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        TMEM64在肝癌組織中高表達(dá)并促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲

        2023-09-13 10:49:08曹丹萍蔡娟李艷娜董潤(rùn)雨王智雄左學(xué)良
        關(guān)鍵詞:肝癌腫瘤水平

        曹丹萍,蔡娟,李艷娜,董潤(rùn)雨,王智雄,左學(xué)良

        皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院//弋磯山醫(yī)院1胃腸外科,2腫瘤內(nèi)科,安徽 蕪湖241001

        肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第6和死亡率第3的惡性腫瘤,我國(guó)更是肝癌的高發(fā)地區(qū)[1,2]。根據(jù)2022年我國(guó)癌癥中心的最新數(shù)據(jù),肝癌在惡性腫瘤中的發(fā)病率位于第5,死亡率位于第2,5年生存率僅為14.1%[3]。大多數(shù)肝癌患者早期無癥狀,確診時(shí)已處于中晚期,失去最佳手術(shù)機(jī)會(huì)[4,5]。肝癌患者手術(shù)后復(fù)發(fā)率仍然較高,預(yù)后極差[6]。挖掘新的診斷標(biāo)志物和預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)對(duì)肝癌患者早期發(fā)現(xiàn),制定個(gè)體化治療方案具有重要臨床研究?jī)r(jià)值。

        跨膜蛋白(TMEMs)是一類能夠多次跨越細(xì)胞膜并參與調(diào)控細(xì)胞間信號(hào)交流和傳遞的蛋白家族,人類的許多疾病的發(fā)生和進(jìn)展都與跨膜蛋白的功能異常有關(guān)[7]。目前,已發(fā)現(xiàn)較多的TMEMs在惡性腫瘤中表達(dá)失調(diào)[8-10],參與調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)通路[11-13]。TMEM64是一個(gè)位于8號(hào)染色體上的編碼基因,屬于跨膜蛋白家族的成員。目前對(duì)于TMEM64的研究較少,TMEM64在肝癌中的功能未見報(bào)道,有待進(jìn)一步探索。

        本研究通過分析癌癥基因組圖譜(TCGA)和基因型組織表達(dá)項(xiàng)目(GTEx)數(shù)據(jù)庫(kù)中TMEM64在肝癌中的表達(dá)情況和預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值,探究TMEM64對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響,為肝癌治療提供新的分子靶標(biāo)。

        1 材料和方法

        1.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析

        從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(n=377)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中收集了肝癌患者的mRNA 表達(dá)譜和臨床數(shù)據(jù)。3 級(jí)HTSeq FPKM 格式數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化為每百萬次讀取的轉(zhuǎn)錄本(TPM)。使用UCSC Xena3數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得TPM格式的RNA測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

        使用Kaplan-Meier曲線和log-rank檢驗(yàn)來比較患者生存差異,并將截止值設(shè)置為TMEM64的中位表達(dá)水平。單變量和多變量Cox回歸分析用于評(píng)估臨床變量對(duì)患者結(jié)局的影響。單變量Cox回歸分析中的預(yù)后變量P<0.05被納入多變量Cox分析。

        R軟件包DESeq2用于分析和計(jì)算差異表達(dá)基因(DEGs),并將調(diào)整后的P值設(shè)置為<0.05,|log2倍變化(FC)|>1作為DEG的閾值。使用Spearman相關(guān)分析評(píng)估前10位DEGs表達(dá)與TMEM64之間的相關(guān)性。

        使用R包GOplot和R包c(diǎn)lusterProfiler 對(duì)DEGs進(jìn)行了功能富集分析,包括GO、KEGG通路富集分析和GSEA基因集富集分析,調(diào)整后的P<0.05和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.25被視為統(tǒng)計(jì)上顯著富集的功能或通路。

        R軟件包rms用于構(gòu)建nomogram和calibration曲線。通過Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型評(píng)估肝癌患者總生存時(shí)間(OS)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)合TMEM64 的表達(dá)水平與多因素Cox 回歸模型中的臨床變量,構(gòu)建nomogram來預(yù)測(cè)1年、3年和5年的肝癌患者總生存率,使用calibration曲線評(píng)估列線圖的效能。

        1.2 實(shí)驗(yàn)材料

        1.2.1 組織樣本 組織標(biāo)本來自2021年3月~2022年3月在我院行肝癌切除術(shù)的患者的腫瘤組織及鄰近正常組織共20例。本研究患者納入標(biāo)準(zhǔn):術(shù)后病理確診為肝細(xì)胞癌;術(shù)前均未接受放療、化療、靶向或免疫治療,所有患者均已簽署知情同意書。本研究經(jīng)皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(弋磯山醫(yī)院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021倫審研12號(hào))。

        1.2.2 細(xì)胞和試劑 正常肝細(xì)胞QSG-7701和肝癌細(xì)胞株Hep3B、SMMC-7721、HCCLM3、Huh7 來自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞資源中心??俁NA提取試劑TRIzol和轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM3000(Invitrogen),RT-qPCR試劑盒來(北京天根生化科技有限公司)。Transwell小室和實(shí)驗(yàn)中使用的6 孔板、96 孔板均(Corning),基質(zhì)膠(BD)。Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒(上海貝博生物有限公司),5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)試劑盒則(廣州銳博生物科技有限公司)。TMEM64 的siRNA和過表達(dá)TMEM64 的質(zhì)粒委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)構(gòu)建,其中敲低TMEM64的siRNA序列為:si-TMEM64#1:5'-GCUAUUGUAGCUUGU GAAATT-3',si-TMEM64#2:5'-CCUACCCAGCUUC UGAAUUTT-3'。Western blot實(shí)驗(yàn)中主要的試劑如下:BCA 試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、TMEM64 抗 體(Abcam)、β-tubulin(Cell Signaling Technology)以及超敏ECL發(fā)光液(Abbkine)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 細(xì)胞使用含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基(含100 U/mL青霉素,100 μg/mL鏈霉素),置于恒溫培養(yǎng)箱(37 ℃,5%CO2)中培育。待細(xì)胞密度達(dá)到60%~70%,按照LipofectamineTM3000說明書步驟,將siRNAs 分別轉(zhuǎn)染至HCCLM3中,并分組為si-NC(對(duì)照組)、si-TMEM64#1(敲低組1)和si-TMEM64#2(敲低組2);將空質(zhì)粒載體和過表達(dá)TMEM64質(zhì)粒載體分別轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞中,并分組為vector(對(duì)照組)和TMEM64(過表達(dá)組)。轉(zhuǎn)染48 h后,分別使用RT-qPCR和Western blot 驗(yàn)證TMEM64敲低和過表達(dá)的效率,以及進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

        1.3.2 RT-qPCR 采用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA,接著使用FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑合成cDNA,采用SuperReal熒光定量預(yù)混試劑將合成的cDNA在ABI QuantStudio3系統(tǒng)(Applied Biosystems)上進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增,使用2-ΔΔct定量方法計(jì)算TMEM64與內(nèi)參GAPDH的相對(duì)表達(dá)量。其中TMEM64 的引物序列如下:Forward primer:5'-GGCGTGGCTGAGGTGAGAAA-3';Reverse primer:5'-ATGAAGCCCACGACGAAGAG-3'。GAPDH的引物序列為:Forward primer:5'-AATCCCATCACCATC TTCC-3';Reverse primer:5'-CATCACGCCACAGTT TCC-3'。

        1.3.3 CCK-8 消化并離心轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞,按照2×103/孔種于96孔板中,并于第24、48、72和96 h使用酶標(biāo)儀檢測(cè)其在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。在每次檢測(cè)前2 h在每孔中加入10 μL的CCK-8試劑,避光置于培育箱中。最后計(jì)算不同時(shí)間段細(xì)胞的增殖水平。

        1.3.4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染48 h后的每組細(xì)胞按照2×103/孔均勻種植于新的6孔板中,置于培養(yǎng)箱中培育12 d。收集細(xì)胞時(shí)使用4%多聚甲醛固定30 min,0.1%結(jié)晶紫染色1 h,最后拍照并統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞增殖的水平。

        1.3.5 EdU實(shí)驗(yàn) 使用銳博生物的EdU試劑盒來檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力。將轉(zhuǎn)染48 h后的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞按照6000/孔均勻種于96孔板中,加入試劑A孵育2 h后,將細(xì)胞固定在4%多聚甲醛中,用Apollo染色液染色30 min,之后用Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行30 min染色。最后在熒光顯微鏡(200×)下對(duì)增殖的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行拍照和計(jì)數(shù)。

        1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)需提前將Transwell小室的上室中均勻鋪入50μL的基質(zhì)膠,將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞重懸于無血清培養(yǎng)基中,重新計(jì)數(shù),按照5×104/孔細(xì)胞移植到小室的上室,下室中則加入600μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育24 h,用含4%多聚甲醛固定,0.1%結(jié)晶紫染色1 h。最后在倒置顯微鏡下拍照、統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞遷移的百分比。細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)則不需鋪基質(zhì)膠,其他步驟同細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)。

        1.3.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染24 h后的每組細(xì)胞按照一定密度均勻鋪入6孔板中(以過夜后貼壁細(xì)胞密度達(dá)80%左右為宜),第2天使用黃色槍頭在六孔板中劃出一條直線,PBS清洗后置于電子顯微鏡下拍照記錄0 h劃痕的面積。將六孔板中加入2 mL無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培育,48 h后再次在倒置顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合的面積,分析計(jì)算愈合面積的比率并評(píng)估兩組細(xì)胞的遷移能力。

        1.3.8 Western blot實(shí)驗(yàn) 從分組處理后細(xì)胞中裂解并提取總蛋白,采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度,加入適量的上樣緩沖液煮沸10 min。每組樣本取等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳,并濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉2 h后,在4 ℃下將PVDF膜與按比例稀釋的一抗孵育過夜。TBST沖洗3次,繼續(xù)將PVDF膜與二抗在室溫下孵育2 h,最后使用超敏ECL顯色液進(jìn)行曝光和顯色。

        1.3.9 免疫熒光實(shí)驗(yàn) 采用冰凍切片進(jìn)行雙標(biāo)法免疫熒光實(shí)驗(yàn)。將肝癌組織冰凍切片取出后室溫晾干15 min,PBS洗3次,每次5min。使用3%BSA室溫封閉1 h,然后加入TMEM64和CD8(Abcam)一抗4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次,10 min/次,分別加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗室溫孵育1 h。細(xì)胞核利用DAPI染色。滴加抗熒光淬滅劑封片后在激光共聚焦顯微鏡下拍照。

        1.3.10 CD8+T細(xì)胞檢測(cè)分析 將新鮮提取的人外周血單個(gè)核淋巴細(xì)胞(PBMC)活化后重新計(jì)數(shù),并與轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞及其對(duì)照組細(xì)胞按照10∶1的比例共培養(yǎng)。收集細(xì)胞后用不同通道熒光標(biāo)記的CD45、CD3和CD8抗體(BioLegend)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,并在室溫下與細(xì)胞一起孵育1 h。通過流式細(xì)胞術(shù)分析CD8+T淋巴細(xì)胞比例。

        1.3.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間計(jì)數(shù)結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行分析評(píng)估,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 TMEM64在肝癌和肝癌細(xì)胞系中的表達(dá)水平

        基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù),分析了TMEM64在泛癌中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)TMEM64在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)高表達(dá)(P<0.001,圖1A)。此外,TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平在非配對(duì)樣本和配對(duì)樣本中均顯著高于鄰近的癌旁組織(P<0.001,圖1B、C)。受試者工作特征曲線(ROC)表明TMEM64具有良好的肝癌診斷價(jià)值,ROC曲線下的區(qū)域(AUC)為0.723(95%CI=0.672-0.773,圖1D)。RT-qPCR結(jié)果表明,TMEM64在肝癌細(xì)胞系中表達(dá)水平也顯著高于正常肝細(xì)胞系(P<0.01,圖1E)。

        2.2 Kaplan-Meier分析評(píng)估肝癌患者TMEM64的表達(dá)與預(yù)后的價(jià)值

        根據(jù)TMEM64 表達(dá)的中位數(shù),肝癌患者被分為TMEM64高表達(dá)組(n=187)和低表達(dá)組(n=186)。如圖2A示,與TMEM64低表達(dá)組相比,TMEM64高表達(dá)組患者OS 較差(OS:危險(xiǎn)比[HR]=1.58,95%CI=1.11-2.25,P=0.011)。多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析表明,TMEM64的表達(dá)水平是肝癌患者總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OS:危險(xiǎn)比[HR]=1.693,95%CI=1.087-2.638,P=0.02,圖2B,表1)。

        表1 肝癌患者總生存期的單因素和多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析Tab.1 Univariate and multivariate analyses of overall survival in patients with Hepatocellular Carcinoma

        圖2 Kaplan-Meier方法評(píng)估肝癌患者TMEM64表達(dá)的預(yù)后價(jià)值Fig. 2 Prognostic value of TMEM64 expression in patients with HCC assessed with the Kaplan-Meier method.A:Overall survival(OS)of patients with high-and low-expression of TMEM64 in HCC.B:Forest map of OS based on multivariate Cox analysis.

        2.3 Kaplan-Meier 方法評(píng)估不同亞組肝癌患者中TMEM64表達(dá)水平的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值

        與TMEM64低表達(dá)相比,TMEM64高表達(dá)肝癌患者預(yù)后在T1~T3、N0、M0、I~I(xiàn)II期、G1~G3、BMI>25kg/m2、年齡>60歲、體質(zhì)量>70 kg以及男性亞組中明顯更差(P<0.05,圖3)。

        圖3 Kaplan-Meier方法評(píng)估肝癌患者不同亞組中TMEM64表達(dá)的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值Fig. 3 OS curves of TMEM64 expression levels in different subgroups of liver cancer patients.A-I: OS survival curves of T stage,N stage,M stage,Pathologic stage,Histologic grade,BMI>25 kg/m2,Age>60 years,Weight>70 kg,and Gender subgroups between high-and low-TMEM64 patients with HCC.

        2.4 TMEM64表達(dá)水平與肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性

        TMEM64 高表達(dá)組中肝癌組織中的NK 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞和pDCs 的富集分?jǐn)?shù)明顯低于TMEM64低表達(dá)組(圖4A~C)。TMEM64 的表達(dá)與NK 細(xì)胞(r=-0.138,P=0.007)、CD8+T細(xì)胞(r=-0.114,P=0.027)和pDCs(r=-0.321,P<0.001)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平呈負(fù)相關(guān)(圖4D~F)。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與TMEM64低表達(dá)的肝癌組織相比,TMEM64高表達(dá)的肝癌組織中CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)水平顯著降低(圖4G)。

        圖4 TMEM64的表達(dá)與肝癌組織中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平的相關(guān)性Fig. 4 Correlation of TMEM64 expression with immune infiltration level in HCC. A-C: Comparison of immune cell infiltration levels between high-and low-TMEM64 groups.D-F:Correlation between the relative enrichment of immune cells(NK cells,CD8+T cells and pDCs cells)and TMEM64 expression.G:Double-labeled immunofluorescence results indicate that the number of infiltrating CD8+T cells is decreased in HCC tissues with high expression of TMEM64.*P<0.05,**P<0.05,***P<0.001 vs low TMEM64 expression group.

        2.5 TMEM64相關(guān)的差異表達(dá)基因功能富集分析

        比較TMEM64高表達(dá)組和低表達(dá)組的相關(guān)差異基因表達(dá)情況(圖5A),前10 個(gè)DEGs 為HS3ST4、MAGEA4、AC016717.2、ANKFN1、CYP11B2、SH3GL3、AC062015.1、PPDPFL、CCR3 和ISM2(圖5B)。GO富集分析顯示,DEGs顯著富集的生物過程包括化學(xué)突觸傳遞的調(diào)控、信號(hào)釋放、受體配體活動(dòng)和經(jīng)突觸信號(hào)傳遞的調(diào)節(jié)等(圖5C)。KEGG通路富集分析表明,DEGs顯著富集的途徑包括神經(jīng)活性配體與受體的相互作用、Wnt信號(hào)通路和MAPK信號(hào)通路(圖5D)。GSEA 富集分析發(fā)現(xiàn)高TMEM64 表達(dá)組中Wnt/βcatenin、JAK/STAT3、KRAS和P53信號(hào)通路被顯著富集(圖5E)。

        圖5 TMEM64相關(guān)的差異表達(dá)基因及功能富集分析Fig. 5 TMEM64-related differentially expressed genes (DEGs) and functional enrichment analysis of TMEM64 in HCC. A: Volcano map of the DEGs. B: Heat map of the correlation between TMEM64 expression and the top 10 differential genes.C-D:GO enrichment analysis and KEGG enrichment analysis of the DEGs.E:Gene set enrichment analysis(GSEA)of the DEGs.

        2.6 構(gòu)建和驗(yàn)證基于TMEM64 表達(dá)的nomogram 和calibration曲線

        根據(jù)多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析中有關(guān)的臨床變量(TMEM64的表達(dá)水平和T分期),生成了基于OS獨(dú)立因素的Nomogram來預(yù)測(cè)患者1年、3年和5年的預(yù)后情況。在Nomogram中,總點(diǎn)數(shù)越高,預(yù)后越差(圖6A)。Nomogram的自舉校正C指數(shù)為0.644(95%CI=0.618-0.67),該模型對(duì)肝癌患者的OS具有中等的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性,其中患者5年OS的模型準(zhǔn)確性和一致性預(yù)測(cè)效能較好(圖6B~D)。

        圖6 預(yù)測(cè)肝癌患者1年、3年和5年總生存率的nomogram和calibration曲線Fig. 6 Nomogram and calibration curves for predicting OS at 1,3 and 5 years in patients with HCC.A:A nomogram for predicting 1-,3-and 5-year OS of HCC patients.B-D:Calibration curves for 1-,3-and 5-year nomogram predictions.

        2.7 敲低TMEM64能抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖和侵襲

        利用siRNA在TMEM64表達(dá)相對(duì)較高的肝癌細(xì)胞HCCLM3 中敲低TMEM64,使用RT-qPCR 和Western blots 驗(yàn)證si-TMEM64#1 和si-TMEM64#2 的敲低效率(圖7A、B)。細(xì)胞克隆形成、CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,敲低TMEM64能明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖(圖7C-E)。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,si-TMEM64#1 和si-TMEM64#2 組 中HCCLM3細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著降低(圖7F、G)。將轉(zhuǎn)染后的HCCLM3細(xì)胞與活化的PBMC共培養(yǎng),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD8+T 細(xì)胞比例,結(jié)果顯示敲低TMEM64的肝癌細(xì)胞中浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞比例增加(圖7H)。

        圖7 敲低TMEM64能抑制肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲Fig. 7 TMEM64 knockdown inhibits proliferation and invasion of HCC cells.A,B:RT-qPCR and Western blotting for detecting TMEM64 expression levels in HCCLM3 cells transfected with si-TMEM64#1 and si-TMEM64#2.C,D:Colony formation assay and CCK-8 assay for assessing the effect of TMEM64 knockdown on HCCLM3 cell proliferation.E:EdU assay for assessing the effect of TMEM64 knockdown on proliferation of HCCLM3 cells (×200). F, G: Migration and invasion of HCCLM3 cells with TMEM64 knockdown assessed by Transwell assay and wound healing assay (×200). H: Flow cytometry for detecting the proportion of infiltrated CD8+T cells in PBMC co-cultured with transfected HCCLM3 cells.**P<0.01,***P<0.001.

        2.8 過表達(dá)TMEM64能促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖和侵襲

        在TMEM64表達(dá)相對(duì)較低的肝癌細(xì)胞Huh7中過表達(dá)TMEM64。與對(duì)照組相比,轉(zhuǎn)染TMEM64的過表達(dá)質(zhì)粒后,Huh7細(xì)胞中TMEM64的表達(dá)水平顯著增高(圖8A、B);CCK-8、細(xì)胞克隆形成和EdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,過表達(dá)TMEM64能顯著促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖(圖8C~E)。細(xì)胞劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn)顯示,與對(duì)照組相比,過表達(dá)TMEM64組中Huh7細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)(圖8F、G)。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,將轉(zhuǎn)染后的Huh7細(xì)胞與活化的PBMC共培養(yǎng),過表達(dá)TMEM64組的肝癌細(xì)胞中浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞比例減少(圖8H)。

        圖8 過表達(dá)TMEM64能促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和侵襲Fig. 8 TMEM64 overexpression promotes proliferation and invasion of HCC cells.A, B: RT-qRCR and western blotting for verifying TMEM64 overexpression in Huh7 cells.C,D:Colony formation assay and CCK-8 assay for measuring the effect of TMEM64 overexpression on Huh7 cell proliferation. E: EdU assay for verifying the effect of TMEM64 overexpression on Huh7 cell proliferation (× 200). F, G: Wound healing assay and Transwell assay for evaluating migration and invasion of Huh7 cells with TMEM64 overexpression(×200;scale bar=200 μm). H: Flow cytometry for detecting the proportion of infiltrated CD8+T cells in PBMC cocultured with transfected Huh7 cells.**P<0.01,***P<0.001.

        3 討論

        TMEMs的表達(dá)失調(diào)與腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移[14]及預(yù)后[15]密切相關(guān),在肝癌中TMEM106C被發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中高表達(dá),可作為肝癌預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)[16]。有研究報(bào)道TMEM64可以通過調(diào)節(jié)Wnt3a的分泌調(diào)控前列腺癌的進(jìn)展[17]。TMEM64是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的七次跨膜蛋白,本研究中首次證實(shí)TMEM64是肝癌的潛在預(yù)后指標(biāo)。

        本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)分析了TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)TMEM64在肝癌中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織,并且高表達(dá)的TMEM64與肝癌患者不良總生存時(shí)間相關(guān)。進(jìn)一步通過Cox回歸分析發(fā)現(xiàn)TMEM64的表達(dá)水平是肝癌患者總生存率的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。我們得出新的結(jié)論,TMEM64可能是肝癌不良預(yù)后和臨床轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)的指標(biāo)。近年來,列線圖在惡性腫瘤患者的風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)后預(yù)測(cè)中應(yīng)用較廣泛[18,19]。Nomogram圖可使用現(xiàn)有的臨床信息,將復(fù)雜的回歸分析結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)橹庇^的可視化圖形[18,20]。為了更準(zhǔn)確、更科學(xué)的計(jì)算肝癌患者的總體生存概率,本研究構(gòu)建了基于OS獨(dú)立因素列線圖預(yù)后模型來預(yù)測(cè)患者1年、3年和5年的預(yù)后情況,更直觀的展示了肝癌患者的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)。本研究中的校準(zhǔn)曲線也表明:預(yù)測(cè)模型與實(shí)際結(jié)果相符,其中患者5年的預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)最接近實(shí)際結(jié)果。

        腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)被浸潤(rùn)免疫細(xì)胞包圍的復(fù)雜微環(huán)境中[21],腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值已在實(shí)體惡性腫瘤中得到證實(shí)[22,23]。浸潤(rùn)免疫細(xì)胞也被證明可以預(yù)測(cè)對(duì)新輔助化療和免疫檢查點(diǎn)抑制(ICI)治療的反應(yīng)[24,25]。因此,篩查肝癌浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞可輔助ICI治療,并對(duì)ICI治療有潛在的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究通過GSEA富集分析評(píng)估免疫細(xì)胞在肝癌中的相對(duì)富集分?jǐn)?shù),并研究TMEM64的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)水平之間的相關(guān)性,結(jié)果顯示,TMEM64高表達(dá)與NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、和pDCs的浸潤(rùn)呈負(fù)相關(guān)。有研究報(bào)道,TMEM205與CD8+T的浸潤(rùn)呈正相關(guān),并通過降低免疫抑制細(xì)胞水平和促進(jìn)細(xì)胞毒性T細(xì)胞向腫瘤微環(huán)境的浸潤(rùn)來改善肝癌患者的預(yù)后[9]。TMEM60的異常高表達(dá)影響了巨噬細(xì)胞、Tregs等免疫細(xì)胞的分布,增加了腫瘤的異質(zhì)性,促進(jìn)了腫瘤對(duì)治療的抵抗,導(dǎo)致患者預(yù)后不良[26]。CD8+T細(xì)胞通常被認(rèn)為是抗腫瘤免疫的主要介質(zhì)[21]。CD8+T細(xì)胞在活化后通常會(huì)分化為細(xì)胞毒性T細(xì)胞滲透到腫瘤核心或侵襲部位,在殺傷癌細(xì)胞中起重要作用。作為天然免疫效應(yīng)細(xì)胞,激活的pDCs和NK細(xì)胞都被證明可以阻止肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[27]。本研究中采用雙標(biāo)記免疫熒光法驗(yàn)證肝癌組織中TMEM64的表達(dá)與CD8+T細(xì)胞浸潤(rùn)關(guān)系,發(fā)現(xiàn)TMEM64高表達(dá)的肝癌組織中CD8+T細(xì)胞腫瘤浸潤(rùn)水平顯著降低。流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明,將轉(zhuǎn)染后的Huh7 細(xì)胞與活化的PBMC 共培養(yǎng),過表達(dá)TMEM64組的肝癌細(xì)胞中浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞比例減少。這些結(jié)果表明,TMEM64的過度表達(dá)可能通過調(diào)節(jié)浸潤(rùn)性T細(xì)胞的水平來影響肝癌的進(jìn)展和預(yù)后。

        Sébastien等[28]闡述TMEM家族的蛋白是癌細(xì)胞傳播的潛在貢獻(xiàn)者,強(qiáng)調(diào)了TMEMs在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中的影響。Shen等[29]發(fā)現(xiàn),敲低TMEM45B通過JAK2/STAT3途徑抑制胃癌細(xì)胞的增殖,遷移和侵襲。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn),TMEM116可通過PDK1/AKT/FOXO3A信號(hào)通路促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖和腫瘤的轉(zhuǎn)移。Chen等[31]發(fā)現(xiàn),TMEM196通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和進(jìn)展。TMEMs已被證實(shí)參與多種調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路,而TMEM64在肝癌中的潛在機(jī)制暫無相關(guān)研究,針對(duì)TMEM64可能參與調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的信號(hào)通路,本研究中進(jìn)行KEGG和GSEA富集分析發(fā)現(xiàn)高TMEM64 表達(dá)組中Wnt/β-catenin、JAK/STAT3、KRAS和P53信號(hào)通路被顯著富集,這些結(jié)果我們將在后續(xù)研究中進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。為了進(jìn)一步探究TMEM64在肝癌細(xì)胞中是否具有生物學(xué)功能,本研究首次從細(xì)胞學(xué)水平探究TMEM64對(duì)肝癌細(xì)胞的生物學(xué)特性的影響,發(fā)現(xiàn)敲低TMEM64 能明顯抑制HCCLM3細(xì)胞的增殖和侵襲;而過表達(dá)TMEM64可促進(jìn)Huh7細(xì)胞的增殖和侵襲。本研究通過生物信息學(xué)分析和體外實(shí)驗(yàn)對(duì)TMEM64在肝癌的表達(dá)水平、預(yù)后及生物學(xué)功能進(jìn)行研究,在后續(xù)研究中我們將深入探索其調(diào)控肝癌進(jìn)展的分子機(jī)制。

        綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)TMEM64在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高,且其高表達(dá)水平與患者不良預(yù)后相關(guān)。TMEM64能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和侵襲,可能參與調(diào)控肝癌的惡性進(jìn)展,有望成為肝癌診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

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