張浩嘉，朱秀清,*，孫 瑩*

（1.哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.哈爾濱商業(yè)大學旅游烹飪學院，黑龍江 哈爾濱 150028）

大豆蛋白因其高營養(yǎng)價值、低成本和健康益處一直處于植物蛋白應用與研究前沿[1]。大豆拉絲蛋白是以未變性脫脂豆粕和大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）為主要原料，經雙螺桿擠壓技術生產的新型大豆蛋白，常被用作肉類的替代品[2-5]。

在擠壓過程中，各種復雜的加工操作會導致食品聚合物的結構和物理化學性質發(fā)生轉變[6-7]。如大豆球蛋白，通常首先發(fā)生變性，然后通過蛋白質-蛋白質之間的強相互作用發(fā)生聚集[8-9]，擠壓過程會導致蛋白質分子從球狀結構轉變?yōu)榫€形結構，提高天然大豆蛋白二級結構中的β-轉角結構比例，同時明顯降低其表面疏水性，而二硫鍵、疏水作用和氫鍵是維持其線形結構的主要作用力[10-11]。大豆蛋白在上述化學鍵的作用下形成了分子質量較大的聚集體，其分子結構的改變也影響了大豆拉絲蛋白的功能特性。

現(xiàn)有的研究工作探討了擠壓條件對大豆拉絲蛋白功能特性的影響和品質改良[8,11-14]，但雙螺桿擠壓參數(shù)對組織化大豆蛋白分子構象的影響鮮有研究系統(tǒng)闡釋。探究擠出參數(shù)對蛋白構象的影響機理有助于理解SPI低水分擠出產物性能的影響機理，可為調控大豆拉絲蛋白品質提供理論依據。因此，本實驗系統(tǒng)研究擠壓機筒溫度、螺桿轉速和物料水分質量分數(shù)對大豆蛋白的溶解性、粒徑和二級結構等的影響，以此探究大豆蛋白在擠壓過程中的構象變化，以期闡明擠出物形成機理，為大豆拉絲蛋白品質優(yōu)化提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷榨豆粕粉（蛋白質量分數(shù)52.48%）由哈高科大豆食品有限責任公司提供；其余試劑均是分析純。

1.2 儀器與設備

DSE-25同向旋轉嚙合型雙螺桿擠壓機（螺桿直徑25 mm、長徑比25） 德國Brabender公司；傅里葉變換紅外光譜儀 美國珀金埃爾默公司；Zetasizer nano激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器公司；UV759S紫外-可見分光光度計 上海市譜光儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPI的提取

參照文獻[1 2]并稍作修改，通過堿溶酸沉法從冷榨豆粕中提取SPI。冷榨豆粕經正己烷（質量體積比1∶20）浸泡振蕩12 h，干燥后溶解于pH 8.5 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液中，在45 ℃下恒溫水浴振蕩1.5 h后經4 000 r/min離心20 min，取上清液，調至pH 4.5，靜置30 min后4 000 r/min離心20 min，獲得的沉淀即為SPI，將沉淀用適量去離子水溶解并調至pH 7，冷凍干燥備用。凱氏定氮法測得蛋白質含量為910 g/kg。

1.3.2 擠壓實驗及參數(shù)的設定

表1中用下劃線標明各試驗因素的固定水平，如在考察物料水分質量分數(shù)對產品品質影響時，機筒溫度固定為150 ℃，螺桿轉速固定為130 r/min，以此類推。在擠壓前，通過添加蒸餾水將SPI的水分質量分數(shù)分別調整到對應水平，將原料密封在聚乙烯袋中過夜（12 h）使其充分混合。擠出物在40 ℃電熱鼓風干燥箱中烘干24 h后利用粉碎機粉碎，將其通過60 目篩網。

表1 單因素試驗水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for single factor experiments

1.3.3 蛋白質溶解性測定

蛋白質的溶解度測定參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》。

1.3.4 蛋白質游離巰基和二硫鍵含量測定

大豆蛋白的游離巰基含量和二硫鍵含量按照文獻[15]的方法進行測定。

1.3.5 蛋白質粒徑的測定

用馬爾文激光粒度儀測定大豆蛋白的粒徑分布，利用pH值為7.20±0.05磷酸鹽緩沖溶液將大豆蛋白樣品的質量濃度調整為1.0 mg/mL，大豆蛋白樣品的折射率為1.471，磷酸鹽緩沖溶液折射率為1.330，每個取樣檢測3 次，取平均值。

1.3.6 蛋白質Zeta-電位測定

參照文獻[16]的方法用馬爾文激光粒度儀測定SPI的Zeta-電位，參數(shù)設定：折光系數(shù)為1.330、介電常數(shù)為78.55、黏度為1.008 7 mPa?s。利用pH值為7.20±0.05的磷酸鹽緩沖溶液將大豆蛋白樣品的質量濃度調整為1.0 mg/mL，測定相應的Zeta-電位。每個樣品平行測定3 次，取平均值作為Zeta-電位。

1.3.7 蛋白質傅里葉變換紅外光譜測定

傅里葉變換紅外光譜是分析蛋白質二級結構的主要方法之一。參照文獻[17]的方法作適當修改，用傅里葉變換紅外光譜儀進行全波段掃描（4 000～400 cm－1），掃描次數(shù)為32，分辨率設定為4 cm－1，掃描背景光譜后進行上樣，大豆蛋白樣品經冷凍干燥后取少量直接置于水平傅里葉變換紅外光譜儀鍺晶體表面上，蓋住鍺晶體（直徑2 mm）即可，壓平，采集樣品紅外光譜譜圖，做3 次平行實驗。采用PeakFit V4.12軟件分析紅外光譜數(shù)據。

1.4 數(shù)據處理與分析

所有實驗進行3 次平行，數(shù)據以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析檢驗各指標的差異性統(tǒng)計學意義；采用Origin 2021軟件繪制曲線。

2 結果與分析

2.1 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI氮溶解指數(shù)的影響

2.1.1 不同機筒溫度對SPI氮溶解指數(shù)的影響

隨著擠壓溫度升高，擠出物氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）顯著降低，在170 ℃的擠壓溫度條件下，NSI下降至最低值（14.45%）（圖1A），表明擠壓處理會明顯降低大豆蛋白的溶解度，主要是由于擠壓機內高溫高剪切力的作用破壞了SPI原有的天然結構，隨著疏水基團的暴露以及非共價鍵的作用，形成了分子質量較大的蛋白質聚集體[18]；但隨著擠壓溫度的繼續(xù)升高，NSI不再繼續(xù)降低，反而在擠壓溫度180 ℃下小幅上升，可能是過高的擠壓溫度破壞了蛋白質聚集體結構，小分子質量肽的比例增加[19]，從而使SPI的NSI略有回升。

圖1 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對蛋白溶解度的影響Fig.1 Effects of extrusion system parameters on protein solubility

2.1.2 不同物料水分質量分數(shù)對SPI氮溶解指數(shù)的影響

隨著物料水分質量分數(shù)的升高，SPI的NSI呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，物料水分質量分數(shù)從16%升至22%時，NSI增加至最高值（16.30%）（圖1B），說明22%物料水分質量分數(shù)下擠壓處理有利于SPI溶解度的提高；當物料水分質量分數(shù)低于22%時，水分含量較低導致擠壓機?？谔幬锪蠂乐嘏蛎?；說明缺少水分的潤滑保護作用，擠壓機內的高溫、高壓以及高剪切力作用使得SPI樣品天然結構遭到嚴重破壞；通過對擠壓樣品的觀察，當物料水分質量分數(shù)高于22%時，擠出物嚴重斷裂，并在擠壓機?？谔幊霈F(xiàn)噴料現(xiàn)象，這可能是水分子在高溫條件下的瞬間汽化導致?？趬毫^高，不利于SPI聚集體的形成，造成溶解度出現(xiàn)下降的趨勢，且不利于形成穩(wěn)定的擠出物[20]。

2.1.3 不同螺桿轉速對SPI氮溶解指數(shù)的影響

隨著螺桿轉速的升高，SPI的NSI呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，在螺桿轉速從100 r/min增至130 r/min時，NSI提升至最大值（16.37%）（圖1C），推測是由于螺桿轉速越高機械能輸入越高，較高機械能輸入引起蛋白質解聚導致溶解度上升；而較低螺桿轉速會導致停留時間較長，蛋白熱變性時間過長導致溶解度較低；但當螺桿轉速超過130 r/min時，NSI降低，在160 r/min的螺桿轉速條件下NSI降至12.93%，可能是在過高的螺桿轉速條件下，高剪切力的作用促進SPI原有的天然結構被破壞，疏水基團暴露，在非共價鍵的作用下，形成了分子質量較大的蛋白質聚集體，使得SPI的溶解度進一步降低[21]。

2.2 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI游離巰基、二硫鍵含量的影響

2.2.1 不同機筒溫度對SPI游離巰基、二硫鍵含量的影響

隨著擠壓溫度的升高，SPI二硫鍵含量先增加后減少，游離巰基含量則呈先下降隨后趨于平穩(wěn)的變化趨勢（圖2A），推測可能是當SPI通過擠壓處理后，其天然結構被破壞，分子鏈被打開，分子內巰基基團暴露，并且部分游離巰基基團被轉換為二硫鍵，導致游離巰基含量變化不明顯，可以推斷SPI聚集體的形成過程中，二硫鍵起到了重要作用；溫度超過160 ℃時，二硫鍵含量略有下降，說明溫度過高，不利于內部巰基基團的暴露以及二硫鍵的形成，相關研究也表明擠出溫度過高會導致蛋白分子直接形成的分子鍵被破壞[9]。

圖2 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI巰基、二硫鍵的影響Fig.2 Effects of extrusion system parameters on the contents of sulfhydryl and disulfide bonds in SPI

2.2.2 不同物料水分質量分數(shù)對SPI游離巰基、二硫鍵含量的影響

隨著物料水分質量分數(shù)從16%增加到22%，二硫鍵含量逐漸降低，SPI游離巰基含量變化不顯著（圖2B），說明該水分條件下物料由于水的保護潤滑作用，不利于內部巰基基團的暴露以及二硫鍵的形成，較低或較高的物料水分含量會加劇擠壓處理對SPI天然構象的破壞；在物料水分質量分數(shù)為22%時，二硫鍵含量最低，使得擠壓后的SPI溶解度最高，這與孫照勇等[22]的研究結論相似。

2.2.3 不同螺桿轉速對SPI游離巰基、二硫鍵含量的影響隨著螺桿轉速增加，SPI游離巰基含量下降，二硫鍵含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢（圖2C），說明SPI經過螺桿的剪切力作用后，蛋白質天然結構被破壞，內部基團暴露，從而引起二硫鍵含量上升，二硫鍵在SPI聚集體的形成過程中起到了關鍵作用。螺桿轉速為130 r/min時，二硫鍵含量達到最高值，此時SPI在二硫鍵的作用下聚集程度較高且溶解度較高，但螺桿轉速超過130 r/min時，二硫鍵含量略有下降，說明過高的螺桿轉速不利于內部巰基基團的暴露以及二硫鍵的形成，且造成SPI溶解度的進一步降低，使得SPI亞基組分中小分子質量組分進一步減少[23]。

2.3 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI粒徑體積分布的影響

2.3.1 不同機筒溫度對SPI粒徑體積分布的影響

天然狀態(tài)下SPI樣品為單峰，且粒徑分布較為均一，經過擠壓處理后，SPI粒徑體積分布圖由原來的單峰變成了雙峰或三峰，隨著擠壓溫度的升高，粒徑分布逐漸右移，SPI平均粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，較大的蛋白質粒徑會降低其溶解度[24]。SPI平均粒徑在150 ℃時增加至最大值（表2），并觀察到圖譜中出現(xiàn)粒徑較大的吸收峰（圖3A），推測是隨著溫度升高，蛋白質分子鏈解聚再聚集成更大的團聚體，導致平均粒徑值升高；當溫度繼續(xù)增加超過160 ℃時，粒徑較大的吸收峰逐漸消失，但是仍處于寬峰狀態(tài)，說明高溫擠壓條件會破壞部分較大的SPI聚集體，此現(xiàn)象的出現(xiàn)也可能是高溫處理后SPI形成的疏松結構易于被破壞所致[25]。

圖3 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI粒徑體積分布的影響Fig.3 Effects of extrusion system parameters on the particle size volume distribution of SPI

表2 不同擠壓溫度條件下SPI平均粒徑及聚合物分散性指數(shù)Table 2 Average particle sizes and PDI values of SPI at different extrusion temperatures

2.3.2 不同物料水分質量分數(shù)對SPI粒徑體積分布的影響

隨著物料水分質量分數(shù)的增加，SPI粒徑體積分布圖的峰型仍是單峰（圖3B），說明不同水分含量的樣品均能獲得體系較為均一的SPI聚集體。從表3可以看出，當物料水分質量分數(shù)較低時，SPI平均粒徑較低，此現(xiàn)象可能是由于較低的水分含量條件使SPI天然構象破壞嚴重，SPI中不溶性組分含量增加，能夠溶解進入粒徑測試液的多為小分子肽，故造成粒徑出現(xiàn)減小的趨勢；當物料水分質量分數(shù)增加到22%時，平均粒徑增加至最大值，繼續(xù)增加物料水分質量分數(shù)平均粒徑下降，說明高物料水分含量有利于形成較穩(wěn)定SPI聚集體，但由于水具有潤滑保護作用，此水分條件下蛋白變性程度較低，較多的蛋白維持了其天然構象，所以溶解度較高，這可能是較高的物料水分抑制了SPI內部疏水基團的暴露，水分子與SPI之間的結合一定程度上抑制了SPI天然構象的破壞以及聚集體的形成[26]。

表3 不同物料水分質量分數(shù)條件下SPI平均粒徑及PDITable 3 Average particle sizes and polymer dispersity index values of SPI at different material moisture contents

2.3.3 不同螺桿轉速對SPI粒徑體積分布的影響

經過不同的螺桿轉速擠壓處理后，SPI粒徑體積分布圖由天然狀態(tài)的單峰變成了多峰，隨著螺桿轉速的升高，粒徑分布圖中峰位逐漸右移，SPI平均粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，并觀察到圖譜中出現(xiàn)粒徑較大的吸收峰（圖3C）；130 r/min時粒徑達到最大值（表4），且分布較為均一（圖3C5），此條件下SPI溶解度最高，說明此擠壓條件有利于形成穩(wěn)定的SPI聚集體；隨著螺桿轉速的繼續(xù)增加，在140～160 r/min條件下SPI分子PDI較低，粒徑的體積分布又逐漸變?yōu)榫磺伊捷^大的單峰，Zhang Jinchuang等[27]研究也發(fā)現(xiàn)蛋白質在較高的螺桿轉速（即高剪切力的作用）下有利于形成粒徑均一的聚集體。

表4 不同螺桿轉速條件下SPI平均粒徑及PDITable 4 Average particle sizes and PDI values of SPI at different screw speeds

2.4 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI Zeta-電位的影響

2.4.1 不同機筒溫度對SPI Zeta-電位的影響

Zeta-電位絕對值的高低表示分子表面所帶正或負電荷數(shù)量的多少，SPI Zeta-電位的絕對值越高，說明體系內蛋白質分子表面的電荷數(shù)量越多，在較大的靜電斥力作用下能夠維持SPI結構處于相對穩(wěn)定的狀態(tài)。與未擠壓處理SPI相比，擠壓處理使SPI整體Zeta-電位絕對值明顯增加；且隨著擠壓溫度的提高，SPI的Zeta-電位絕對值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢（圖4A）；擠壓溫度達到160 ℃時SPI Zeta-電位絕對值達到最高，此時SPI分子間的靜電斥力最大，說明SPI在擠壓處理后，通過二硫鍵、疏水作用以及靜電作用力等化學作用力聚集形成的蛋白質聚集體增多；隨著擠壓溫度進一步升高，Zeta-電位絕對值不再繼續(xù)增加，SPI分子表面靜電荷密度減小，說明過高的擠壓溫度條件下不利于蛋白質聚集體形成。擠壓處理可以破壞SPI天然結構，在誘導不溶性蛋白質聚集體形成的同時促進蛋白質分子內部疏水殘基以及帶電基團暴露，從而引起SPI Zeta-電位絕對值的增加[28]。

圖4 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI的Zeta-電位的影響Fig.4 Effects of extrusion parameters on the zeta potential of SPI

2.4.2 不同物料水分質量分數(shù)對SPI Zeta-電位的影響

經過擠壓處理后，擠出物Zeta-電位絕對值均明顯增加，隨著物料水分質量分數(shù)增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，物料水分質量分數(shù)為22%時，SPI Zeta-電位絕對值達到最低（圖4B），此時SPI分子間的靜電斥力最小，說明SPI在此條件下擠壓處理后形成的蛋白質聚集體較少；較高或較低的物料水分質量分數(shù)均會導致Zeta-電位絕對值增加，SPI分子表面靜電荷密度增加，說明較高或較低的物料水分含量條件下有利于不溶性蛋白質聚集體形成，結合粒徑分析數(shù)據來看，較高或較低的物料水分含量導致擠出物平均粒徑較低，PDI較高，不能形成體系均一的SPI聚集體，這與Li Xianghong等[29]的研究結果相似。綜上，擠壓處理時不同的水分質量分數(shù)對SPI聚集影響差異明顯，較低的物料水分質量分數(shù)有利于SPI聚集體的形成，但不能形成均一的聚合體系，且不利于擠壓過程中SPI與油脂之間的結合，較高的水分質量分數(shù)條件下，水分子的汽化也會破壞SPI穩(wěn)定聚集體的形成。

2.4.3 不同螺桿轉速對SPI Zeta-電位的影響

隨著螺桿轉速的提高，SPI的Zeta-電位絕對值呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢；螺桿轉速為130 r/min時SPI Zeta-電位絕對值達到最高（圖4C），說明此時SPI分子間的靜電斥力最大，現(xiàn)有研究也表明，SPI在擠壓處理后，通過二硫鍵、疏水作用以及靜電相互作用等化學作用力聚集形成的蛋白質聚集體數(shù)量增多[30]；隨著螺桿轉速進一步升高，Zeta-電位絕對值開始下降，SPI分子表面靜電荷密度減小，說明較高的螺桿轉速對機筒內輸入了較高的機械能，導致SPI聚集體被破壞或阻礙形成更多蛋白聚集體，但較高的螺桿轉速有利于形成的SPI聚集體體系趨向均一。

2.5 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI二級結構的影響

2.5.1 不同擠壓溫度對SPI二級結構相對含量的影響

大豆蛋白經擠壓處理后，二級結構中α-螺旋結構、β-折疊結構的相對含量減小，β-轉角、無規(guī)卷曲結構的相對含量增大（圖5A）。隨著擠壓溫度的升高，α-螺旋、β-轉角、無規(guī)卷曲結構的相對含量變化趨勢均為先增大后減小；而β-折疊結構的相對含量變化趨勢為先減小后增大，160 ℃時α-螺旋、β-轉角結構相對含量達到最高值，分別為25.20%和17.98%，β-折疊的相對含量達到最低值（42.45%）；而無規(guī)卷曲在170 ℃時相對含量達到最高值（14.56%）。王冬梅等[31]研究發(fā)現(xiàn)，在擠壓處理后，SPI二級結構中α-螺旋和β-折疊向β-轉角和無規(guī)卷曲轉化，無序性程度提高，與本研究結果一致。

圖5 擠壓系統(tǒng)參數(shù)對SPI的二級結構相對含量的影響Fig.5 Effects of extrusion system parameters on the secondary structure content of SPI

2.5.2 不同物料水分質量分數(shù)對SPI二級結構相對含量的影響

隨著物料水分質量分數(shù)的增加，無規(guī)卷曲結構的相對含量有小幅波動，而α-螺旋、β-折疊結構相對含量呈現(xiàn)出與β-轉角相反的變化趨勢（圖5B），水分質量分數(shù)為22%時α-螺旋結構相對含量達到最高值，水分質量分數(shù)為16%時β-轉角結構相對含量最高，為26.75%，β-折疊的相對含量達到最低值（41.30%）。在22%物料水分質量分數(shù)條件下，由于水的潤滑保護作用導致蛋白變性程度最低，二級結構含量比例最接近原始穩(wěn)定狀態(tài)，高于或低于此水分條件均會導致蛋白無序程度增加；根據前文擠壓處理后SPI平均粒徑及Zeta-電位分析結果，SPI聚集體含量的增加，β-轉角結構起到了主要作用，而擠壓處理后SPI形成均一穩(wěn)定聚集體需要α-螺旋結構的參與。研究表明，α-螺旋和β-折疊含量較高的蛋白聚集體穩(wěn)定性也更高[32-34]。

2.5.3 不同螺桿轉速對SPI二級結構相對含量的影響

大豆蛋白經不同的螺桿轉速擠壓處理后，二級結構中α-螺旋結構、β-折疊結構的相對含量減少，β-轉角相對含量增多，無規(guī)卷曲結構相對含量略有增加，隨著螺桿轉速的增加，α-螺旋、β-折疊結構的相對含量變化趨勢為先增大后減小；而β-轉角的相對含量變化呈現(xiàn)出與α-螺旋、β-折疊含量變化相反的趨勢（圖5C），根據現(xiàn)有研究結果推斷，在擠壓處理后，SPI變性程度提高，二級結構中α-螺旋和β-折疊向β-轉角和無規(guī)卷曲轉化。螺桿轉速在120～130 r/min范圍內蛋白二級結構比例更接近原始狀態(tài)，低于或高于此范圍會導致蛋白無序程度上升，可能是過低的螺桿轉速導致SPI停留時間較長，蛋白變性程度提高，過高的螺桿轉速導致機械能輸入增加，造成蛋白天然結構破壞[35]。

3 結 論

本實驗以S P I 為原料，研究不同擠壓溫度（120～180 ℃）、螺桿轉速（100～160 r/min）和物料水分質量分數(shù)（22%～28%）對冷榨豆粕中大豆蛋白構象的影響，結果顯示：150 ℃下擠出物蛋白聚合度較高，纖維形成效果較好，過高或過低的溫度均不利于蛋白質聚集和形成穩(wěn)定狀態(tài)；物料水分質量分數(shù)在20%～22%時，因水的保護作用使擠出物狀態(tài)最佳，形成體系均一的SPI聚集體，物料水分質量分數(shù)過低或過高時因模口壓力過大導致難以形成較完整的擠出物；較低的螺桿轉速會使得機械能輸入不足且SPI停留時間過長，蛋白質不能完全變性和解聚，較高的螺桿轉速條件下，高剪切力的作用促進了SPI原有天然結構的破壞，形成了分子質量較大的蛋白質聚集體。綜上，在適當?shù)南到y(tǒng)參數(shù)下擠出有助于獲得最佳的擠出物品質，過低則蛋白變性不完全，蛋白聚合度不高，纖維形成效果差，過高則會引起蛋白過度變性，導致已經形成的纖維結構被破壞，擠出物品質下降。