應(yīng)機(jī)制，造就了海洋微生物更為豐富多樣、結(jié)構(gòu)新穎特殊且活性顯著的天然代謝產(chǎn)物[1-3]。近年來(lái)，海洋微生物來(lái)源的天然產(chǎn)物得到研究人員的廣泛關(guān)注，為先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)和結(jié)構(gòu)優(yōu)化、海洋創(chuàng)新藥物及海洋中藥的研究及開(kāi)發(fā)等創(chuàng)造有利條件，海洋微生物來(lái)源天然產(chǎn)物已成為新藥研發(fā)先導(dǎo)化合物的重要寶庫(kù)和主要來(lái)源[4-6]。

海綿資源是研究共附生微生物的重要資源之一，越來(lái)越多的證據(jù)揭示海綿共附生微生物是其宿主中很多次級(jí)代謝產(chǎn)物的真正生產(chǎn)者，也成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外海洋新藥開(kāi)發(fā)的研究熱點(diǎn)[7-9]。課題組從中國(guó)南海的海綿sp.中獲得其1株木霉屬共生微生物綠木霉-CMB-TN16。文獻(xiàn)研究表明，海洋中的木霉屬真菌含有豐富的萜類(lèi)、聚酮、肽類(lèi)等，其中萜類(lèi)是其特征性成分且具有細(xì)胞毒、抗病原菌、抗菌、殺蟲(chóng)等多種生物活性而受到廣泛關(guān)注[10-11]。課題組前期腫瘤細(xì)胞毒活性篩選發(fā)現(xiàn)1株中國(guó)南海海綿共生菌綠木霉CMB-TN16醋酸提取物體外具有一定的腫瘤細(xì)胞毒活性，為了更深入地研究綠木霉CMB-TN16的特征性次級(jí)代謝產(chǎn)物，對(duì)其醋酸乙酯中潛在的抗腫瘤活性化學(xué)成分進(jìn)行研究，并分離得到7個(gè)倍半萜類(lèi)化合物（圖1），分別鑒定為二綠木霉烯醇H（divirensol H，1)、二綠木霉烯醇D（divirensol D，2）、二綠木霉烯醇G（divirensol G，3）、黏埽霉酸（gliocladic acid，4）、(＋)-氫化萜烯七脂酸（hydroheptelidic acid，5）、(＋)-3--乙酰萜烯七脂酸（3--acetylheptelidic acid A，6）和木聚酸D（xylaric acid D，7）。同時(shí)，對(duì)所得化合物進(jìn)行了體外抗腫瘤細(xì)胞活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的化合物，為其后期的進(jìn)一步研究提供基礎(chǔ)。

圖1 化合物1～7的結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

1.1 儀器

Bruker-AVANCE600 NMR核磁共振儀（瑞士Bruker公司），賽默飛LTQ液質(zhì)離子阱質(zhì)譜儀液質(zhì)聯(lián)用儀（賽默飛公司），Chirascan CD圓二色譜儀（英國(guó)應(yīng)用光物理公司），高效液相色譜用島津液相色譜LC-16系統(tǒng)，配置SPD-16檢測(cè)器和YMC柱（ODS，250 mm×2.5 mm，5 μm，日本島津公司），薄層色譜硅膠板GF254（青島海洋化工廠），Sephadex LH-20凝膠柱填料（Healthcare公司），柱色譜硅膠粉200～300目（青島海洋化工廠），所用試劑為分析純（西隴科學(xué)股份有限公司）或色譜純（天津康科德科技有限公司），DMEM和RPMI Medium 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶溶液、PBS均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，人大細(xì)胞肺癌NCI-H460細(xì)胞、人骨髓瘤NCI-H929細(xì)胞及人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù)。楝酰胺（批號(hào)64166）購(gòu)自Med?ChemExpress 公司。

1.2 真菌來(lái)源與發(fā)酵

從中國(guó)南海海域的海綿sp.樣品中分離得到的菌株CMB-TN16，經(jīng)ITS測(cè)序鑒定為木霉屬真菌綠木霉。將菌株接種于PDA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床上培養(yǎng)7 d；然后切成1 cm×1 cm的小塊作為種子進(jìn)行發(fā)酵，接種于10×1 L的大米培養(yǎng)基中，室溫靜置培養(yǎng)30 d。

2 提取與分離

在室溫下，用醋酸乙酯提取所得培養(yǎng)物，直到醋酸乙酯相變?yōu)闊o(wú)色或淺色。有機(jī)相通過(guò)濾紙濾過(guò)，蒸發(fā)干燥，得到粗提取物。粗提取物（7.2 g）經(jīng)正相硅膠柱色譜，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～0∶100）為流動(dòng)相梯度洗脫，得15個(gè)流份（Fr. A～O）。根據(jù)UPLC-MS分析所得流分中的化學(xué)成分，對(duì)可能含有特征性倍半萜成分的流分Fr. D和Fr. I開(kāi)展進(jìn)一步深入的分離純化。Fr. D（67.1 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜，以57% 乙腈-水（3.0 mL/min）等度洗脫，得到化合物1（2.5 mg，R16.0 min）和3（8.8 mg，R＝23.0 min）。對(duì)Fr. I（1.78 g）進(jìn)行反相固相色譜（GracePure C18-Max，從石油醚-醋酸乙酯-甲醇4∶5∶1開(kāi)始梯度洗脫（梯度變化：甲醇含量為10%、20%、40%、60%、80%、100%）洗脫，得到10個(gè)亞組分Fr. I1～I(xiàn)10。Fr. I7（88.7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜46%乙腈-水等度洗脫（3.0 mL/min）分離純化得到化合物2（9.8 mg，R＝13.0 min）。Fr. I8（88.7 mg）經(jīng)半制備高效液相色譜48%乙腈-水等度洗脫（3.0 mL/min）分離純化，得到化合物4（4.4 mg，R＝24.0 min）、5（8.2 mg，R＝28.0 min）、6（1.6 mg，R＝30.0 min）和7（1.1 mg，R＝33.0 min）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數(shù)據(jù)(600/150 MHz, CD3OD)

Table 1 1H- and 13C-NMR data of compound 1 (600/150 MHz, CD3OD)

碳位δHδC碳位δHδC 1 167.31' 167.3 2 133.72' 133.7 34.32 (t, J = 8.4 Hz)56.73'4.28 (d, J = 12.0 Hz), 4.15 (d, J = 12.0 Hz)56.7 46.51 (d, J = 10.8 Hz)145.74'6.71 (d, J = 10.8 Hz)145.2 52.70 (d, J = 9.6 Hz)40.75'2.92 (m)40.8 62.58 (d, J = 11.4 Hz)58.66'2.14 (d, J = 11.4 Hz)52.8 7 72.37' 75.4 82.29 (d, J = 12.6 Hz), 1.43 (m)35.08'1.78 (m), 2.02 (d, J = 13.8 Hz)31.9 91.67 (m), 1.27 (m)20.99'1.64 (m), 1.26 (m)21.1 101.36 (m)46.810'1.38 (m)46.8 111.75 (m)28.611'1.75 (m)28.5 120.93 (d, J = 7.2 Hz)20.612'0.77 (d, J = 6.6 Hz)15.0 130.81 (d, J = 6.6 Hz)15.113'0.97 (d, J = 6.6 Hz)20.9 144.61 (d, J = 12.0 Hz), 4.41 (d, J = 12.0 Hz)75.414'4.47 (d, J = 9.6 Hz), 4.07 (d, J = 9.6 Hz)75.4 15 173.915' 173.9

化合物1的相對(duì)構(gòu)型由偶合常數(shù)和NOESY譜判斷。在NOESY譜中，H-5與H-11，H-5與H-11存在相關(guān)，表明H-5/H-10和H-5′/H-10′構(gòu)型；H2β-14與H2β-9/H-5存在NOESY相關(guān)，H2α-14′與H2β-9′/H-5′存在NOESY相關(guān)，結(jié)合偶合常數(shù)5,6= 11.4 Hz，5′,6′= 11.4 Hz，表明C-5/C-10、C-5′/C-10′為椅式構(gòu)型與H-5/H-5′、H-6/H-6′、H-10/H-10′和H2-14/H2-14′軸向方向?？紤]其生物合成途徑，化合物1與二綠木霉烯醇C具有一致的絕對(duì)構(gòu)型。為了進(jìn)一步確定其絕對(duì)構(gòu)型，參考該類(lèi)化合物的生物合成途徑以及在 B3LYP/6-31 G (d) 基組水平的計(jì)算ECD圖譜與化合物1的實(shí)驗(yàn)圖譜一致（圖3），確定其絕對(duì)構(gòu)型為5,6,7,10,5,6, 7,10-1。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，確定該化合物為新化合物，命名為二綠木霉烯醇H（divirensol H）。

圖2 化合物1的關(guān)鍵1H-1H COSY和HMBC相關(guān)

圖3 化合物1的實(shí)測(cè)和計(jì)算ECD譜圖

4 活性測(cè)試

采用MTT法[14]，以楝酰胺為陽(yáng)性對(duì)照藥，測(cè)定化合物1～7對(duì)NCI-H460、NCI-H929及SW620細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（表2）表明，化合物1對(duì)以上3株腫瘤細(xì)胞均具有一定的細(xì)胞毒活性，其半數(shù)抑制濃度（median inhibition concentration，IC50）值分別為11.8、7.7、13.5 μmol/L；化合物2～7對(duì)以上3株腫瘤細(xì)胞毒活性較弱。

表2 化合物1～7對(duì)3株腫瘤細(xì)胞毒活性

Table2 Cytotoxic activities of compounds 1—7 against three tumor cell lines

化合物IC50/(μmol·L?1)NCI-H460NCI-H929SW620 111.8±1.7 7.7±0.213.5±0.6 2＞3220.2±0.9＞32 3＞32＞32＞32 420.9±0.118.2±0.6＞32 5＞32＞3220.9±0.3 619.6±0.8＞3222.2±0.3 7＞3221.2±1.118.4±0.8 楝酰胺 3.9±0.6 1.2±0.2 2.8±0.3

5 討論

海綿是已知生物中最復(fù)雜的生物共生體，是研究共附生微生物的重要資源之一。海綿來(lái)源真菌因其代謝途徑復(fù)雜，能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎、活性強(qiáng)烈的代謝產(chǎn)物，這為藥物先導(dǎo)化合物提供了多種可能，成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本研究從我國(guó)南海海綿共生菌株綠木霉CMB-TN16的發(fā)酵物中分離得到7個(gè)倍半萜類(lèi)化合物（1～7），其中化合物1為新穎結(jié)構(gòu)的倍半萜，且具有一定的腫瘤細(xì)胞毒活性，進(jìn)一步豐富了海洋真菌木霉次級(jí)代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的多樣性，并為抗腫瘤先導(dǎo)化合物的研究提供了參考和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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A new sesquiterpenoid from, a marine sponge symbioticsp. fungus

ZHANG Lu1, 2, LIU Chen-peng1, WANG Rui-qi1, JIAO Wei-hua2, ZHANG Xiao-po1

1. School of Pharmaceutical Science, Hainan Medical University, Haikou 571199, China 2. State Key Laboratory of Oncogenes and Related Genes, Department of Pharmacy, Research Center for Marine Drugs, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200127, China

To study the secondary metabolites of a marine sponge symbiotic fungusCMB-TN16 and their antitumor cytotoxic activity.The compounds were isolated and purified from EtOAc extract of CMB-TN16 by modern chromatography techniques, such as silica gel column chromatography, and semi-preparative high performance liquid chromatography, and their chemical structures were identified by NMR and MS spectrometry. Meanwhile, the antitumor cytotoxic activity of these compounds was evaluated by MTT method.Seven sesquiterpenoids were isolated from the EtOAc extract of CMB-TN16, and identified as divirensol H (1), divirensol D (2), divirensol G (3), gliocladic acid (4), hydroheptelidic acid (5), 3--acetylheptelidic acid A (6) and xylaric acid D (7), respectively. The IC50values of compound 1 against NCI-H460, NCI-H929 and SW620 were 11.8, 7.7, and 13.5 μmol/L, respectively.Compound 1 is a new compound, and have exhibited moderate cytotoxic activities against three tumor cell lines.

marine sponge;; sesquiterpenoid; antitumor; cytotoxic activity; divirensol H; 3--acetylheptelidic acid A

R284.1

A

0253 - 2670(2023)18- 5840 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.18.002

2023-05-14

海南省科技重大專(zhuān)項(xiàng)（ZDKJ2021036）

張 璐，女，碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)研究。Tel: (0898)66893826 E-mail: 714091691@qq.com

張小坡，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向?yàn)樘烊凰幬锘瘜W(xué)。Tel: (0898)66893826 E-mail: z_xp1412@163.com

[責(zé)任編輯 王文倩]