姚白雪,王 磊,唐澤文,徐宇璇,張麗楠,林樂清

(1.杭州師范大學 臨床醫(yī)學院,浙江 杭州 311121;2.杭州師范大學附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學科,浙江 杭州 310015)

膿毒癥是重癥監(jiān)護室內(nèi)主要的衛(wèi)生健康問題,造成16%～33%的患者死亡[1]。膿毒癥引起的心功能障礙稱為膿毒癥心肌病(sepsis-induced cardiomyopathy,SICM),有報道表明50%的膿毒性休克患者存在心功能不全,死亡率高達70%[2]。SICM的發(fā)病機制尚未明確,近年來的研究表明外泌體在其中扮演著重要角色。本文對不同細胞來源的外泌體在膿毒癥心肌病中作用機制的研究進展進行綜述,以期為膿毒癥心肌病的診療提供一些新的思路。

1 外泌體概述

外泌體是一種直徑在40～160 nm(平均100 nm)的細胞外囊泡,包含核酸、脂類、代謝物、胞質(zhì)和細胞表面蛋白質(zhì),介導體內(nèi)不同類型細胞之間的信號通訊[3]。不同來源的外泌體及外泌體的不同內(nèi)含物在膿毒癥心肌病的病理生理機制中起著重要作用。研究表明膿毒癥患者血漿外泌體水平與器官衰竭的嚴重程度及預測死亡率相關(guān)[4]。Pei等[5]發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細胞來源的外泌體在膿毒癥小鼠模型中能減輕其心肌損傷。在這過程中發(fā)揮重要作用的是外泌體分泌的非編碼RNA,包括微小RNA(microRNAs, miRNAs)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs,lncRNAs)。此外,外泌體還與循環(huán)中的促炎因子、氧化物、內(nèi)皮細胞功能障礙、鈣調(diào)節(jié)等這些與膿毒癥心肌病相關(guān)的因素也有著密切聯(lián)系。其中,不同類型細胞來源的外泌體在膿毒癥心肌病中發(fā)揮著不同的作用。

2 外泌體與SICM

2.1 內(nèi)皮細胞來源的外泌體 內(nèi)皮細胞的功能障礙被認為是膿毒癥導致器官功能障礙的關(guān)鍵因素[6]。膿毒癥發(fā)展過程中產(chǎn)生的病原體相關(guān)分子模式可激活內(nèi)皮細胞,上調(diào)趨化因子和黏附分子的表達,從而促進免疫細胞浸潤和炎癥反應,導致器官損傷。熱休克蛋白A12B(heat shock protein A12B,HSPA12B)主要表達于內(nèi)皮細胞,對血管的生成起關(guān)鍵作用[7]。既往研究表明,HSPA12B在減輕內(nèi)毒素誘導的心功能不全中起重要作用。最近,Tu等[8]通過動物實驗明確了內(nèi)皮細胞可以通過分泌外泌體來釋放HSPA12B,進而下調(diào)巨噬細胞的促炎反應,起到對SICM的保護作用。與之相關(guān)的研究表明,血清外泌體可分泌以黏附分子為靶標的miRNA-126,HSPA12B通過調(diào)節(jié)miRNA-126的表達,從而減少免疫細胞在心肌中的積聚,進而減輕膿毒癥所致的心功能障礙[9]。

此外,內(nèi)皮細胞還可以通過旁分泌調(diào)節(jié)相鄰細胞功能,而外泌體轉(zhuǎn)運是旁分泌的重要途徑之一。暴露于脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)的內(nèi)皮細胞來源的外泌體可促進大鼠心肌細胞增殖,通過下調(diào)凋亡相關(guān)基因減輕心肌細胞凋亡,降低心肌細胞中乳酸脫氫酶和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的水平,同時增加超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)的水平。這提示了外泌體對心肌細胞的抗氧化應激的保護作用。在實驗中,研究人員發(fā)現(xiàn)在高濃度(10 μg/mL)的LPS下,內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的微泡主要是凋亡小體,外泌體則明顯減少。這說明內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的外泌體對心肌細胞的保護作用可能僅存在于膿毒癥早期[10]。還有研究發(fā)現(xiàn),膿毒癥小鼠循環(huán)中的外泌體比正常小鼠循環(huán)中的外泌體含有更高水平的ROS,可以有效地轉(zhuǎn)運到內(nèi)皮細胞,導致內(nèi)皮細胞骨架結(jié)構(gòu)足體簇的生成。而足體簇促使細胞間連接的中央調(diào)節(jié)因子ZO-1的移位來破壞內(nèi)皮細胞完整性,從而導致血管滲漏和心功能不全[11]。

2.2 血小板來源的外泌體 活性氧在各種心臟疾病的發(fā)病機制中起著重要作用,如心肌梗死和心力衰竭。體內(nèi)活性氧和活性氮主要來源于產(chǎn)生超氧化物的還原型輔酶Ⅱ氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase,NOX)和一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS),而血小板可以表達這兩種酶,同時也具有相應的活性,而外泌體在這過程中發(fā)揮著重要的作用。膿毒癥患者血小板來源的外泌體誘導產(chǎn)生NOX,通過活性氧依賴的途徑誘導內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞凋亡[12]。在另一項研究中,膿毒癥患者血小板分泌的外泌體含有NOS,誘導心肌細胞產(chǎn)生一氧化氮(NO),促進活性氧/活性氮的產(chǎn)生,導致內(nèi)皮細胞的凋亡;同時外泌體可導致暴露于內(nèi)毒素的離體動物心肌收縮力下降,且這種改變在外泌體退出時是完全可逆的[13]。

NOS是一種能結(jié)合鈣調(diào)蛋白且含有血紅素的酶,其中誘導型NOS在細胞內(nèi)幾乎不表達,但可以被LPS、細胞因子等誘導表達產(chǎn)生過量的NO,在膿毒癥發(fā)展的過程中造成組織的損傷。NO是一種在心血管病理生理中起核心作用的信號分子,通過調(diào)節(jié)冠狀動脈張力、血栓形成、炎癥、興奮-收縮偶聯(lián)等影響心臟功能。其中NO與超氧化物結(jié)合可導致過氧亞硝酸鹽的產(chǎn)生,這種化合物被認為是心肌抑制的主要因素,且可以引起包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA在內(nèi)的生物分子的氧化損傷。有研究將膿毒患者循環(huán)中的外泌體靜脈注入小鼠體內(nèi),觀察到小鼠心臟中的NO、前列腺素、誘導型NOS表達增強,而這些效應與促炎反應和氧化應激相關(guān)[14]。

中性粒細胞在膿毒癥的免疫反應中起著重要的作用,除了吞噬功能,中性粒細胞還可以釋放中性粒細胞胞外陷阱(neutrophil extracellular traps ,NETs)來捕殺微生物。但過度的NETs形成可能導致膿毒癥中多器官功能障礙的發(fā)生,而血小板可能參與了膿毒癥中NETs形成的這一過程[15]。有研究證明了血小板來源的外泌體通過分泌高遷移率族蛋白1(high mobility group protein,HMGB1)和/或miRNA-15b-5p和miRNA-378a-3p誘導中性粒細胞內(nèi)自噬通路激活和NETs的形成;同時也發(fā)現(xiàn)抑制血小板來源外泌體的分泌能減輕膿毒癥相關(guān)的肺損傷[16]。結(jié)合上述研究,血小板分泌的外泌體可能通過表達NOS、NOX和形成NETs這些途徑參與SICM的發(fā)展過程中。

2.3 巨噬細胞來源的外泌體 目前SICM的潛在機制仍不明確,但已明確的是膿毒癥引起的多器官功能衰竭是由于持續(xù)的促炎細胞因子風暴。膿毒癥中外泌體的促炎作用包括誘導巨噬細胞極化,增強其促炎因子的分泌,誘導幼稚T細胞分化輔助T細胞及刺激白細胞趨化。循環(huán)中過量的促炎因子被認為是心肌抑制物質(zhì),而外泌體被認為是這些細胞因子的載體[17]。其中細胞因子主要通過巨噬細胞及其他免疫細胞激活Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs),而Toll樣受體在誘導先天免疫和炎癥反應中起關(guān)鍵作用。它通過識別病原體相關(guān)分子模式,將信號轉(zhuǎn)導到細胞,主要激活核轉(zhuǎn)錄因子-kB,控制促炎因子的表達,在介導膿毒癥所致的心功能不全中起重要作用[18]。既往研究表明,從分枝桿菌感染的巨噬細胞中分離出的外泌體可以誘導促炎反應,而LPS處理后的巨噬細胞缺陷的小鼠能部分恢復心肌細胞縮短[19]。為進一步探究巨噬細胞來源的外泌體與膿毒癥引起的心功能不全的關(guān)系,Essandoh等[20]用大腸桿菌LPS處理巨噬細胞并分離外泌體,發(fā)現(xiàn)外泌體含量明顯增加,且促炎因子水平升高。用GW4869(一種中性鞘磷脂酶抑制劑,目前應用最廣泛的阻斷外泌體生成的藥物)抑制LPS處理的巨噬細胞外泌體的產(chǎn)生,能減少促炎細胞因子的產(chǎn)生;同時能在小鼠模型中抑制LPS引起的中性粒細胞的心肌浸潤,減輕心功能障礙,降低死亡率。這證實了阻斷巨噬細胞來源的外泌體的釋放,可以減少循環(huán)中促炎細胞因子水平,減輕膿毒癥所致的心功能障礙和死亡率[20]。

高遷移率族蛋白1(HMGB1)是一種核蛋白,在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)。HMGB1一旦釋放到細胞外,可被巨噬細胞激活,以調(diào)節(jié)炎癥反應。循環(huán)中HMGB1水平升高與膿毒癥的嚴重程度呈正相關(guān)。Yang等[21]研究表明,乳酸促進了HMGB1的乳糖化、乙?；?并通過巨噬細胞外泌體分泌促進HMGB1的釋放。而含有HMGB1的外泌體進一步破壞內(nèi)皮黏附和緊密連接蛋白,增加黏附分子表達,導致內(nèi)皮屏障功能障礙。結(jié)合HMGB1在心臟炎癥損傷和再生重塑中的作用[22],這種核蛋白可能在膿毒癥患者出現(xiàn)心功能不全中發(fā)揮一定的作用。事實上,已有研究表明,miRNA-181b過表達可下調(diào)膿毒癥大鼠HMGB1的表達,從而減少炎癥因子和心肌損傷,抑制心肌細胞凋亡[23];lncRNA PVT1通過miRNA-29a/HMGB1軸促進M1巨噬細胞極化,加重LPS誘導的心肌損傷[24]。

2.4 間充質(zhì)干細胞來源的外泌體 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源于骨髓或脂肪組織,在適當環(huán)境下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞和成肌細胞,具有多種生物學功能,如促進損傷組織再生、調(diào)節(jié)免疫反應等。以往研究表明,MSCs在LPS誘導的膿毒癥模型中能有效降低死亡率和改善心肌功能,且在注射MSCs 5～10 min后發(fā)現(xiàn)其主要分布在肺和肝臟中,在心臟組織檢測不到[25-26]。因此考慮MSCs誘導的心肌保護作用可能與局部作用無關(guān),與旁分泌所致的全身效應相關(guān)。而外泌體是MSCs旁分泌的關(guān)鍵效應因子,從MSCs釋放的外泌體(MSC-exos)能通過調(diào)節(jié)miRNA-182的表達來減輕動物模型的心肌缺血再灌注損傷[27]。為明確MSC-exos是否與膿毒癥中心肌保護相關(guān),Wang等[28]將缺少miR-223的MSC-exos注射到膿毒癥小鼠體內(nèi),發(fā)現(xiàn)其并未改善心功能和存活率,而miR-223是一種在高度富集于MSC-exos中的microRNA,進而表明MSCs對膿毒癥心臟的保護作用可能依賴于外泌體中miR-223的表達。此外,Liu等[29]的研究在證明MSC-exos對體外炎癥模型心肌細胞和體內(nèi)膿毒癥模型心肌細胞均有保護作用的同時,還發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控MSC-exos的潛在基因miR-146a-5p過表達可促進LPS誘導的心肌細胞增殖,抑制其凋亡。

除了通過調(diào)節(jié)microRNA外,MSC-exos還可能通過降低鈣超載來減少線粒體損傷進而保護膿毒癥時的心功能。鈣是體內(nèi)重要的第二信使,在心肌收縮力中起關(guān)鍵作用。線粒體主要通過鈣攝取——由呼吸鏈產(chǎn)生的質(zhì)子泵通過內(nèi)膜產(chǎn)生的相當大的電壓驅(qū)動以及由線粒體Na+/Ca2+交換器介導的線粒體Ca2+外流[30]來調(diào)節(jié)鈣。膿毒癥早期心肌細胞線粒體鈣攝取無明顯變化,但鈣外流明顯異常,這表明SICM是與線粒體鈣外流減少所致的線粒體鈣超載相關(guān)[31]。有研究證實了MSC-exos會被盲腸結(jié)扎穿孔誘導的膿毒癥小鼠心肌細胞攝取,同時觀察到被外泌體處理后的心肌細胞中僅表現(xiàn)為少數(shù)線粒體嵴數(shù)量減少,并能逆轉(zhuǎn)心肌細胞鈣外流的減少,這表明了外泌體的線粒體保護作用。目前越來越多的證據(jù)表明,間充質(zhì)干細胞來源的外泌體可以改善心臟功能,促進心臟再生和修復[32],對未來膿毒癥心肌病的治療具有指導意義。

3 結(jié)語

綜上所述,目前對膿毒癥患者如何導致心功能不全仍缺乏完整的了解,但其中外泌體在膿毒癥心肌病中的作用機制可包括:內(nèi)皮細胞來源的外泌體通過釋放HSPA12B減輕促炎反應、降低ROS水平保護心肌細胞;血小板來源的外泌體可誘導心肌細胞中NO的產(chǎn)生,導致細胞凋亡和功能障礙,從而導致心肌病,且也可能通過形成NETs這一途徑參與膿毒癥心肌病的發(fā)展過程中;巨噬細胞來源的外泌體可增加循環(huán)中細胞因子水平,促進中性粒細胞的心肌浸潤及內(nèi)皮屏障功能障礙,進而導致膿毒癥的心功能障礙;間充質(zhì)干細胞來源的外泌體通過釋放miR-223及降低鈣超載來保護心肌細胞,抑制其凋亡,可作為未來一種保護心肌的手段。此外,外泌體分泌的miRNAs和lncRNAs通過參與炎癥信號通路、調(diào)節(jié)炎癥因子、調(diào)控心肌纖維化及內(nèi)皮細胞功能等途徑也在膿毒癥心肌病中發(fā)揮著重要的作用。近年來,越來越多的研究聚焦于膿毒癥及外泌體的聯(lián)系上,這些新的發(fā)現(xiàn)可能會對膿毒癥心肌病的早期識別、早期診斷及治療提供臨床意義。