周 芳,黃 芳,劉 杰,歐陽械華,馬 良,陳 佳

(1.諸暨市中醫(yī)醫(yī)院 兒科,浙江 紹興 311800;2.杭州漢庫醫(yī)學(xué)檢驗所有限公司,浙江 杭州 310051)

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(environmental endocrine disruptors,EEDs)是指能夠干擾人體內(nèi)分泌系統(tǒng)的外源性化學(xué)物質(zhì),能被人體吸收,并且會通過食物鏈不斷富集,導(dǎo)致人的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等出現(xiàn)多種病變、癌變、畸變,對人體健康危害極大,尤其是嬰兒、幼兒、兒童,可能造成不可逆的身體損害,例如性早熟、肥胖、發(fā)育遲緩等[1-5],環(huán)境內(nèi)分泌干擾物暴露已成為人們?nèi)找骊P(guān)注的重大環(huán)境問題,因此建立環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的快速準(zhǔn)確檢測方法尤為重要。

目前關(guān)于人體EEDs暴露水平檢測的文獻(xiàn)報道較多[6-12],但存在檢測物質(zhì)種類較少、實際樣本檢測數(shù)量少、未實際應(yīng)用于臨床等問題。本文建立方法同時檢測尿液中15種EEDs,包括防腐劑、鄰苯二甲酸酯類化合物、雙酚類化合物、烷基酚類化合物、激素類藥物殘留,涵蓋目前主要暴露EEDs類別中的主要物質(zhì),并應(yīng)用于614例0～12歲人群臨床尿液樣本的檢測,以期為臨床診斷及暴露預(yù)防提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 鄰苯二甲酸甲酯、鄰苯二甲酸丁酯、鄰苯二甲酸乙基己基酯、雙酚A 、雙酚B、辛基酚、壬基苯酚 、己烯雌酚、17α-乙炔基雌二醇、對羥基苯甲酸丁酯、雙酚A-d6、鄰苯二甲酸甲酯-d4(德國Dr.Ehrenstorfer公司,純度均大于98%),鄰苯二甲酸乙酯(美國AccuStandard公司,純度99.7%),對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯(法國EXTRASYNTHESE公司,純度均大于98%),對羥基苯甲酸乙酯-d4、雙酚B-d8(加拿大TRC公司,純度均大于98%),4-辛基酚-d17、α-乙炔雌二醇-d4(加拿大CDN公司,純度均大于98%)。

1.2 儀器條件及參數(shù) 定量檢測采用Agilent 1290-AB Sciex 5500 超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司-美國AB SCIEX公司)。液相色譜條件:Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,美國沃特斯公司);流動相為0.1%乙酸/水溶液-0.01%氨水/乙腈溶液,進(jìn)樣量為5 μL,流速為0.4 mL/min,柱溫為45 ℃,流動相B,0～2.0 min,5%～60%,2.0～3.0 min,60%～65%,3.0～3.5 min,65%～95%,3.5～5.0 min,95%～100%,5.0～5.1 min,100%～5%,5.1～6.0 min,5%～5%。質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子檢測模式,Curtain Gas(CUR) 20 psi,Collision Gas (CAD) 9;IonSpray Voltage (IS) -4 500 V,Temperature(TEM) 400 ℃;Ion Source Gas 1 (GS1) 45,Ion Source Gas 1 (GS2) 45,MRM檢測方式。質(zhì)譜檢測參數(shù)如表1所示。

表1 15種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 15 environmental endocrine disrupting substances

1.3 校準(zhǔn)曲線的配制 環(huán)境內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇(含1 mg/mL BHT)配制成1 mg/mL的一級標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別取適量標(biāo)準(zhǔn)儲備液,配制成100 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,繼續(xù)稀釋成5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,然后用2 mol/L乙酸銨水溶液逐級稀釋成濃度分別為0.1、0.5、2.5、5、25、50、100 ng/mL的校準(zhǔn)曲線溶液。

1.4 樣本前處理 取500 μL尿液樣本于2.0 mL離心管內(nèi),加入100 μL 2 mol/L乙酸銨溶液(pH=6.5)、20 μL混合內(nèi)標(biāo)工作液、20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶,渦旋混勻,37 ℃水浴振蕩振蕩90 min;酶解液冷卻至室溫,加20 μL甲酸,并加入1 mL乙酸乙酯萃取;取950 μL乙酸乙酯層凍干,用100 μL甲醇復(fù)溶,離心取上清液進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 典型分析譜圖 15種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和尿液樣本檢測譜圖見圖1。各物質(zhì)的保留時間(min)分別為:MMP 2.04,MP 2.26,MEP 2.28,EP 2.55,BPA 2.79,MBP 2.80,PP 2.83,MBzP 2.83,EE2 2.97,BPB 2.98,BP 3.12,DES 3.12,MEHP 3.92,4-OP 4.44,4-NP 4.58。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品(A)及尿液樣本(B)的UPLC-MS/MS檢測選擇離子流圖Figure 1 Selected ion chromatogram of standard solution (A) and urine sample (B) by UPLC-MS/MS Detection

2.2 線性范圍、回歸方程及檢出限和定量限 配制濃度分別為0.1、0.5、2.5、5.0、25.0、50.0、100.0 ng/mL的15種EEDs的校準(zhǔn)曲線溶液,按照1.4方法進(jìn)行前處理后進(jìn)樣分析,采用內(nèi)標(biāo)法定量,15種EEDs的線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999。以3倍信噪比對應(yīng)的含量為檢出限,以10倍信噪比對應(yīng)的含量為定量限,尿液種15種EEDs的線性、方法檢出限和定量限如表2所示。

表2 15種EEDs的線性、檢出限和定量限實驗結(jié)果Table 2 The results of linearity, detection limit, and quantification limit for 15 EEDs

2.3 方法精密度和準(zhǔn)確性 在尿液樣本中分別加入低、中、高3個濃度的15種EEDs混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),加標(biāo)濃度分別為 2.5、25、75 ng/mL,每個濃度平行6次實驗,連續(xù)測試3天,15種EEDs檢測含量的日內(nèi)精密度均小于10%,日間精密度均小于15%,加標(biāo)回收率均在80%～120%之間,表明分析結(jié)果穩(wěn)定可靠。

2.4 臨床樣本分析 收集2018年度于本院兒科就診的614例12歲及以下人群的尿液樣本,采用本研究建立的方法進(jìn)行測試。樣本來源病例均表現(xiàn)出相關(guān)臨床癥狀就醫(yī)、可能為EEDs暴露者,其中:男44例,包括0～3歲4例、4～6歲27例、7～9歲13例、10～12歲26例;女570例,包括0～3歲19例、4～6歲155例、7～9歲396例、10～12歲18例。檢測樣本來源說明出現(xiàn)臨床癥狀就醫(yī)的女童數(shù)量遠(yuǎn)高于男童,4～9歲為高發(fā)期;在男童和女童所有年齡段中,MP、EP、MMP、MEP、MBP、MEHP檢出率為75%～100%,PP檢出率為53.85%～96.3%,BPA檢出率為25%～56%,MBzP檢出率為5.88%～87.88%,BPB、DES、EE2、4-OP、4-NP幾乎沒有檢出。

3 討論

隨著人類社會生產(chǎn)力水平不斷提高,人們?nèi)粘Ｉ钪薪佑|到工業(yè)制品的機(jī)會愈來愈多。而眾多工業(yè)制品中往往含有一些危害人體健康的物質(zhì),其中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物(EEDs)就是其中重要的一類。近年來,越來越多的研究開始關(guān)注這些EEDs的暴露對人體健康所造成的危害。值得關(guān)注的是,與國外調(diào)查數(shù)據(jù)相比較發(fā)現(xiàn),我國人體中鄰苯二甲酸甲基酯(MMP)和鄰苯二甲酸單(2-乙基己)酯(MEHP)的檢出率和含量都非常高,毒性較大的MEHP含量高出國外的2～100倍,分析可能與我國大量生產(chǎn)和使用增塑劑有關(guān)。國內(nèi)學(xué)者王小逸等[13]在對北京地區(qū)家庭中鄰苯二甲酸酯類化合物暴露情況的調(diào)查發(fā)現(xiàn),與飲用水相關(guān)的塑料來自水管和桶裝水,分別占到64%和41%;擁有兒童的家庭中,使用塑料餐具和奶瓶的,占總的兒童家庭的44%和41%。EEDs系列分析可了解日常生活中環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的暴露量,如個人衛(wèi)生用品、塑料食品容器與清潔劑等。因此,評估體內(nèi)EEDs是幫助患者恢復(fù)健康的第一步。

質(zhì)譜檢測方法能夠在色譜峰不完全分離的情況下基于質(zhì)荷比進(jìn)行準(zhǔn)確的定性定量,本文建立了尿液中15種EEDs的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,6 min內(nèi)即可實現(xiàn)15種常見EEDs的同時檢測,分析通量高,適用于大樣本篩查,所使用尿液樣本僅為500 μL,前處理操作簡便且靈敏度高,實現(xiàn)了體內(nèi)暴露的EEDs代謝物質(zhì)的精準(zhǔn)檢測。而且,同時檢測尿中EEDs具有不受外源性污染、采樣無人體損傷、采樣量足、兒童及家長容易接受的特點。盡管尿中環(huán)境激素代謝物的濃度存在一些日間或月間變異,但研究表明檢測單份隨機(jī)尿可以代表6個月內(nèi)環(huán)境激素的平均暴露水平。該方法的建立有助于評估兒童體內(nèi)環(huán)境激素的污染水平,指導(dǎo)家長更加科學(xué)地?fù)狃B(yǎng)兒童。另外,本研究將該方法應(yīng)用于臨床尿液樣本的檢測,樣本來源說明出現(xiàn)臨床癥狀就醫(yī)的女童數(shù)量遠(yuǎn)高于男童、4～9歲為高發(fā)期;檢測結(jié)果表明MP、EP、PP、MMP、MEP、MBP、MEHP 7種物質(zhì)檢出率很高,均達(dá)到90%以上。該檢測結(jié)果可對有針對性地預(yù)防暴露,以及降低發(fā)病率提供科學(xué)依據(jù)。

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物在體內(nèi)呈累積趨勢,因此對未出現(xiàn)臨床癥狀人群的篩查尤為重要;做到早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù),降低不可逆身體損害的發(fā)生概率,需要建立快速、簡便、高通量的檢測方法進(jìn)行人群篩查。今后,疾病機(jī)理的研究、治療過程的監(jiān)測及治療手段的發(fā)展是環(huán)境內(nèi)分泌干擾物分析研究的方向。