楊海燕 黃云霞 文靜

（1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，四川 南充 637000；2. 川北醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 南充 637000）

非酒精性脂肪性肝?。∟on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是全球范圍內(nèi)最為常見的肝臟疾病之一，患病率約為25%，發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜且認(rèn)知有限，因而尚無針對NAFLD 有效的治療方法[1-2].。根據(jù)其組織學(xué)的不同，NAFLD 可分為非酒精性單純性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver，NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）兩種，前者僅存在肝細(xì)胞變形而無明顯的肝細(xì)胞損傷，通常注意飲食可得到改善；而后者為NAFLD 的嚴(yán)重病理類型之一，易演變?yōu)橥砥诟斡不⒏卫w維化、肝癌等惡性肝病，造成不可逆后果[3-5]。因此，尋找針對NASH 治療的有效藥物、探究其作用機(jī)制對該病的臨床治療及科學(xué)研究均具有十分重要的意義?；⒄葹檗た浦参锘⒄萈olygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.的干燥根莖和根，有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功（2020 版《中華人民共和國藥典》（一部））?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，虎杖具有抗炎、抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、改善微循環(huán)、肝保護(hù)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、神經(jīng)保護(hù)、血管新生等生物活性[6-7]，可改善酒精性脂肪肝[8]、非酒精性脂肪肝[9]、肝臟缺血再灌注損傷[10]等引起的肝損傷，發(fā)揮一定的保肝作用。但有關(guān)虎杖對非酒精性脂肪性肝炎的報道較少，且多為復(fù)方研究，對其作用機(jī)制更是知之甚少。

由于虎杖具有多成分、多靶點、多通路的特點，為探究其對NASH 的保護(hù)作用，此研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)預(yù)測虎杖治療NASH 的主要活性成分及潛在靶點，探究其主要作用機(jī)制，為臨床虎杖治療NASH 提供一定的參考，并為NASH 的治療提供一定的新想法及新思路。

1 材料與方法

1.1 虎杖活性成分及靶點的獲取

借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw. com/tcmsp.php），以O(shè)B＞30%，DL＞0.18 為篩選條件獲取虎杖的活性成分，并以各活性成分CAS 號于Pubmed compound 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）下載其2D 結(jié)構(gòu)式，保存為sdf 格式，將其結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入 Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫（http://www.lilabecust.cn/pharmmapper/）獲得各活性成分的作用靶點，將其靶點通過 Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）標(biāo)準(zhǔn)化為Gene Symbol 格式，篩除重復(fù)項后得到虎杖活性成分作用靶點。

1.2 非酒精性脂肪性肝炎靶點的獲取

以“NASH”、“non-alcoholic steatohepatitis”為關(guān)鍵詞于Genecards（https://www.genecards.org/）、Disgenet（https://www.disgenet.org）、OMⅠM（https://www.omim.org）等數(shù)據(jù)庫下載相關(guān)靶點，篩除重復(fù)項后獲得NASH 相關(guān)靶點。

1.3 韋恩圖及成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

分別將獲得的虎杖活性成分作用靶點與NASH 相關(guān)靶點導(dǎo)入微生信在線制圖平臺（www.bioinformatics.com.cn）繪制韋恩圖，獲取二者交集靶點；并通過Cytoscape 3.9.1 軟件構(gòu)建成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測虎杖治療NASH 的主要活性成分。

1.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（Protein-protein interaction，PPⅠ）建立的繪制及核心靶點的獲取

將虎杖活性成分與NASH 的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）蛋白種屬選擇“Homo sapiens” ， 設(shè)定“minimum required interaction score”的“medium confidence=0.9”，獲得PPⅠ網(wǎng)絡(luò)圖，將該網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)入Cytoscape 3.9.1 軟件進(jìn)行美化并借助Cytohubba 插件獲取“Top 10”核心靶點，預(yù)測虎杖治療NASH 的關(guān)鍵靶點。

1.5 基因本體（Gene ontology，GO）功能富集分析及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導(dǎo)入Metascape 平臺（https:// metascape. org/gp/ index.htmL#/main/step1）進(jìn)行GO 及KEGG 富集分析，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍，篩選排名前15 的生物功能及通路過程，通過微生信在線繪圖平臺（www.bioinformatics.com.cn）將結(jié)果可視化。

1.6 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將虎杖作用于NASH 潛在靶點數(shù)據(jù)通過Cytoscape 3.9.1 繪制靶點通路網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 虎杖主要活性成分作用靶點

通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫以O(shè)B＞30%，DL＞0.18為篩選條件，獲得虎杖10 個主要活性成分，將其結(jié)構(gòu)式導(dǎo)入Pharmmapper 數(shù)據(jù)庫獲得各活性成分作用靶點，篩除重復(fù)項后得到虎杖主要活性成分作用靶點436 個。

2.2 NASH 相關(guān)作用靶點

通過Genecards、Disgenet、OMⅠM 數(shù)據(jù)庫下載NASH 相關(guān)作用靶點，刪除重復(fù)項后得到3944個NASH 相關(guān)靶點。

2.3 韋恩圖及成分-靶點網(wǎng)絡(luò)得構(gòu)建

將虎杖主要活性成分靶點及NASH 相關(guān)作用靶點導(dǎo)入微生信在線制圖平臺繪制韋恩圖，獲得二者交集靶點81 個，見圖1，表明虎杖可能通過此81 個靶點作用于NASH 發(fā)揮治療作用。并借助Cytoscape3.9.1 軟件將10 個活性成分及81 個潛在作用靶點繪制成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖，如圖2所示。按照度值（表1）對活性成分進(jìn)行排序，篩選出靠前的主要活性成分為 6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine，分別可與67、65、63 個靶點發(fā)生作用，表明此三者為虎杖作用于NASH 的主要活性成分。

表1 虎杖主要活性成分及度值

圖1 虎杖治療NASH 交集靶點的韋恩圖

圖2 成分-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPⅠ網(wǎng)絡(luò)圖及核心靶點

將虎杖-NASH 交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫設(shè)置“medium confidence=0.9”獲得PPⅠ網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)圖包含81 個節(jié)點，134 條邊，通過Cytoscape 3.9.1軟件對該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行美化，如圖3 所示。借助Cytohubba 插件獲取“Top 10”核心靶點，如表2、圖4 所示，該結(jié)果表明，虎杖主要通過作用于SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 等關(guān)鍵蛋白發(fā)揮對NASH 的治療作用。

表2 核心靶點度值及介度中心數(shù)

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 “Top 10”核心靶點網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO 及KEGG 富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導(dǎo)入Metascape 平臺，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍進(jìn)行GO 功能注釋，得到生物過程（Biological process，BP）條目1092 個、細(xì)胞組分（Cellular component，CC）條目49 個、分子功能（Molecular function，MF）條目98 個。將p 值前15 的條目通過微生信在線制圖平臺進(jìn)行可視化，如圖5 所示。結(jié)果表明，虎杖治療NASH 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)（Cellular response to lipid）、激素反應(yīng)（Response to hormone）、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物過程；受體復(fù)合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（Membrane microdomain）等細(xì)胞組分；核受體活性（Nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。

圖5 GO 功能富集分析

將虎杖作用于 NASH 潛在靶點導(dǎo)入Metascape 平臺，限定物種類型為“Homo sapiens”，以min overlap=3、P≤0.05、min enrichment=1.5 為篩選范圍進(jìn)行KEGG 富集分析，富集到130 條信號通路。按P 值大小將前15 條通路借助微生信在線制圖平臺進(jìn)行可視化，如圖6 所示。結(jié)果提示虎杖可能通過調(diào)節(jié)癌癥通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信號通路、化學(xué)致癌作用-受體激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌癥中的應(yīng)用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信號通路發(fā)揮對NASH 的治療作用。

圖6 KEGG 富集分析

2.6 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.9.1 軟件繪制靶點-通路網(wǎng)絡(luò)，如圖7 所示。按度值大小排序，發(fā)現(xiàn)AKT、EGFR、GRB2、ⅠGF1R、SRC、ⅠGF1、MDM2、MET、RAC1、MMP9 等靶點與主要調(diào)節(jié)信號通路關(guān)系較為密切，表明這些靶點可能在虎杖治療NASH 過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

圖7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)

3 討論

NASH 為NFALD 進(jìn)展為肝硬化、肝纖維化、肝癌的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)，主要表現(xiàn)為肝脂肪變、肝細(xì)胞損傷、炎癥、纖維化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙等，治療主要針對糖脂代謝紊亂、炎癥、細(xì)胞凋亡、纖維化、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)腸道菌群等[11-12]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)虎杖及其復(fù)方可以發(fā)揮抗炎、抗氧化、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等藥理活性改善肝臟疾病損傷[7,13-14]，但對NASH 的研究較少，且機(jī)制尚不明確。

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)探究虎杖治療NASH 的潛在靶點及作用機(jī)制，篩選得到虎杖主要活性成分10 個、活性成分作用靶點436 個、NASH 疾病靶點3944 個，二者交集靶點81 個。通過構(gòu)建成分靶點網(wǎng)絡(luò)、PPⅠ網(wǎng)絡(luò)、GO、KEGG富集分析分析有關(guān)成分、靶點、作用途徑、通路之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone 、luteolin、Physovenine 可能為虎杖改善NASH 的主要活性成分。6,8-Dihydroxy-7-methoxyxanthone、luteolin 均為黃酮類化合物，現(xiàn)代研究表明，黃酮類化合物可通過抗炎、抗氧化、抗凋亡、抑制細(xì)胞外基質(zhì)、的異常堆積、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等作用改善肝纖維化、酒精性肝病所致肝細(xì)胞損傷從而發(fā)揮保肝作用[15-17]。PPⅠ拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R 可能為虎杖改善NASH 的潛在靶點。

非受體酪氨酸激酶SRC 在腫瘤的存活、增殖、遷移過程中扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)抑制SRC 表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，對肝癌的發(fā)生有一定的改善作用[18-19]；RXRA、RXRB 均屬維甲酸受體家族蛋白，研究表明RXRA 在肝臟中大量表達(dá)，可通過調(diào)控其表達(dá)發(fā)揮抗炎、調(diào)節(jié)代謝、抗凋亡等改善肝纖維化[20-21]；GRB2 在腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展過程中異常表達(dá)，實驗證實抑制GRB2 的表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞侵襲及增殖[22-23]；AKT1 與細(xì)胞增長、凋亡等密切相關(guān)，在肝癌的發(fā)生過程中具有重要的意義，抑制其表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖并促使其凋亡[24]；同樣的，ESR1 的表達(dá)也與肝癌細(xì)胞增殖呈現(xiàn)一定的相關(guān)性[25]；STAT1、JAK 參與細(xì)胞增殖、凋亡、免疫、線粒體功能、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等調(diào)節(jié)，可改善肝癌、肝衰竭、肝纖維化、非酒精性脂肪性肝炎等肝臟相關(guān)疾病[26-29]；ⅠGF1、ⅠGF1R 為合成代謝相關(guān)因子，調(diào)控其表達(dá)可抑制脂質(zhì)蓄積及纖維化，改善非酒精性脂肪肝[30]，且其表達(dá)還與肝癌細(xì)胞的增殖有關(guān)[31]。GO 富集分析結(jié)果表明虎杖治療NASH 可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞對脂質(zhì)的反應(yīng)（Cellular response to lipid）、激素反應(yīng)（Response to hormone）、細(xì)胞內(nèi)受體信號通路（Ⅰntracellular receptor signaling pathway）等生物過程；受體復(fù)合物（Receptor complex）、膜筏（Membrane raft）、膜微結(jié)構(gòu)域（Membrane microdomain）等細(xì)胞組分；核受體活性（Nuclear receptor activity）、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活化（Ligand-activated transcription factor activity）等分子功能。KEGG 富集分析結(jié)果表明結(jié)果提示虎杖可能通過調(diào)節(jié)癌癥通路（Pathways in cancer）、PⅠ3K/Akt 信號通路、化學(xué)致癌作用-受體激活（Chemical carcinogenesis - receptor activation）、蛋白聚糖在癌癥中的應(yīng)用（Proteoglycans in cancer）、肝癌、Ras 等信號通路發(fā)揮對非酒精性脂肪性肝炎的治療作用。癌癥、肝癌等相關(guān)通路主要涉及基因突變、凋亡、細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖轉(zhuǎn)移等過程[32]；PⅠ3K-Akt 信號通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡過程[33-34]，且在炎癥及氧化應(yīng)激等過程中也發(fā)揮作用[35-36]。Ras 通路被證實參與肝炎、肝纖維化等肝病發(fā)生發(fā)展過程，可能機(jī)制與抗炎、抗凋亡有關(guān)[37]。

綜上所述，虎杖可能通過調(diào)節(jié)癌癥、PⅠ3K/Akt、肝癌、Ras 信號通路以調(diào)節(jié)SRC、RXRA、GRB2、AKT1、RXRB、ESR1、STAT1、JAK2、ⅠGF1、ⅠGF1R等蛋白的表達(dá)發(fā)揮抗炎、抗氧化、抗凋亡、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、抑制細(xì)胞增殖等作用改善NASH 損傷。