馬富海 李廷棟 趙慶 唐曉棟 陳國棟 李昭成 白登彥

1.甘肅省中醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050

2.甘肅省腫瘤醫(yī)院,甘肅 蘭州 730050

3.甘肅省第二人民醫(yī)院,甘肅 蘭州730030

膝骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)滑膜組織退行性病理改變并伴發(fā)炎癥因子水平異常增高的臨床常見疾患,該病發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究顯示,KOA的發(fā)病多與自身免疫性病變、軟骨退變等有關(guān),近年研究發(fā)現(xiàn),KOA發(fā)病與細(xì)胞炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡等有密切關(guān)系,但具體發(fā)病機(jī)制仍不明確[1]。相關(guān)研究指出,KOA發(fā)病時多伴有體內(nèi)炎癥因子異常表達(dá)、細(xì)胞焦亡等特異性表現(xiàn)[2-3]。NLRP3/NF-κB/Caspase-1是機(jī)體細(xì)胞焦亡的主要信號通路,該通路關(guān)鍵激酶的磷酸化過程會干預(yù)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄、增值、分化、凋亡及炎性反應(yīng)過程,其中NLRP3是重要的炎癥復(fù)合體,NF-κB主要負(fù)責(zé)調(diào)控炎癥因子轉(zhuǎn)錄過程,NLRP3激活后會活化Caspase-1及NF-κB通道,誘導(dǎo)IL-1β、IL-18等多種促炎因子的釋放,刺激軟骨細(xì)胞和滑膜成纖維細(xì)胞降解基質(zhì),增加關(guān)節(jié)炎的氧化應(yīng)激反應(yīng)[4-5]。益腎蠲痹丸在臨床上常用于治療KOA[6-7],但益腎蠲痹丸能否通過調(diào)控細(xì)胞焦亡關(guān)鍵信號通路NLRP3/NF-κB/Caspase-1來治療KOA未見實驗證實。本實驗以NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路為切入點,通過益腎蠲痹丸干預(yù)治療KOA模型大鼠,為臨床治療KOA提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

益腎蠲痹丸(國藥準(zhǔn)字:Z10890004,江蘇正大清江制藥有限公司,規(guī)格:8 g);塞來昔布(優(yōu)得寧)(國藥準(zhǔn)字:H20203097,石藥集團(tuán));IL-1β、IL-18及血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)酶聯(lián)免疫試劑盒(SP11237,SP12251,SP11235,武漢賽培生物科技公司);HE染色試劑盒(R23261,上海尚寶生物科技有限公司);TUNEL細(xì)胞焦亡檢測試劑盒(P0012s,上海碧云天有限公司);免疫組化試劑盒(KGP4100,上海臻諾生物科技公司);NLRP3、NF-κB、Caspase-1抗體(13123,11412,15120,美國Cell Signaling Technology公司)。熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司);石蠟切片機(jī)、包埋機(jī)(德國Leica公司);KH22R型高速離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司);DKZ-1恒溫震蕩水槽(濟(jì)南愛來寶儀器設(shè)備有限公司);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司);游標(biāo)卡尺(0.02 mm精度,東莞中特精密儀器公司);YLS-7C足趾容積測量儀(天津諾雷信達(dá)科技公司)。

1.2 動物分組與造模

SPF級雌性3月齡SD大鼠90只,體質(zhì)量(250±20)g,由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供[動物合格證:62001000000630,動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(甘)2020-0021]。本研究經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會審查并通過,實驗倫理號:202001170。按隨機(jī)數(shù)字法分為空白組、模型組、陽性對照組、益腎蠲痹丸低、中、高劑量組共6組,每組各15只。實驗前后所有大鼠飼養(yǎng)條件一致。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗造模,除空白組外,其他5組按照文獻(xiàn)[8]采用改良Huith法建立膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型。造模方法:大鼠麻醉后仰臥位固定,右膝關(guān)節(jié)備皮消毒,暴露關(guān)節(jié)腔后依次剪斷前交叉內(nèi)側(cè)副韌帶,摘除半月板后消毒縫合。6周后進(jìn)行關(guān)節(jié)軟骨病理切片,如出現(xiàn)軟骨表層纖維化糜爛、表面粗糙不平等病理性表現(xiàn),則證實造模成功。本次實驗KOA大鼠模型均造模成功。

1.3 給藥

造模成功后進(jìn)行灌胃治療,其中5組治療組按人鼠用藥比例換算后藥物溶于生理鹽水,陽性對照組大鼠給予塞來昔布18 mg/kg干預(yù)治療,益腎蠲痹丸低劑量組大鼠予益腎蠲痹丸25 mg/kg,中劑量組予50 mg/kg,高劑量組予100 mg/kg灌胃干預(yù),空白組和模型組等劑量生理鹽水干預(yù),1次/d,連續(xù)干預(yù)6周。

1.4 取材

末次干預(yù)后,3 %的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠,腹主動脈采血后4 500 r/min離心15 min取上清液凍存待測;取各組大鼠右膝關(guān)節(jié)軟骨組織存于體積分?jǐn)?shù)10 %甲醛溶液中備用。

1.5 實驗方法

1.5.1膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積測定:干預(yù)后,游標(biāo)卡尺測量各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑,足趾容積儀測量各組大鼠足趾容積,各指標(biāo)分別測量3次取均值并記錄。

1.5.2ELISA法檢測IL-1β、IL-18及VEGF含量測定:取各組上清液,ELISA試劑盒檢測各組血清中IL-1β、IL-18及VEGF含量水平變化。

1.5.3HE染色檢測膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化:取各組大鼠部分關(guān)節(jié)軟骨組織固定,脫鈣后進(jìn)行水合、透明、石蠟包埋處理后,切片厚度約5 μm,在蘇木素溶液中染色5 min,沖洗,鹽酸乙醇溶液分化,加入伊紅染色2 min,脫水,二甲苯封片,在光鏡下觀察組織病理學(xué)改變。

1.5.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡:取各組大鼠軟骨部分組織細(xì)胞,加入AnnexinV-FITC/PI進(jìn)行雙標(biāo)染色,用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況,激發(fā)波長488 nm。

1.5.5TUNEL染色法檢測關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞DNA損傷情況:將關(guān)節(jié)軟骨部分組織乙醇脫水后切片、染色,置于100 %、95 %、85 %、75 %乙醇中逐級脫水后透明,TUNEL試劑盒中試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按照1∶10混合后,孵育各組細(xì)胞,在光鏡下觀察采集圖像,每張切片截取等大5個視野,Image J軟件分析統(tǒng)計陽性細(xì)胞,陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100 %=陽性細(xì)胞率。

1.5.6免疫組化法分析:將切片置于枸櫞酸緩沖液中修復(fù)后加入3 %過氧化氫室溫孵育30 min,再加入5 %山羊血清抗原封閉30 min,免疫組化染色觀察骨軟骨組織中Caspase-1蛋白表達(dá)情況。

1.5.7Western Blot法分析NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá):RIPA裂解緩沖液提取關(guān)節(jié)軟骨組織中的總蛋白,BCA蛋白測定試劑盒測定各組總蛋白質(zhì)的濃度,蛋白變性后加入到SDS-PAGE凝膠中,電泳后在PDVF膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,添加一抗(1∶1 000)及二抗(1∶1 000),添加ECL顯色劑,Image J軟件分析蛋白表達(dá)量。

1.5.8qRT-PCR法分析NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路相關(guān)mRNA的表達(dá):Trizol試劑盒提取關(guān)節(jié)軟骨組織中總RNA,反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,設(shè)計引物后參考mRNA模板反轉(zhuǎn)錄cDNA進(jìn)行實時熒光定量PCR的擴(kuò)增,引物序列:NLRP3上游引物5′- AGGTATAGTCGCAAACTA,下游引物5′-GTGAGAG AATTGAGTG;NF-κB上游引物5′- CCTGTAA CGCCGAATA,下游引物5′- CTGATCCGA CATTGTCGC;Caspase-1上游引物5′-GGAGAAGT GAAAATTG,下游引物5′-ATCTCTTGCGCTTTGC;β-actin上游引物5′-CACAGCCACTGAATTACACC,下游引物5′-CCTTTGCTGCTTCGCGTTC。擴(kuò)增條件:提取物90 ℃預(yù)變性5 min,90 ℃30 s,循環(huán)50次,溶解曲線60 ℃～95 ℃,每15 s升溫0.3 ℃,β-actin作為內(nèi)參,2-ΔΔCt法分析計算mRNA的相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積變化

與空白組比較,模型組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑明顯增長(P<0.05),足趾容積明顯增高(P<0.05);干預(yù)后,與模型組對比,陽性對照組及益腎蠲痹丸干預(yù)組膝關(guān)節(jié)直接明顯降低(P<0.05),足趾容積顯著減小(P<0.05),其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑及足趾容積變化比較

2.2 IL-1β、IL-18及VEGF含量變化

與空白組比較,模型組大鼠血清IL-1β、IL-18及VEGF含量明顯升高(P<0.05);干預(yù)后,與模型組對比,陽性對照組及益腎蠲痹丸干預(yù)組血清IL-1β、IL-18及VEGF含量明顯降低(P<0.05),其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠IL-1β、IL-18及VEGF含量變化

2.3 膝關(guān)節(jié)HE染色變化

染色結(jié)果顯示,空白組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞組織形態(tài)完整,細(xì)胞排列有序,細(xì)胞核充盈完整;模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)改變,細(xì)胞排列紊亂,細(xì)胞核破損,出現(xiàn)炎性浸潤;干預(yù)治療后,陽性對照組及益腎蠲痹丸低、中、高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織細(xì)胞逐漸恢復(fù),細(xì)胞排列趨向整齊,炎性浸潤逐漸減輕。見圖1。

圖1 膝關(guān)節(jié)HE染色

2.4 骨細(xì)胞凋亡情況

空白組、模型組、陽性對照組及益腎蠲痹丸低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為(11.77±1.76)%、(47.56±2.82)%、(18.71±3.53)%、(36.56±1.14)%、(29.57±4.08)%、(22.63±3.11)%,與空白組相比,各組造模后骨細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05);干預(yù)治療后,各治療組骨細(xì)胞凋亡率明顯降低,其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。

2.5 骨細(xì)胞DNA損傷情況

TUNEL染色提示,綠色熒光代表細(xì)胞損傷。與空白組比較,模型組大鼠軟骨細(xì)胞TUNEL染色陽性細(xì)胞率明顯升高(P<0.05),提示存在細(xì)胞核DNA損傷;與模型組比較,干預(yù)治療后,各治療組骨細(xì)胞TUNEL染色陽性凋亡率明顯降低,其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見圖2、3。

圖2 各組大鼠骨細(xì)胞DNA損傷情況比較

圖3 各組大鼠骨細(xì)胞DNA損傷情況

2.6 骨細(xì)胞中Caspase-1蛋白表達(dá)

空白組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中僅有少量Caspase-1蛋白表達(dá)。模型組大鼠軟骨組織中Caspase-1蛋白出現(xiàn)大量表達(dá)。經(jīng)過干預(yù)治療后,陽性對照組及益腎蠲痹丸低、中、高劑量組大鼠骨組織Caspase-1蛋白表達(dá)明顯降低。見圖4。

圖4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織Caspase-1蛋白表達(dá)情況

2.7 關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1蛋白表達(dá)

與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯上升(P<0.05);干預(yù)后,與模型組比較,陽性對照組及益腎蠲痹丸低、中、高劑量組大鼠NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1蛋白表達(dá)量明顯下降(P<0.05),其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表3、圖5。

圖5 關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1蛋白表達(dá)量

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1蛋白表達(dá)量比較

2.8 關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1mRNA表達(dá)

與空白組比較,模型組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1mRNA表達(dá)量明顯上升(P<0.05);干預(yù)后,與模型組比較,陽性對照組及益腎蠲痹丸低、中、高劑量組大鼠NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1mRNA表達(dá)量明顯下降(P<0.05),其中益腎蠲痹丸高劑量組顯著優(yōu)于低劑量組(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中NF-κBp65、p38MAPK、Caspase-1mRNA相對表達(dá)量比較

3 討論

KOA最初見于《黃帝內(nèi)經(jīng)·素問·脈要精微論·篇十七》:“膝者筋之府,屈伸不能,行則僂附,筋將憊矣”。中醫(yī)學(xué)將其歸為“骨痹”“痹癥”范疇,認(rèn)為其病在筋骨。《張氏醫(yī)通》指出:“膝為筋之府,膝痛無有不因肝腎虛者,虛則風(fēng)寒濕氣襲之?！薄额愖C治裁痹證》及《醫(yī)林改錯》皆有瘀血致痹之說。以上說明KOA發(fā)病是由于肝腎虧損、氣血不足導(dǎo)致氣機(jī)不暢、邪實入侵,進(jìn)而瘀血內(nèi)阻,使筋骨失養(yǎng),不榮則痛。目前臨床無治療KOA的特效藥物,因此探究更有效的防治手段成為目前臨床工作者的研究熱點。益腎蠲痹丸在臨床常用于治療KOA,該方包含熟地黃、淫羊藿、當(dāng)歸、全蝎等20余味藥。研究發(fā)現(xiàn),益腎蠲痹丸對于調(diào)節(jié)骨代謝,抑制炎癥因子,減少骨代謝標(biāo)志物的形成有良好效果[9]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明,KOA發(fā)病時常伴有炎癥細(xì)胞生命周期異常現(xiàn)象,其中淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等在免疫應(yīng)答時會產(chǎn)生過量炎癥介質(zhì),本研究結(jié)果也顯示,大鼠在造模后出現(xiàn)明顯軟骨組織細(xì)胞炎性浸潤病變,血清中IL-1β、IL-18、VEGF等相關(guān)炎癥因子含量出現(xiàn)明顯增加,表明血液中炎性因子含量增高并損傷軟骨組織[10-12]。這與朱玉輝等[13]研究結(jié)果一致。細(xì)胞焦亡是巨噬細(xì)胞依賴細(xì)胞質(zhì)中特殊的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶Caspase-1介導(dǎo)的特殊程序性細(xì)胞死亡。研究表明,細(xì)胞焦亡與KOA發(fā)病存在密切聯(lián)系[2]。當(dāng)NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路被激活時,NLRP3與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合,并與Caspase-1形成炎癥小體,同時激活NF-κB炎癥通路,切割非活性前體(pro-IL-1β)及(pro-IL-18),成為活性的IL-1β和IL-18并引發(fā)持續(xù)性炎癥反應(yīng),從而提高機(jī)體抵抗內(nèi)源性和外源性刺激[14-16]。本研究也發(fā)現(xiàn),大鼠造模后,細(xì)胞凋亡及DNA損傷明顯增加,NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路相關(guān)蛋白及mRNA的表達(dá)均增高,這說明KOA發(fā)病時,機(jī)體中的細(xì)胞焦亡通路被激活并發(fā)生異常表達(dá),該結(jié)果與喻溢楠等[17]一致。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),在KOA大鼠中,NLRP3過表達(dá)可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)的增加,而且VEGF會正反饋刺激NLRP3 和IL-18含量的增長[18-19]。本研究也發(fā)現(xiàn),造模后大鼠體內(nèi)VEGF含量伴隨NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路的表達(dá)明顯升高。本研究還發(fā)現(xiàn),KOA大鼠在經(jīng)過益腎蠲痹丸干預(yù)后,體內(nèi)細(xì)胞凋亡率明顯減弱,軟骨細(xì)胞組織炎性浸潤明顯好轉(zhuǎn),IL-1β、IL-18及VEGF含量顯著降低,說明益腎蠲痹丸在改善KOA導(dǎo)致的膝關(guān)節(jié)軟骨退變及炎性損傷方面有明顯效果;而且不同濃度的益腎蠲痹丸干預(yù)下,KOA大鼠體內(nèi)NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路相關(guān)蛋白及基因的表達(dá)明顯降低,說明益腎蠲痹丸能夠下調(diào)細(xì)胞焦亡關(guān)鍵通路的表達(dá),抑制NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路激活,從而改善KOA導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)及組織損傷。

綜上所述,益腎蠲痹丸能夠有效減輕KOA大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病理改變,抑制細(xì)胞凋亡和炎癥因子過表達(dá),其機(jī)制可能與益腎蠲痹丸調(diào)控NLRP3/NF-κB/Caspase-1信號通路改善細(xì)胞焦亡反應(yīng)有關(guān)。后續(xù)課題組將繼續(xù)深入探究益腎蠲痹丸治療KOA的相關(guān)證據(jù),以期指導(dǎo)臨床。