李志明，張 舒，孟維洪，張家瑜，張東杰,3,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江省農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 大慶 163319）

由胰腺β細(xì)胞功能受損、胰島素代謝紊亂所導(dǎo)致的糖尿病是世界性代謝紊亂疾病，血糖偏高和血脂持續(xù)異常是該疾病的主要病理特征，可分為1型、2型（type 2 diabetes mellitus，T2DM）和妊娠型。其中T2DM占患病人群的90%以上[1]，近十年來(lái)，全世界糖尿病患病人數(shù)持續(xù)攀升，預(yù)計(jì)至2046年，全球T2DM患病人數(shù)將增至6.42億。針對(duì)T2DM的病理學(xué)特點(diǎn)，現(xiàn)已開發(fā)了各類口服降糖藥用以預(yù)防、治療T2DM，干預(yù)途徑主要包括兩種：一是有針對(duì)性地提升胰島細(xì)胞活性，促進(jìn)胰島素分泌，從而間接降低血糖（雙胍類、磺脲類、二肽基肽（dipeptidyl peptidase，DPP）IV酶抑制劑、胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）激動(dòng)劑等）；二是延緩攝入體內(nèi)的碳水化合物轉(zhuǎn)換化為葡萄糖的速率以阻礙葡萄糖進(jìn)入體循環(huán)，從而對(duì)餐后血糖進(jìn)行直接調(diào)控（α-葡萄糖苷酶抑制劑）[2]。相較于第一種間接血糖調(diào)控機(jī)制，抑制腸道內(nèi)碳水化合物消化酶活性可對(duì)T2DM患者血糖進(jìn)行直接干預(yù)，不涉及胰島細(xì)胞及代謝靶器官，可一定程度緩解患者胰島素代謝壓力，改善受損的胰島β細(xì)胞功能，所以采用有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑來(lái)控制血糖異?，F(xiàn)已成為預(yù)防、治療T2DM的重要策略之一[3]。大量研究已證實(shí)，一些食品源生物活性成分（肽、酚類、萜類等）具備優(yōu)異的α-葡萄糖苷酶抑制潛能[4]，其中由食源蛋白制備的α-葡萄糖苷酶抑制肽具有營(yíng)養(yǎng)屬性，因其生物利用度高、T2DM治療效果明顯、與傳統(tǒng)α-葡萄糖苷酶抑制劑相比副作用低等特點(diǎn)受到研究界的廣泛關(guān)注，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的制備與研究已成為熱點(diǎn)。

多肽的氨基酸組成、序列、分子質(zhì)量、鏈長(zhǎng)、凈電荷等顯著影響其功能特性和生理活性，同時(shí)，不同的多肽構(gòu)型和分子特征與其動(dòng)力學(xué)行為、靶向生物藥理功效、化學(xué)穩(wěn)定性、生物利用度、半衰期、毒性和過敏性等性質(zhì)皆存在特定的關(guān)聯(lián)[5]。早在2018年，Ibrahim團(tuán)隊(duì)[6]將篩選的43 條食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽通過歸類統(tǒng)計(jì)，總結(jié)了α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和作用機(jī)制，包括：1）鏈長(zhǎng)3～6；2）N端含OH（Ser、Tyr、Thr）或堿性氨基酸（Lys、Arg、His）；3）C端出現(xiàn)Ala或Met；4）Pro靠近C端，最好位于倒數(shù)第二位；5）在pH 7.0時(shí)凈電荷為0或＋1；6）以氫鍵、靜電相互作用為主，可忽略疏水相互作用。這幾條規(guī)律被多數(shù)α-葡萄糖苷酶抑制肽研究人員所引用，作為篩查、鑒別高活性α-葡萄糖苷酶抑制肽的“黃金準(zhǔn)則”，具有指導(dǎo)性意義。但是，近些年針對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制肽的定量構(gòu)效關(guān)系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）探究發(fā)現(xiàn)了許多之前未提及的結(jié)構(gòu)特征，肽與α-葡萄糖苷酶之間的分子相互作用機(jī)制也與上述觀點(diǎn)部分沖突或重疊度低。比如，Gallego等[7]制得的大麻蛋白肽（LR和PLMLP）在α-葡萄糖苷酶抑制方面有優(yōu)異表現(xiàn)，但質(zhì)譜結(jié)果顯示其肽鏈上Leu是靶酶活性降低的關(guān)鍵氨基酸殘基；Mollica等[8]發(fā)現(xiàn)所篩選的α-葡萄糖苷酶抑制肽可通過氫鍵、親水/疏水相互作用等形式實(shí)現(xiàn)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制。這些發(fā)現(xiàn)在Ibrahim等[6]總結(jié)的α-葡萄糖苷酶抑制肽特征和肽-酶結(jié)合模式中均未提及。

其次，與非腸道給藥（注射、鼻腔、肺部等）的肽療法不同，作為食物、營(yíng)養(yǎng)藥品和補(bǔ)充劑配方的α-葡萄糖苷酶抑制肽通?？诜蠼?jīng)口腔-胃腔-腸腔-肝門靜脈而進(jìn)入體循環(huán)，受到消化酶、肽酶、代謝酶的侵?jǐn)_，導(dǎo)致生物可及性較低，在人體血液中的濃度維持在極低的水平（nmol/L），遠(yuǎn)低于體外所測(cè)定的濃度（約1～100 μmol/L）[9]。α-葡萄糖苷酶大量聚集在小腸黏膜上皮細(xì)胞處，α-葡萄糖苷酶抑制肽到達(dá)作用位點(diǎn)之前需耐受胃腸腔的酶屏障（胃/胰/糜蛋白酶）和嚴(yán)峻的pH環(huán)境、穿透覆蓋在小腸上皮細(xì)胞上的黏液層，進(jìn)而引發(fā)肽-靶酶分子生化反應(yīng)[10]。“逃逸”或“多余”的α-葡萄糖苷酶抑制肽可根據(jù)電荷、親/疏水等特點(diǎn)與構(gòu)成腸黏膜的腸道細(xì)胞、微褶細(xì)胞（M細(xì)胞）特異性受體結(jié)合，抵抗外排轉(zhuǎn)運(yùn)體（P-glycoprotein，P-gp）后經(jīng)多途徑轉(zhuǎn)運(yùn)入肝門靜脈系統(tǒng)，在肝門靜脈系統(tǒng)中，大量細(xì)胞色素P-450（cytochrome P-450，CYP-450）代謝酶催化親脂性肽多種功能基團(tuán)的N—和O—，使其脫烷基化、甲基化、乙?；捌咸烟侨┧峄?。最終釋放并進(jìn)入體循環(huán)的α-葡萄糖苷酶抑制肽還具有抑制DPP IV酶活性、促胰高血糖素樣肽-1分泌、清除脂質(zhì)堆積等功能[11]，全方面立體、多角度地干預(yù)T2DM。通過酶法/發(fā)酵法制得的新肽是否會(huì)攜帶具有過敏潛力甚至毒性的序列至今尚未闡明，α-葡萄糖苷酶抑制肽的安全性評(píng)估面臨諸多挑戰(zhàn)?；诖?，本文在Ibrahim等[6]研究的基礎(chǔ)上，使用ScienceDirect（https://www.sciencedirect.com，[2022-08]）搜尋關(guān)鍵詞“α-glucosidase”和“peptide”，使用中國(guó)知網(wǎng)（https://www.cnki.net，[2022-08]）高級(jí)檢索關(guān)鍵詞“α-葡萄糖苷酶”和“肽”整理相關(guān)文獻(xiàn)，歸納出近6 年（2016年1月—2022年8月）已實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的具有α-葡萄糖苷酶抑制活力的食源性肽序列62 條，供本綜述參考分析；采用在線工具ToxinPred（https://webs.iiitd.edu.in/raghava/toxinpred/index.html）預(yù)測(cè)肽段分子質(zhì)量、凈電荷（pH 7.0）、理論等電點(diǎn)（pI）、疏水性和毒性；采用Allergen FP v.1.0（https://www.ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）分析肽段致敏性；采用ADMETlab（https://admet.scbdd.com/home/index/）和SwissADME（https://www.swissadme.ch/index.php）等工具較全面地評(píng)估α-葡萄糖苷酶抑制肽的生物利用度。旨在進(jìn)一步補(bǔ)充α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特性，并運(yùn)用生物信息學(xué)方法深入闡述具有α-葡萄糖苷酶抑制肽結(jié)構(gòu)特征的系列肽段具有安全隱患的概率，以及其對(duì)胃腸腔環(huán)境、黏液等生化及物理屏障的穿透能力，以期側(cè)面反映其開發(fā)成高品質(zhì)、多功能降糖肽的潛力。

1 構(gòu)效關(guān)系

1.1 鏈長(zhǎng)、分子質(zhì)量、氨基酸組成、序列與α-葡萄糖苷酶抑制活性的關(guān)系。

如表1所示，有32 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）小于阿卡波糖（IC50＝201 μmol/L），抑制活力排名前5 位的多肽依次是FDPFPK（IC50＝7.94 μmol/L）、STYV（IC50＝12.01 μmol/L）、AAAPVAVAK（IC50＝13.71 μmol/L）、AIGVGAIER（IC50＝14.74 μmol/L）、WH（IC50＝16.99 μmol/L）。這62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽鏈長(zhǎng)位于2～16之間，由2～9 個(gè)氨基酸殘基組成的多肽數(shù)量占總數(shù)的90.32%，研究頻率最高的是四肽（10 個(gè)）、五肽（9 個(gè)）和七肽（9 個(gè)），其中鏈長(zhǎng)3～7范圍內(nèi)的多肽具有更高的α-葡萄糖苷酶抑制活性（IC50＜80 μmol/L），提示該鏈長(zhǎng)區(qū)間的多肽有更強(qiáng)的抑制潛能。α-葡萄糖苷酶抑制肽不同分子質(zhì)量片段頻率如表2所示。經(jīng)過統(tǒng)計(jì)分析可知，62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽中，分子質(zhì)量小于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽出現(xiàn)頻率高達(dá)48.39%，說(shuō)明其是α-葡萄糖苷酶抑制肽的主流分子質(zhì)量；且IC50＜20 μmol/L的α-葡萄糖苷酶抑制肽平均分子質(zhì)量為574.57 Da（表3），說(shuō)明分子質(zhì)量低于600 Da的α-葡萄糖苷酶抑制肽活性更高。事實(shí)上，由于肽與α-葡萄糖苷酶有效親和力的要求，過長(zhǎng)的肽段對(duì)二者的結(jié)合效果存在負(fù)面影響。Ibrahim等[12]研究發(fā)現(xiàn)，α-葡萄糖苷酶抑制肽（如SAPA、SCPA、SEPA等）與α-葡萄糖苷酶活性位點(diǎn)的結(jié)合自由能（－36.37～－26.75 kJ/mol）接近或大于SPA基序（－28.01 kJ/mol），這個(gè)結(jié)果證實(shí)了短肽有益于降低肽-酶結(jié)合自由能，提升對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制效果。本文所分析的α-葡萄糖苷酶抑制肽的鏈長(zhǎng)在3～7之間，與Ibrahim等[6]總結(jié)的鏈長(zhǎng)3～6不同，從兩方面考慮：一是鏈長(zhǎng)在3～7之間的α-葡萄糖苷酶抑制肽滿足與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合要求；二是研究發(fā)現(xiàn)這兩類α-葡萄糖苷酶抑制肽（六肽和七肽）的抑制效果差異不顯著。例如，吳彤[13]所篩查的核桃蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽中六肽LVVDHL和七肽LDVVDHL在質(zhì)量濃度1.5 mg/mL時(shí)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制率分別為20.4%和19.4%，并無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特征、抑制活性、毒性及致敏性Table 1 Structural properties, inhibitory activity, toxicity and allergenicity of food-derived α-glucosidase inhibitory peptides

表2 α-葡萄糖苷酶抑制肽不同分子質(zhì)量片段頻率Table 2 Frequency of different molecular-mass segments of α-glucosidase inhibitory peptides

表3 不同IC50值的α-葡萄糖苷酶抑制肽平均分子質(zhì)量Table 3 Average molecular masses of α-glucosidase inhibitory peptides with different half maximal inhibitory concentration

如圖1所示，Pro、Leu、Ala在α-葡萄糖苷酶抑制肽的氨基酸組成上占重要地位，在其肽段上的出現(xiàn)頻率最高。Pro除在增強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制肽的抑制能力中顯示重要作用外，在與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin I converting enzyme，ACE）、DPP IV酶催化/活性位點(diǎn)鍵合上也占有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[14-15]。Ibrahim等[12]證實(shí)α-葡萄糖苷酶抑制肽SEPA、SVPA中Pro的官能團(tuán)C＝O分別與α-葡萄糖苷酶位點(diǎn)Arg526的亞氨基和Lys286的氨基通過氫鍵耦合。多項(xiàng)研究表明Pro的環(huán)形亞氨胺結(jié)構(gòu)可使整條肽鏈發(fā)生折疊，出現(xiàn)構(gòu)象不規(guī)則變化，進(jìn)而造成肽鏈結(jié)構(gòu)約束，這可能是其發(fā)揮功效的關(guān)鍵因素[16]。一般來(lái)說(shuō)，Pro位置越靠近C端，其抑制活性越強(qiáng)。Leu在緩解T2DM胰島素抵抗癥狀、提升胰島素作用強(qiáng)度、恢復(fù)β胰島細(xì)胞生理活性上發(fā)揮重要作用[17-18]，是α-葡萄糖苷酶抑制肽篩查的參考氨基酸之一。含大量Leu的大豆蛋白肽（LLPLPVLK）[1]和核桃蛋白肽（LPLLR）[19]表現(xiàn)出高效的α-葡萄糖苷酶抑制活性，適合出現(xiàn)在N端（圖1）。同時(shí)，Ala也可顯著提升α-葡萄糖苷酶抑制肽的活性，蛋黃蛋白肽YINQMPQKSRE（IC50＝1.21 mmol/L）在引入Ala后（YINQMPQKSREA，IC50＝0.31 mmol/L）IC50值大幅下降，抑制活性顯著提升[20]。本文認(rèn)為Pro、Leu、Ala是α-葡萄糖苷酶抑制肽組成上的重要氨基酸殘基。在其他研究中也已經(jīng)證實(shí)Pro、Leu、Ala對(duì)胰島素分泌有顯著改善作用。研究發(fā)現(xiàn)，在胰腺β細(xì)胞系和原代胰島細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)中，Pro、Leu、Ala、Arg和Gln都展示出了不同程度的促胰島素作用[21]；并且，在只攝入Leu、Ala、Ile、Phe和Arg時(shí)，人體內(nèi)胰島素分泌量顯著升高[22]。這些證據(jù)表明，Pro、Leu、Ala不僅是保證α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的分子基礎(chǔ)，更是利用抗糖尿病活性肽管理和預(yù)防T2DM的關(guān)鍵因子。今后應(yīng)重點(diǎn)研究并解析Pro、Leu、Ala對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影響，以期為α-葡萄糖苷酶抑制肽的高效率篩查提供參考（圖2）。氨基酸序列是影響生物活性肽生理活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)性質(zhì)，氨基酸組成相同但序列不同的多肽功能特性和活性存在顯著區(qū)別[23]。由圖1可知，Ala、Ser在N端出現(xiàn)頻率較高，符合Ibrahim等[6]的研究結(jié)果。此外，本文中活性最強(qiáng)（FDPFPK（IC50＝7.94 μmol/L））和較強(qiáng)（WH（IC50＝16.99 μmol/L）、WS（IC50＝7.94 μmol/L））的α-葡萄糖苷酶抑制肽N端出現(xiàn)芳香族氨基酸殘基（Phe和Trp），推測(cè)這兩類氨基酸殘基有增強(qiáng)α-葡萄糖苷酶抑制能力的作用。C端堿性氨基酸Arg和Lys的出現(xiàn)頻率極高（分別為27.59%和20.69%）。肽段C端Arg的存在可提高肽-酶結(jié)合穩(wěn)定性，保證肽與酶關(guān)鍵活性氨基酸殘基的強(qiáng)結(jié)合，從而提高其抑制活性。例如，小麥胚芽蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽LDLQR中C端Arg殘基與α-葡萄糖苷酶Asp443和Asp542存在氫鍵鍵合作用，氫鍵鍵長(zhǎng)（2.1 ?）遠(yuǎn)短于傳統(tǒng)平均氫鍵距離（3.5 ?）[24]。Lys在活性排名前3 位的FDPFPK、AAAPVAVAK中均有出現(xiàn)，提示Lys也是保證α-葡萄糖苷酶抑制活性的必要氨基酸殘基。

圖1 α-葡萄糖苷酶抑制肽氨基酸殘基組成Fig.1 Composition of amino acid residues of α-glucosidase inhibitory peptides

圖2 食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽結(jié)構(gòu)特征、安全性和生物利用度Fig.2 Structural characteristics, safety and bioavailability of foodderived α-glucosidase inhibitory peptides

在了解上述α-葡萄糖苷酶抑制肽氨基酸組成規(guī)律后，通過氨基酸分析等方法了解親本蛋白的氨基酸組成，能在一定程度上判斷該底物開發(fā)成α-葡萄糖苷酶抑制肽的潛力（圖2）。燕麥蛋白的Pro、Leu、Ala、Arg相對(duì)含量均處于較高水平（分別為6.59%、8.39%、6.90%和6.39%），由其制備得到的α-葡萄糖苷酶抑制肽GDVVALPA和DVVALPAG的“Pro＋Ala＋Leu”占比達(dá)50%[25]，已被證明是制備α-葡萄糖苷酶抑制肽的優(yōu)質(zhì)蛋白來(lái)源。依據(jù)此思路，提高親本蛋白Pro、Leu、Ala等氨基酸的含量有助于制得高活性的α-葡萄糖苷酶抑制肽。植物性蛋白來(lái)源中的薏仁醇溶蛋白（Pro所占摩爾比為8.21%～8.3%，Leu為16.64%～17.09%，Ala為11.03%～11.12%）[26]和菜籽餅粕蛋白（Pro含量為3 468.70 μg/100 mg，Leu為4 308.65 μg/100 mg，Ala為22 410.17 μg/100 mg）[27]，和富含Pro的魚類膠原蛋白[28]都可作為生產(chǎn)α-葡萄糖苷酶抑制肽的優(yōu)質(zhì)原材料，亟待開發(fā)與研究。

1.2 凈電荷、等電點(diǎn)、疏水性與α-葡萄糖苷酶抑制活性的關(guān)系

如表1所示，62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽凈電荷范圍在－4～＋3，其中高活性的多肽為0或＋1，與Ibrahim等[6]的結(jié)果一致。此外，高電荷肽AEEEYPDL（電荷為－4，IC50＝5 580 μmol/L）和CGKKFVR（電荷為＋3，IC50＝621.23μmol/L）的α-葡萄糖苷酶抑制活性遠(yuǎn)低于其他多肽，可見高電荷會(huì)大幅削弱其抑制活性。本文同時(shí)發(fā)現(xiàn)，多肽等電點(diǎn)對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制活性的影響微乎其微（Pearson相關(guān)系數(shù)r＝－0.160）。

根據(jù)相關(guān)性分析可知，疏水性與α-葡萄糖苷酶抑制活性的相關(guān)性較低（Pearson相關(guān)系數(shù)r＝0.207），Ibrahim等[6]也論證了這一點(diǎn)。但最近幾年的研究也表明，α-葡萄糖苷酶抑制肽與α-葡萄糖苷酶分子的結(jié)合存在大量疏水相互作用模式，在燕麥肽[25]、熒光假單胞菌環(huán)肽[46]和油麻子肽[48]的肽-酶結(jié)合模式中都證明了這一點(diǎn)。另外，其他非共價(jià)作用力也積極參與肽-酶作用過程，Mollica等[8]借助計(jì)算機(jī)輔助篩選出的4 個(gè)小肽均通過多種方式（氫鍵、親水相互作用、疏水相互作用、＆#x1d70b;-陽(yáng)離子相互作用）與α-葡萄糖苷酶相互作用。以上結(jié)果與多肽的親水/疏水性平衡、特有酸堿性質(zhì)（pH值和凈電荷）所支配的構(gòu)象能量平衡、結(jié)合位姿密切關(guān)聯(lián)。

2 α-葡萄糖苷酶抑制肽的安全性

2.1 毒性

基于ToxinPred服務(wù)器中1 805 個(gè)有毒肽、3 593 個(gè)無(wú)毒肽構(gòu)建肽數(shù)據(jù)集，采用支持向量機(jī)（suppport vector machine，SVM）監(jiān)督機(jī)器學(xué)習(xí)算法[49]（輸入SVM閾值＝0.0）對(duì)所選62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的毒性進(jìn)行預(yù)測(cè)，由表1可知，全部多肽均無(wú)毒。作為膳食蛋白制備的食源活性肽，對(duì)其安全性的評(píng)價(jià)仍存在爭(zhēng)議，尤其是利用新基底、新加工工藝和非消化酶配制及提取的新肽，其安全性在實(shí)驗(yàn)室階段尚未得到充分論證[50]。目前，除針對(duì)各腫瘤細(xì)胞的體外毒性實(shí)驗(yàn)外[51]，關(guān)于食物蛋白源形成毒性蛋白的證據(jù)有限，但通過對(duì)有毒活性肽的結(jié)構(gòu)參數(shù)進(jìn)行研究，現(xiàn)已初步了解到有毒活性肽的部分結(jié)構(gòu)特征?，F(xiàn)有的證據(jù)表明，有毒活性肽可能具有以下特征[49,52]：1）肽段中帶有LKL、KWK、FKK、KKLL和CYCR序列；2）肽段中出現(xiàn)以聚谷氨酰胺（poly Q）為基序的重復(fù)序列；3）肽段中出現(xiàn)以Cys為基序的蝎毒素樣結(jié)構(gòu)域（識(shí)別的基序?yàn)镃N37CN3-6CN0-5CN1-4CN4-13C，“C”表示Cys，“N”表示氨基酸，“3～7”表示氨基酸的潛在數(shù)量）的重復(fù)序列?；钚噪某哂猩鲜鼋Y(jié)構(gòu)表征而表現(xiàn)出毒害作用外，其服用劑量和持續(xù)服用時(shí)間等因素也不容忽視。研究表明，辣木籽蛋白源α-葡萄糖苷酶抑制肽KETTTIVR經(jīng)過軟件擬合預(yù)測(cè)并無(wú)毒性，但Wang Xuefeng等[53]在紅細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)當(dāng)多肽質(zhì)量濃度超過4 mg/mL時(shí)，細(xì)胞溶血率高達(dá)7.18%，表明其在高質(zhì)量濃度下可對(duì)紅細(xì)胞產(chǎn)生藥物毒性。綜上，即使本文發(fā)現(xiàn)α-葡萄糖苷酶抑制肽不含有毒肽的結(jié)構(gòu)特征，但如將α-葡萄糖苷酶抑制肽作為功能性產(chǎn)品干預(yù)T2DM，還需進(jìn)行系統(tǒng)和完整的體內(nèi)和臨床試驗(yàn)，以便進(jìn)一步保證其安全性。

2.2 致敏性

本文使用Allergen FP v.1.0服務(wù)器對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性進(jìn)行預(yù)測(cè)，該web服務(wù)器內(nèi)包含2 427 個(gè)過敏原和2 027 個(gè)非過敏原的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)集，數(shù)據(jù)集的蛋白質(zhì)中氨基酸序列由5 個(gè)E-描述符（E1：氨基酸疏水性；E2：氨基酸分子質(zhì)量；E3：氨基酸的螺旋形成傾向；E4：氨基酸相對(duì)豐度；E5：β鏈的形成傾向）所描述，同時(shí)使用自動(dòng)交叉協(xié)方差（auto-cross covariance，ACC）的蛋白質(zhì)序列挖掘工具[54]對(duì)數(shù)據(jù)集內(nèi)蛋白質(zhì)的序列長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)一，判別系數(shù)“Tanimoto”將蛋白質(zhì)區(qū)分為過敏原或非過敏原。通過上述預(yù)測(cè)模型，有35 條α-葡萄糖苷酶抑制肽被鑒定為潛在過敏原，這些多肽與數(shù)據(jù)集內(nèi)已知的過敏原具有類似的氨基酸組成或肽基序，并帶有抗原表位[55]。作為過敏原的蛋白或多肽（有B細(xì)胞表位）被免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）抗體識(shí)別并結(jié)合后觸發(fā)IgE與肥大細(xì)胞或嗜堿性粒細(xì)胞表面FcεR受體的交聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而激發(fā)免疫，釋放炎癥介質(zhì)、前列腺素和白三烯，進(jìn)而引發(fā)過敏[56]。由表1可知，被鑒定為過敏原的α-葡萄糖苷酶抑制肽鏈長(zhǎng)度在3～16范圍內(nèi)，以三肽、四肽、七肽和八肽為主。但一般來(lái)說(shuō)，過敏肽以長(zhǎng)鏈居多，短肽因缺乏三級(jí)結(jié)構(gòu)，IgE與FcεR受體的交聯(lián)能力較差，不易誘發(fā)過敏反應(yīng)[57]，Yap等[58]利用AlgPred在線平臺(tái)對(duì)180 條抗糖尿病肽進(jìn)行致敏性預(yù)測(cè)，篩選出了54 條過敏肽，鏈長(zhǎng)在12～23之間。目前沒有足夠的證據(jù)完整表述過敏肽的基序，現(xiàn)主要通過一些數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)待測(cè)肽段的過敏潛力進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，可用的數(shù)據(jù)庫(kù)包括Allergome（http://www.allergome.org/）、WHO/IUIS（http://www.allergen.org/）、過敏原蛋白結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（structural database of allergenic proteins，SDAP）（http://fermi.utmb.edu/SDAP/）、BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uwm.edu.pl/biochemia）和Allergen FP v.1.0在線平臺(tái)（www.ddg-pharmfac.net/AllergenFP/）等。例如，有研究者通過BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)成功預(yù)測(cè)了多條κ-酪蛋白過敏肽（RPKHPIKHQG、NENLLRFFVA和FFVAPFPEVFGK）[59]；Singh等[60]通過Allergen FP v.1.0在線平臺(tái)對(duì)玉米、大麥、小麥等谷物貯藏蛋白所制得的二肽（PF、AF、SF、QF、IF、KF、WA和WQ）進(jìn)行致敏性預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)均不存在過敏性。另外，從表1中可以觀察到，這35 條過敏肽中有12 條具有胃腸道消化酶抗性，比例達(dá)到1/3以上。有報(bào)道稱，具有胃腸道消化酶抗性的多肽更易引發(fā)機(jī)體過敏，原因在于胃腸道消化酶抗性肽一般具有緊湊結(jié)構(gòu)，保護(hù)了致敏抗原表位的完整構(gòu)象，尤其是當(dāng)肽段中帶有足夠數(shù)量的半胱氨酸時(shí)，由于其形成的二硫鍵所產(chǎn)生的強(qiáng)大空間位阻，不僅有助于阻止水解物的切割效應(yīng)，也會(huì)對(duì)過敏肽的抗原表位進(jìn)行保護(hù)[61]。

當(dāng)食物親本蛋白本身就是潛在過敏原時(shí)，該蛋白會(huì)攜帶能引發(fā)過敏等不良反應(yīng)的B細(xì)胞表位，其在活性肽制備過程中也不可避免地被釋放，但可以通過蛋白酶水解、菌種發(fā)酵、加熱、輻射、高靜水壓（high hydrostatic pressure，HHP）等方式[62]破壞IgE與表位的結(jié)合以降低食源蛋白的致敏性。主要原理是通過加工處理破壞抗原表位，或使表位構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而降低抗原性。目前對(duì)蛋白抗原性消減領(lǐng)域研究最多的是β-伴大豆球蛋白，已有文獻(xiàn)指出，熱處理[63]、HHP[64]、超高壓處理[65]均可通過改變?chǔ)?伴大豆球蛋白的二、三、四級(jí)結(jié)構(gòu)，影響其免疫原性，同時(shí)也暴露出更多的疏水區(qū)域，打斷其二硫鍵，有利于蛋白被消化酶水解，破壞多處線性抗原表位。盡管有研究指出，過敏源的主要特征（尤其是帶有過敏潛力的活性肽結(jié)構(gòu)特征）未被完整描述，但通過上述途徑可在一定程度上避免產(chǎn)生帶有致敏原性的活性肽。本文的分析結(jié)果提示未來(lái)在進(jìn)行α-葡萄糖苷酶抑制肽的研究時(shí)，需格外關(guān)注所制得α-葡萄糖苷酶抑制肽的致敏性。

3 α-葡萄糖苷酶抑制肽的生物利用度

3.1 胃腸道消化酶的抗性

采用Expasy在線平臺(tái)的“PeptideCutter”工具（https://web.expasy.org/peptide_cutter/）模擬胃腸道消化酶的水解，選用胃蛋白酶（pH 1.3）、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶對(duì)62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的消化酶抗性進(jìn)行考察，并通過BioPEP-UWM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://biochemia.uwm.edu.pl/biopep/start_biopep.php）的“搜索活性片段”功能將釋放的肽序列進(jìn)行生理活性匹配（表4）。α-葡萄糖苷酶抑制肽在進(jìn)入消化系統(tǒng)后，會(huì)面臨胃腸腔內(nèi)不穩(wěn)定環(huán)境和酶降解的生物屏障，pH值的波動(dòng)影響多肽的電離程度、降解作用和傳遞效率[66]，接觸的消化酶和肽酶主要有胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰彈性酶、羧肽酶A/B和刷邊肽酶（羧肽酶M和氨基肽酶A/N/P/W），切割后不可逆地改變多肽結(jié)構(gòu)和生物活性?；钚噪脑谖改c環(huán)境下的抗性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是肽段本身缺乏消化酶的切割位點(diǎn)；二是由于特定氨基酸殘基組成和序列干擾酶活性位點(diǎn)的空間或靜電排列，從而阻止酶切反應(yīng)的發(fā)生。本文所研究的α-葡萄糖苷酶抑制肽中有25 條對(duì)胃腸道消化酶耐受，其中鏈長(zhǎng)在3～7的肽段占76%，這25 條胃腸道消化酶抗性肽平均分子質(zhì)量為554.56 Da，且大部分肽段分子質(zhì)量在300～500 Da之間。大多數(shù)抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽含有P r o 殘基（如P G G P、QPHQPLPP和IPP等），推測(cè)Pro可通過環(huán)化鄰近氨基酸側(cè)鏈?zhǔn)蛊浠氐诫闹麈?，從而保證肽的剛性結(jié)構(gòu)，進(jìn)而限制蛋白水解酶對(duì)鄰近氨基酸殘基的切割作用[16]，考慮到電荷性質(zhì)、疏水性等特性，本文總結(jié)了關(guān)于胃腸道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽可能的結(jié)構(gòu)特征（圖2）：1）鏈長(zhǎng)3～7；2）分子質(zhì)量300～500 Da；3）pH 7.0時(shí)凈電荷為0或＋1；4）低疏水性；5）肽段中出現(xiàn)數(shù)量較多的Pro。上述歸納的具有胃腸道消化酶抗性的α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)與Ahmed等[67]總結(jié)的胃腸道內(nèi)穩(wěn)定肽（主要是ACE抑制肽、抗氧化肽）的序列特征一致，在符合胃腸道內(nèi)穩(wěn)定肽結(jié)構(gòu)特征普遍性的同時(shí)保證了胃腸道消化酶抗性α-葡萄糖苷酶抑制肽的獨(dú)特性。

表4 α-葡萄糖苷酶抑制肽的胃腸道消化酶抗性及裂解肽生物活性、Caco-2滲透性、腸道吸收率、生物利用度評(píng)分Table 4 Gastrointestinal digestive enzyme resistance, Caco-2 permeability, intestinal absorption rate, bioavailability scores of α-glucosidase inhibitory peptides

3.2 小腸黏液層的滲透

黏液層是覆蓋腸道上皮的保護(hù)性屏障，可分為外層黏液（松散黏液）和內(nèi)層黏液（堅(jiān)硬黏液）[68]，黏液屬于一種水凝膠，覆蓋有黏蛋白、脂類、細(xì)胞碎片和細(xì)菌等物質(zhì)[69]，該屏障主要通過兩種機(jī)制調(diào)控多肽滲透效率[70]：一是多肽與帶負(fù)電荷黏蛋白特異性結(jié)合；二是由黏蛋白纖維構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)阻隔多肽的滲透。其中，黏蛋白是黏液的主要功能成分，其主體構(gòu)成是質(zhì)量分?jǐn)?shù)占50%～80%的糖蛋白，由于其末端唾液酸和硫酸鹽基團(tuán)的存在，使黏蛋白在黏液中攜帶負(fù)電荷[71]。由于上述黏液層的特點(diǎn)使得親水性和帶凈正電荷的多肽在跨越該屏障時(shí)占優(yōu)勢(shì)（圖2）。Sun Xiaohong等[72]通過體外模型發(fā)現(xiàn)陽(yáng)離子肽（KIPAVF、KMPV）和高度親水的零電荷肽（MANT、TNGQ和PASL）與黏蛋白有強(qiáng)結(jié)合活性，而高疏水指數(shù)的未帶電肽（YMSV、QIGLF）與黏蛋白結(jié)合能力較弱。對(duì)照本文總結(jié)的α-葡萄糖苷酶抑制肽結(jié)構(gòu)特征，疏水性、0或＋1凈電荷狀態(tài)使α-葡萄糖苷酶抑制肽在黏液層滲透時(shí)會(huì)有阻力，今后可考慮搭配食品級(jí)滲透增強(qiáng)劑（檸檬酸、脂肪酸和殼聚糖等）[73]以提升其滲透效率。

3.3 腸道運(yùn)輸?shù)耐緩?/h3>

α-葡萄糖苷酶抑制肽在小腸黏膜處發(fā)揮α-葡萄糖苷酶抑制活性的同時(shí)，也具有對(duì)α-淀粉酶、DPP IV酶和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（glucose transporter，GLUT）家族等抗糖尿病靶標(biāo)的抑制功能，在體內(nèi)吸收并進(jìn)入體循環(huán)后通過多種途徑協(xié)同調(diào)控T2DM，這種現(xiàn)象已在體外抗T2DM靶酶活性抑制實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到了驗(yàn)證[19,74]。據(jù)此推測(cè)，未能與α-葡萄糖苷酶充分接觸并反應(yīng)的α-葡萄糖苷酶抑制肽可根據(jù)其分子質(zhì)量、氨基酸組成和凈電荷等結(jié)構(gòu)特征通過以下一種或多種途徑穿越小腸上皮細(xì)胞層進(jìn)入到下一循環(huán)，如PepT1介導(dǎo)的滲透、細(xì)胞旁運(yùn)輸、轉(zhuǎn)胞吞作用和被動(dòng)跨細(xì)胞擴(kuò)散。表5總結(jié)歸納了關(guān)于生物活性肽轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的特征信息[75]。在表4中，本文借助ADMETlab在線平臺(tái)預(yù)測(cè)了62 條α-葡萄糖苷酶抑制肽的Caco-2滲透性和腸道吸收率。其中，人腸道Caco-2細(xì)胞通常用于體外測(cè)定多肽的口服生物利用度，且為降低體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)的區(qū)間誤差，常采用Caco-2與分泌黏液的人結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞HT-29共培養(yǎng)[76]。如表4所示，4 個(gè)環(huán)肽Cyclo（PL）、Cyclo（PV）、Cyclo（PF）和Cyclo（HP）的Caco-2滲透性（推薦值：最佳lgPapp應(yīng)大于－5.15）和人體腸道吸收率明顯高于其他α-葡萄糖苷酶抑制肽，生物利用度評(píng)分也都在0.55的高水平。一般來(lái)說(shuō)，具有較強(qiáng)構(gòu)象彈性的環(huán)肽可通過細(xì)胞旁轉(zhuǎn)運(yùn)，并且其Caco-2細(xì)胞滲透性顯著高于線形肽，Pauletti等[77]的環(huán)六肽Ac-Trp-Ala-Gly-Gly-X-Ala-NH2細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)也證明了這一點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，鏈長(zhǎng)與表觀滲透系數(shù)（Papp）呈反比，Hong等[78]研究報(bào)道的Papp排序?yàn)镚ly-Sar＞Gly-SarSar＞Gly-Sar-Sar-Sar＞Gly-Sar-Sar-Sar-Sar，和Osborne等[79]報(bào)道β-酪啡肽-7（YPFPGPI）的Papp遠(yuǎn)低于β-乳球蛋白二肽（YL）都體現(xiàn)了這種關(guān)聯(lián)，但在本文分析中并未體現(xiàn)這一點(diǎn)，這可能涉及了其他因素（電荷、疏水性等）。多肽的氨基酸序列也會(huì)影響其生物利用度。具體來(lái)說(shuō)，C端氨基酸帶正電和N端出現(xiàn)Cys、Leu、Met、Pro、Val和Ile有助于提升其滲透性[80-81]。依據(jù)以上分析和各轉(zhuǎn)運(yùn)途徑特點(diǎn)，可在一定程度上了解并判斷已篩查的α-葡萄糖苷酶抑制肽所采用的轉(zhuǎn)運(yùn)途徑和轉(zhuǎn)運(yùn)效率，進(jìn)一步明確其在體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄（absorption, distribution, metabolism, excretion，ADME）情況（圖2）。

表5 生物活性肽在腸道上皮細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)Table 5 Transport of bioactive peptides in intestinal epithelial cells

3.4 代謝酶屏障

多肽通過腸屏障和抵抗P-gp后轉(zhuǎn)經(jīng)肝門靜脈系統(tǒng)，肝屏障中存在大量代謝酶，可針對(duì)性滅活親脂類物質(zhì)[82]。代謝酶屬于CYP-450家族，包括CYP1A2、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP3A4這些參與多肽代謝的人類CYP酶，其對(duì)分子的初級(jí)代謝起關(guān)鍵作用，整個(gè)過程被稱為首過代謝[83]。在這個(gè)過程中，多肽物質(zhì)通過CYP-450家族與功能性氧化酶混合反應(yīng)催化以實(shí)現(xiàn)多種官能團(tuán)羥基化，從而完成生物轉(zhuǎn)化[84]，期間涉及N—和O—脫烷基化、甲基化、乙?；土蛩峄确磻?yīng)，最終影響多肽的生物活性。但是，對(duì)于α-葡萄糖苷酶抑制肽在此階段生物利用度的研究明顯不足，作為進(jìn)入血液循環(huán)的關(guān)鍵一環(huán)，深入探究該屏障對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制肽活性的影響規(guī)律有助于闡明α-葡萄糖苷酶抑制肽作為多功能降糖肽的結(jié)構(gòu)潛力和應(yīng)用前景。

4 結(jié) 語(yǔ)

隨著T2DM患病率的逐年上升，近些年人們將對(duì)治療手段或替代藥物的關(guān)注放在天然食物活性成分的提取或制備上，食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽在預(yù)防和干預(yù)T2DM中已展現(xiàn)出巨大的潛力。明晰高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有助于更有效率、更有針對(duì)性地進(jìn)行食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽段的篩選，并進(jìn)一步分析和判斷其安全性、生物利用度等生物學(xué)特點(diǎn)。

盡管現(xiàn)階段關(guān)于高活性食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的結(jié)構(gòu)特征有一定的研究，但大都停留在氨基酸組成及排序、分子質(zhì)量、疏水性等結(jié)構(gòu)參數(shù)的單一解釋上，未建立起整合各結(jié)構(gòu)特性的構(gòu)效關(guān)系研究體系。研究肽-酶分子作用機(jī)制的工具主要借助于分子對(duì)接技術(shù)，未積累足夠數(shù)據(jù)填補(bǔ)生化實(shí)驗(yàn)與虛擬對(duì)接之間的信息誤差，未來(lái)研究可運(yùn)用X射線晶體學(xué)、表面等離子體共振等新興技術(shù)深入探究食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽與α-葡萄糖苷酶的作用模式。此外，在該類活性肽的研究與開發(fā)中，人們將目光集中到了制備工藝的優(yōu)化、活性的提升及作用機(jī)制的解析上，而忽視了對(duì)其安全性的評(píng)價(jià)和對(duì)毒性肽及過敏肽結(jié)構(gòu)特征的系統(tǒng)性總結(jié)，本文對(duì)該方面進(jìn)行了初步探討，但未深入討論食物蛋白提取、預(yù)處理和制備過程中導(dǎo)致肽的分解、外消旋和環(huán)化等其他情形，這些局限使其作為功能性食品或藥物的安全性和功效無(wú)法得到保證。目前，關(guān)于該抑制肽的活性研究雖較多，但均停留在體外驗(yàn)證階段，對(duì)體內(nèi)吸收部分未能充分考慮。其次，小腸上皮細(xì)胞刷狀緣是肽發(fā)揮活性的重要場(chǎng)所，在研究時(shí)易被忽視，外翻腸套實(shí)驗(yàn)可在體外模擬情況下顧及到該部位[24]，從而使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更接近人體真實(shí)情況。未來(lái)也需多關(guān)注食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽攝入后在胃腸道、小腸黏膜、小腸上皮細(xì)胞及肝臟代謝等過程中的活性保持、轉(zhuǎn)運(yùn)效率、代謝組學(xué)等情況，這不僅可以了解其在各轉(zhuǎn)運(yùn)階段降解、代謝及受損的狀況，也可為明確食源性α-葡萄糖苷酶抑制肽的多功能研究提供數(shù)據(jù)支撐，以促進(jìn)降糖肽的開發(fā)利用。