張齡予，潘麗佳，侯蘇芯，姜 姍，楊 梅，曹家楨，徐曉紅,*，張 楠,*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春 130117；2.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林 長春 130117；3.長春中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，吉林 長春 130117）

腸道微生態(tài)系統(tǒng)是人體中重要的微生態(tài)系統(tǒng)，具有種類多樣、數(shù)量巨大的微生物群落，其生物多樣性和群落分布結(jié)構(gòu)與宿主的飲食習(xí)慣、身體發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)狀態(tài)等方面相互影響。隨著對腸道微生物環(huán)境研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其與人體多種免疫性疾病密切關(guān)聯(lián)[1]。許多代謝產(chǎn)物通過腸道菌群的多種代謝作用產(chǎn)生，包括脂多糖、膽汁酸、色氨酸及其衍生物以及短鏈脂肪酸（shortchain fatty acid，SCFAs）。這些代謝產(chǎn)物作用于免疫應(yīng)答，促進(jìn)或者抑制宿主的免疫功能。腸道菌群與宿主的免疫功能之間具有較復(fù)雜的關(guān)聯(lián)機(jī)制，在免疫功能的調(diào)節(jié)中腸道菌群及其代謝產(chǎn)物發(fā)揮著重要作用[2-3]。但腸道微生物與宿主的免疫調(diào)節(jié)相互作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步的確認(rèn)與深入探究。

藍(lán)靛果（Lonicera caeruleaL.var.edulisTurcz.ex Herd.）是一種忍冬科忍冬屬藍(lán)果忍冬的變種植物，又名藍(lán)靛果忍冬、黑瞎子果、山茄子果等。藍(lán)靛果多酚（L.caeruleaberry polyphenols，LCBP）是藍(lán)靛果中一類重要的活性成分，包括花青素類和花色苷類、酚酸類、黃酮-3-醇類、黃酮醇類、黃酮類化合物等[4]。研究顯示，藍(lán)靛果具有保護(hù)心臟神經(jīng)、抗菌、抗炎等多種藥理活性[5]，LCBP被認(rèn)為是這些生物活性的主要有效成分[6-8]。目前吉林省藍(lán)靛果的種植面積廣、產(chǎn)量高，藍(lán)靛果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對藍(lán)靛果的綜合利用水平與作用機(jī)制的深入研究提出了更高的要求。

本研究采用環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CTX）誘導(dǎo)構(gòu)建小鼠免疫抑制病理模型，基于PacBio Sequel第三代微生物16S rRNA高通量測序平臺(tái)檢測LCBP干預(yù)后模型小鼠結(jié)腸內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)變化，結(jié)合血液中免疫細(xì)胞指標(biāo)、結(jié)腸病理組織學(xué)觀察與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）測定腸道內(nèi)SCFAs含量，探討LCBP對免疫抑制模型小鼠的免疫功能調(diào)節(jié)與腸道菌群分布的影響。本研究基于以往對于LCBP的免疫調(diào)節(jié)功效研究，加入了腸道菌群調(diào)節(jié)功效考察指標(biāo)，將腸道微環(huán)境調(diào)節(jié)與免疫功能調(diào)節(jié)相結(jié)合進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，以期推進(jìn)藍(lán)靛果深加工產(chǎn)業(yè)的科學(xué)化發(fā)展，延長藍(lán)靛果產(chǎn)業(yè)鏈，進(jìn)而促進(jìn)吉林省的生態(tài)環(huán)境高水平保護(hù)和區(qū)域經(jīng)濟(jì)高質(zhì)量發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

8 周齡體質(zhì)量20 g左右的清潔級(jí)雄性ICR小鼠由長春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供（生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（吉）-2020-0002），飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)過程均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)程操作。

藍(lán)靛果由吉林良好興峰農(nóng)業(yè)科技有限公司贈(zèng)送。

注射用CTX 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；SCFAs標(biāo)準(zhǔn)品（乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸） 上海麥克林生化科技有限公司；福林-酚試劑、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

N1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司；BM830全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀 北京寶靈曼陽光科技有限公司；GC-三重四極桿質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；FC5515R臺(tái)式冷凍離心機(jī) 奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；IX73光學(xué)顯微鏡 奧林巴斯（北京）銷售服務(wù)有限公司；FDU-2110冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社；1-14小型臺(tái)式離心機(jī) 德國Sigma公司；ME204型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；IDA-2000數(shù)字醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng) 北京空?？萍及l(fā)展有限公司；UV 1800型紫外-可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 LCBP提取物凍干粉的制備

參考Wu Shusong等[9]的方法提取LCBP樣品。取凍鮮藍(lán)靛果，加入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液作為提取溶劑，料液比為1∶4，避光超聲提取2 次，每次30 min，合并提取液，6 000 r/min離心15 min，取上清液于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，－80 ℃真空冷凍干燥72 h，得到LCBP提取物凍干粉。

1.3.2 LCBP提取物凍干粉總多酚含量的測定

參考王海坤等[10]的方法，采用福林-酚比色法測定藍(lán)靛果提取物中總多酚的含量。精密稱量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品5 mg，配制成0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密量取1、2、3、4、5 mL加水定容至10 mL。分別精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液200 μL，加入福林-酚試劑1 mL，搖勻，反應(yīng)5 min后，加入800 μL 7.5%碳酸鈉溶液，室溫避光反應(yīng)2 h，于765 nm波長處測定吸光度。精密稱取LCBP凍干粉0.1 g，加水定容至25 mL，稀釋5 倍體積，按照上述方法操作，于765 nm波長處測定樣品溶液的吸光度。以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以純水為空白溶液，線性回歸方程為：y＝13.934x－0.252 1，R2＝0.995 7，線性范圍為0.02～0.10 mg/mL，線性良好。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算，藍(lán)靛果提取物凍干粉中總多酚含量為（54.63±0.21）mg/g。

1.3.3 動(dòng)物分組處理

將32 只清潔級(jí)ICR小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為4 組，每組8 只，分別為空白對照組（KC組）、模型組（MC組）、LCBP低劑量組、LCBP高劑量組。參考Liu Yingjuan[11]、Qi Zeng[12]等的方法，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，空白對照組和MC組每天灌胃生理鹽水；LCBP低劑量組每天灌胃LCBP提取物，給藥量為150 mg/（kgmb·d），相當(dāng)于LCBP 8.20 mg/（kgmb·d）；L C B P 高劑量組每天灌胃L C B P 提取物，給藥量為500 mg/（kgmb·d），相當(dāng)于LCBP 27.32 mg/（kgmb·d）。4 組小鼠灌胃量均為0.1 mL/10 gmb，連續(xù)21 d。除空白對照組外，其余各組分別于17、19 d和21 d進(jìn)行腹腔注射CTX（80 mg/（kgmb·d）），構(gòu)建免疫抑制小鼠模型。末次給藥24 h后，對所有小鼠進(jìn)行眼球采血并保存。無菌條件下稱取小鼠結(jié)腸末端的成型糞便0.3 g置于凍存管中，－80 ℃超低溫儲(chǔ)存，分析待用。

1.3.4 指標(biāo)測定

根據(jù)組織病理考察、免疫器官指數(shù)與血液免疫指標(biāo)篩選LCBP起效劑量，對有效劑量組進(jìn)行腸道內(nèi)容物的16S rRNA高通量測序與糞便SCFAs含量測定，對LCBP對機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)與腸道菌群調(diào)節(jié)作用進(jìn)行聯(lián)合分析。

1.3.4.1 小鼠一般狀態(tài)觀察與記錄

觀察并記錄各組小鼠給藥前后及造模后皮毛色澤、進(jìn)食量、自主活動(dòng)等一般狀態(tài)。

1.3.4.2 免疫器官指數(shù)測定

實(shí)驗(yàn)第21天灌胃給藥24 h后，對小鼠進(jìn)行摘眼球取血，采用頸椎脫臼法處死。摘取小鼠脾臟與胸腺，濾紙吸干水分后稱質(zhì)量，按下式計(jì)算臟器指數(shù)（胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)）。

式中：A為脾臟指數(shù)/胸腺指數(shù)；m為脾臟/胸腺質(zhì)量/mg；m0為小鼠體質(zhì)量/g。

1.3.4.3 血液免疫指標(biāo)測定

第21天灌胃給藥24 h后，對小鼠進(jìn)行摘眼球取血，血液置于2 mL抗凝離心管中，根據(jù)全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測要求，檢測抗凝血中的白細(xì)胞（white blood cell，WBC）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）、淋巴細(xì)胞（lymphocyte，LYM）、血小板（platelet，PLT）、中性粒細(xì)胞（neutrophil，NEU）水平，記錄數(shù)據(jù)并分析。

1.3.4.4 結(jié)腸組織病理考察

小鼠處死后，取結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛溶液中固定保存48 h，采用乙醇對組織進(jìn)行常規(guī)病理脫水處理，將組織浸入無水乙醇與二甲苯混合液直至透明后浸蠟、包埋、切片、蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸形態(tài)變化。

1.3.4.5 盲腸內(nèi)容物微生物16S rRNA高通量測序

基于PacBio Sequel平臺(tái)進(jìn)行小鼠盲腸內(nèi)容物中微生物的DNA高通量測序。對樣品進(jìn)行Beta多樣性和Alpha物種多樣性分析，計(jì)算得出各樣品的Ace、Chao1、Shannon及Simpson指數(shù)，根據(jù)微生物分類特征對樣品進(jìn)行分類學(xué)分析，繪制門、屬分類學(xué)水平物種分布柱狀圖，尋找具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物。

1.3.4.6 糞便中SCFAs水平的測定

樣品預(yù)處理：用GC-MS法檢測糞便中SCFAs含量，將－80 ℃凍存的糞便置于4 ℃下解凍，精密稱取100 mg，加入2 mL超純水，渦旋振蕩混勻，4 ℃條件下14 000 r/min離心15 min，取上清液，加入50%濃硫酸，調(diào)節(jié)pH值為1～2，4 ℃孵育30 min，偶爾搖勻。經(jīng)無水乙醚萃取后，相同條件下離心取上清液。上清液經(jīng)氮?dú)獯蹈珊蠹尤胝和閺?fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜，用于GC-MS分析。

標(biāo)準(zhǔn)品的處理：精密吸取乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸標(biāo)準(zhǔn)品，用正己烷配制成不同質(zhì)量濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.001～0.010 mg/mL），過0.22 μm微孔濾膜，用于GC-MS分析。

G C 條件： 色譜柱為D B - H e a v y W A X（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序?yàn)槌跏紲囟?0 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至120 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min；載氣為氮?dú)?；進(jìn)樣口溫度為270 ℃；載氣流速為2 mL/min；進(jìn)樣量1.0 μL；進(jìn)樣方式為不分流進(jìn)樣；檢測器（氫焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID））溫度280 ℃。

MS條件：電子轟擊離子源；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度250 ℃；電子能量70 eV；掃描模式為全掃描；質(zhì)量掃描范圍m/z30～500。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，采用SPSS 20.0軟件的單因素方差分析（One-way ANOVA）和Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P＜0.05代表差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠一般狀態(tài)

各組小鼠給藥前的狀態(tài)基本無區(qū)別。給藥后，空白對照組小鼠表現(xiàn)為毛色正常且有光澤、行動(dòng)敏捷、腰背平直、眼睛明亮、進(jìn)食量良好；LCBP高劑量組小鼠出現(xiàn)進(jìn)食量增加的現(xiàn)象。第17天開始造模后，MC組小鼠出現(xiàn)了輕微的精神萎靡、皮毛疏松、食欲不振、外形消瘦等現(xiàn)象。LCBP高、低劑量組的小鼠較MC組狀態(tài)均得到不同程度的改善，進(jìn)食量趨于正常，精神狀態(tài)良好。

2.2 LCBP對小鼠免疫器官指數(shù)的影響

脾臟和胸腺是人體主要的免疫器官，其對應(yīng)臟器指數(shù)的變化可以反映機(jī)體免疫能力的變化[13]。由表1可知，與空白對照組比較，MC組小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），說明小鼠的免疫抑制模型造模成功；與MC組相比，LCBP低劑量組小鼠的脾臟指數(shù)顯著增加（P＜0.05），LCBP高劑量組小鼠的脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)均極顯著增加（P＜0.01）且接近空白對照組，說明LCBP對免疫抑制小鼠的免疫器官有一定的保護(hù)和促進(jìn)功能恢復(fù)的作用，其中高劑量LCBP作用顯著。

表1 LCBP對免疫抑制小鼠免疫器官指數(shù)的影響Table 1 Effect of LCBP on immune organ indexes of immunosuppressed mice

2.3 LCBP對免疫抑制小鼠血液免疫指標(biāo)的影響

由表2可知，MC組小鼠WBC、RBC、LYM、PLT、NEU水平均低于空白對照組（P＜0.05、P＜0.01），其中W B C、LY M 水平極顯著下降（P＜0.0 1），提示免疫抑制模型造模成功。給藥21 d后，LCBP低劑量組小鼠的WBC、LYM、PLT水平相較MC組均有所回升（P＜0.05），RBC、NEU水平較MC組無顯著差異；LCBP高劑量組小鼠的WBC、RBC、LYM、PLT、NEU水平較MC組均有所回升（P＜0.05、P＜0.01），其中WBC、LYM、PLT極顯著回升（P＜0.01）。由此可知，LCBP能夠提升機(jī)體免疫功能細(xì)胞水平，其中高劑量LCBP作用顯著。

表2 LCBP對免疫抑制小鼠血液生化指標(biāo)的影響Table 2 Effect of LCBP on blood biochemical indicators of immunosuppressed mice

2.4 病理學(xué)觀察結(jié)果

由圖1可以看出，空白對照組小鼠結(jié)腸形態(tài)正常，杯狀細(xì)胞和U型隱窩數(shù)量較多，腺體分布整齊，炎癥細(xì)胞浸潤及滲出程度低。MC組小鼠的杯狀細(xì)胞和U型隱窩明顯減少，腺體排列無序且發(fā)生變形，可見炎性細(xì)胞浸潤，黏膜充血水腫。與MC組相比，LCBP低劑量組小鼠杯狀細(xì)胞和U型隱窩有所增多，腺體排列較整齊，水腫減輕，炎癥細(xì)胞浸潤減少；LCBP高劑量組小鼠已經(jīng)表現(xiàn)出正常杯狀細(xì)胞和U型隱窩，腺體排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤明顯變少。說明LCBP可減輕CTX引起的小鼠腸道組織損傷，其中高劑量LCBP作用明顯。

圖1 小鼠結(jié)腸組織HE染色（20×）Fig.1 HE stained colonic tissue in mice (20 ×)

2.5 16S rRNA測序結(jié)果

2.5.1 腸道菌群Beta多樣性分析

維恩圖能夠展示組間的共有及特有特征操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)目，直觀地表現(xiàn)出組間特征的重合與區(qū)分情況[14]。由圖2可知，空白對照組、MC組、LCBP高劑量組（以下簡稱LCBP組）3 組小鼠共分析得到OTU物種447 個(gè)，空白對照組腸道菌群中共得到413 個(gè)OTU，MC組中共得到373 個(gè)OTU，LCBP組共得到378 個(gè)OTU，3 組共有物種數(shù)目311 個(gè)；空白對照組特有物種數(shù)目21 個(gè)，MC組和LCBP組特有物種數(shù)目均為10 個(gè)。通過OTU數(shù)目分布分析得到，免疫抑制模型造成了小鼠腸道菌群數(shù)量的減少，而LCBP組小鼠的腸道菌群豐度有一定的回升，由此得出LCBP對免疫抑制小鼠腸道菌群的豐度具有正向調(diào)節(jié)作用。

圖2 小鼠腸道菌群維恩圖Fig.2 Venn diagram of intestinal microflora in mice

2.5.2 腸道菌群Alpha多樣性分析

Alpha多樣性反映單個(gè)樣品物種豐度及物種多樣性，有多種衡量指標(biāo)：Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)可用于衡量物種豐度；Simpson指數(shù)用于評(píng)價(jià)物種多樣性[15]。Simpson指數(shù)在0～1之間，0表示無限接近多樣，1表示沒有多樣性。

由圖3可知，空白對照組小鼠腸道菌群Ace、Chao1指數(shù)均高于MC組、LCBP組，但LCBP組小鼠腸道菌群的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)較MC組均有所回升，說明LCBP對免疫抑制小鼠腸道菌群總體豐度的升高起到了促進(jìn)作用。MC組小鼠腸道菌群的數(shù)量最少，但是Simpson指數(shù)與Shannon指數(shù)最高，這說明MC組小鼠腸道菌群的均勻度較LCBP組與空白對照組有所升高，可能與有益菌豐度降低、致病菌豐度升高有關(guān)。

圖3 小鼠腸道菌群的Alpha多樣性Fig.3 Alpha diversity of intestinal microflora in mice

2.5.3 腸道菌群構(gòu)成分析

2.5.3.1 小鼠糞便樣本在門水平的菌群豐度及差異

從細(xì)菌門水平分析（圖4A），相對豐度最高的10 個(gè)菌群分別為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、ε-變形菌綱（E p s i l o n b a c t e r a e o t a）、軟壁菌門（Tenericutes）、變形菌門（Proteobacteria）、脫鐵桿菌門（D e f e r r i b a c t e r i a）、狄氏副擬桿菌（Patescibacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria），其中，厚壁菌門和擬桿菌門為腸道的優(yōu)勢菌群，相對豐度占比約80%以上。擬桿菌門可通過Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）誘導(dǎo)次級(jí)免疫應(yīng)答反應(yīng)進(jìn)而調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）炎癥因子的釋放。厚壁菌門包括眾多有益菌，其中乳酸桿菌是一種常見于酸奶和其他發(fā)酵乳制品中的益生菌。厚壁菌門微生物代謝產(chǎn)生乙酸鹽、乳酸鹽等短鏈脂肪酸鹽，可調(diào)整腸道內(nèi)共生菌群比例，減輕腸道炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡[15-16]。本研究中，與空白對照組比較，MC組小鼠的厚壁菌門、ε-變形菌綱、變形菌門、狄氏副擬桿菌、放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門的相對豐度降低。其中MC組小鼠糞便中厚壁菌門的相對豐度較空白對照組降低了46.2%，而其在LCBP組中的平均豐度較MC組提高了28.23%；擬桿菌門在MC組小鼠糞便中相對豐度較空白對照組提升了98.63%，而經(jīng)過LCBP干預(yù)后其相對豐度較MC組降低了16.90%。通過對各組樣品中厚壁菌門與擬桿菌門相對豐度的對比分析發(fā)現(xiàn)，免疫抑制小鼠腸道中的F/B值（F為厚壁菌門的豐度值；B為擬桿菌門的豐度值）由空白對照組的3.40降低到了0.92，LCBP干預(yù)后F/B值提高到1.41。結(jié)果表明，LCBP可能通過提升厚壁菌門的相對豐度，同時(shí)降低擬桿菌門的相對豐度，以達(dá)到調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)的正向作用；其通過提升F/B值增加有益菌比例，從而增加有益菌代謝產(chǎn)物豐度，降低腸道內(nèi)炎癥反應(yīng)，促進(jìn)免疫功能的正向調(diào)節(jié)。這與2.5.2節(jié)中菌群結(jié)構(gòu)分析的結(jié)論相一致。

圖4 門水平（A）及屬水平（B）的小鼠腸道菌群相對豐度Fig.4 Relative abundance of intestinal microflora in mice at phylum (A)and genus (B) levels

2.5.3.2 小鼠糞便樣本在屬水平上的菌群豐度及差異

從圖4 B 細(xì)菌屬水平上分析，相對豐度排名前10 位的菌屬有乳桿菌屬（Lactobacillus）、未培養(yǎng)的Muribaculaceae、艾克曼菌屬（Akkermansia）、疣微菌科UGG-014（Ruminococcaceae UGG-014）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、螺桿菌屬（Helicobacter）、未培養(yǎng)的毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、擬桿菌屬（Bacteroides）、臭桿菌屬（Odoribacter）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）。疣微菌科UCG-014可調(diào)節(jié)脂類代謝，并調(diào)節(jié)肥胖相關(guān)及胃腸道穩(wěn)態(tài)相關(guān)的有益共生菌數(shù)量[17]。擬桿菌屬為革蘭氏染色陰性的桿菌，在機(jī)體免疫紊亂或免疫抑制的生理狀態(tài)下，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)源性感染[18]。乳桿菌屬是有益于宿主健康的微生物，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生乳酸，維護(hù)人體健康和調(diào)節(jié)免疫功能[19]。從圖4B可知，與空白對照組相比，MC組小鼠糞便中的有益共生菌（包括乳桿菌屬、疣微菌科UCG-014、螺桿菌屬）的豐度均明顯下降，其中乳桿菌屬的豐度降低幅度最大，為50.72%；艾克曼菌屬、擬桿菌屬、狄氏副擬桿菌屬的豐度較空白對照組明顯增加，其中艾克曼菌屬的相對豐度由空白對照組的0.04%升高至14.81%。而LCBP組小鼠糞便中上述菌屬的相對豐度則趨于向接近空白對照組水平變化。與MC組相比，LCBP組小鼠糞便中的乳桿菌屬相對豐度升高，說明LCBP通過調(diào)節(jié)益生菌及致病菌的分布進(jìn)而影響胃腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)。

2.5.4 組間差異顯著性分析結(jié)果

三元相圖可以直觀地顯示出不同物種在各組中的比重和關(guān)系。三角形的3 個(gè)邊分別代表3 個(gè)組，可以度量相應(yīng)組別的物種豐度。本研究通過Python軟件作圖腳本制作三元相圖展示空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中不同腸道菌群的比重與關(guān)系。從圖5中可以看出，在門水平上，3 組小鼠糞便中豐度最高的5 個(gè)物種為：ε-變形菌綱（Epsilonbacteraeota），其在空白對照組、MC組、LCBP組中占比分別為0.428、0.237、0.334；疣微菌門（Verrucomicrobia），其在空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中占比分別為0.002、0.608、0.390；擬桿菌門（Bacteroidetes），其在空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中占比分別為0.216、0.428、0.356；軟壁菌門（Tenericutes），其在空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中占比分別為0.243、0.404、0.353；厚壁菌門（Firmicutes），其在空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中的占比分別為0.449、0.242、0.310。其中疣微菌門只在MC組和LCBP組小鼠糞便中出現(xiàn)，艾克曼菌屬歸屬于疣微菌門，其有助于維持消化道健康，其生理活性包括降低糖尿病、炎癥及肥胖等疾病的患病概率，用CTX造模后可能使疣微菌門菌群失調(diào)，進(jìn)而激發(fā)了機(jī)體的免疫反應(yīng)[20-21]。

圖5 小鼠腸道菌群的三元相圖分析Fig.5 Ternary phase diagram analysis of intestinal microflora in mice

表3 6 種SCFAs的GC-MS分析Table 3 GC-MS analysis of six SCFAs

三元相圖分析結(jié)果顯示，空白對照組、MC組、LCBP組小鼠糞便中的腸道菌群分布均發(fā)生了改變，與空白對照組比較，MC組小鼠糞便中的ε-變形菌綱、厚壁菌門相對豐度明顯降低，而疣微菌門、擬桿菌門和軟壁菌門的相對豐度升高。相比于MC組，LCBP組小鼠糞便中這5 種細(xì)菌相對豐度均趨向于接近空白對照組水平變化。上述細(xì)菌群落組成與圖4中的結(jié)果一致。

2.6 小鼠糞便SCFAs質(zhì)量濃度的測定結(jié)果

SCFAs是指碳原子數(shù)量小于6的羧酸，是腸道微生物的一類重要代謝產(chǎn)物，SCFAs可以作為結(jié)腸、回腸細(xì)胞的能量來源，也可以調(diào)控腸上皮細(xì)胞的屏障與防御功能，其中腸道中含量最高的3 種SCFAs分別為乙酸、丙酸和丁酸[22]，其是細(xì)菌發(fā)酵多糖過程的最終產(chǎn)物，構(gòu)成了腸道環(huán)境的基本部分，有助于腸功能的調(diào)節(jié)，也可以保護(hù)結(jié)腸的生理狀態(tài)，它們（特別是丁酸）還對上皮生長有刺激作用，被刺激的細(xì)胞為腸黏膜提供能量來源；SCFAs通過降低腸道pH值來阻止腸道中致病菌的復(fù)制，因此也抑制了感染性疾病的發(fā)展[23]。SCFAs具有調(diào)節(jié)先天免疫的功能，可以影響免疫細(xì)胞（巨噬細(xì)胞、NEU和樹突狀細(xì)胞）向外周募集[24]。SCFAs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS總離子流圖及分析結(jié)果分別如圖6、表3所示。由圖7可知，免疫抑制小鼠的SCFAs總量由空白對照組的1.66 mg/mL降低至0.83 mg/mL（P＜0.01），LCBP干預(yù)后，小鼠糞便中的SCFAs總量回升至1.83 mg/mL（P＜0.01），表明免疫抑制模型小鼠糞便結(jié)腸內(nèi)SCFAs含量明顯降低，LCBP可能通過干預(yù)SCFAs含量變化從而調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能。腸道微生物菌群能夠刺激免疫系統(tǒng)的正常發(fā)育，并在免疫細(xì)胞的成熟過程中發(fā)揮著重要作用，乙酸是一種雙歧桿菌高產(chǎn)的SCFAs，通過刺激G蛋白偶聯(lián)受體43抗體（G protein-coupled receptor 43，GPR43）調(diào)節(jié)腸道炎癥，幫助維持腸道上皮屏障功能[25-27]。SCFAs可調(diào)節(jié)T細(xì)胞和B細(xì)胞的分化及其介導(dǎo)的抗原特異性適應(yīng)性免疫[28]。此外，SCFAs是脂類合成的原料，具有調(diào)節(jié)能量穩(wěn)態(tài)和能量代謝的潛在作用[29]。研究表明，丁酸可抑制組蛋白去乙?；M(jìn)而影響樹突狀細(xì)胞的分化成熟[30-31]；同時(shí)，丁酸還可以抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的募集，最終調(diào)節(jié)WBC轉(zhuǎn)運(yùn)，抑制單核細(xì)胞的樹突狀細(xì)胞中趨化因子的表達(dá)[32-35]。在NEU中，SCFAs（丁酸）的存在降低了細(xì)胞模型中趨化受體（C5A過敏毒素趨化因子受體（C5a anaphylatoxin chemotactic receptor，C5AR））和磷酸化細(xì)胞表面趨化因子受體2抗體（chemokine(C-X-C motif) receptor 2，CXCR2）的表達(dá)，并通過G蛋白偶聯(lián)受體GPR43抑制NEU在體內(nèi)的趨化[36]。如圖7所示，CTX導(dǎo)致免疫抑制后小鼠結(jié)腸內(nèi)的6 種SCFAs質(zhì)量濃度均有一定程度的下降，其中乙酸、丙酸、異丁酸、異戊酸4 種SCFAs的質(zhì)量濃度較空白對照組極顯著降低（P＜0.01），LCBP干預(yù)后，6 種SCFAs的質(zhì)量濃度較MC組均提高，其中，丙酸、異丁酸、正丁酸3 種SCFAs的質(zhì)量濃度極顯著增加（P＜0.01）。結(jié)果表明，LCBP可調(diào)節(jié)腸道菌群分泌SCFAs水平，從而調(diào)節(jié)腸道的上皮屏障功能以及免疫細(xì)胞的募集程度，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)。

圖6 6 種SCFAs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS總離子流圖Fig.6 Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) total ion current (TIC) chromatogram of mixed standard solution of six SCFAs

圖7 各組小鼠結(jié)腸中SCFAs質(zhì)量濃度變化Fig.7 Colonic levels of SCFAs in mice from three groups

3 討 論

機(jī)體的整體狀態(tài)影響著其免疫功能，免疫功能的強(qiáng)弱與機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及平衡與否有著必然的內(nèi)在聯(lián)系，而免疫功能又受到腸道微生態(tài)的直接影響。腸道有大量的淋巴組織，腸道內(nèi)壁是機(jī)體最大的免疫器官，腸道菌群主要通過影響?zhàn)つっ庖哌M(jìn)而影響免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展[37]。多酚可以促進(jìn)細(xì)胞免疫反應(yīng)，除了抗菌、抗病毒功能外，其還在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以將自然免疫應(yīng)答與適應(yīng)性免疫應(yīng)答聯(lián)系起來，促進(jìn)自然免疫細(xì)胞對病原體的識(shí)別，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答的產(chǎn)生[38]。本研究以LCBP作為研究對象，采用CTX誘導(dǎo)構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，基于PacBio Sequel第三代微生物16S rRNA高通量測序平臺(tái)考察LCBP對小鼠結(jié)腸內(nèi)微生物菌群結(jié)構(gòu)分布的影響，結(jié)合血液中免疫細(xì)胞指標(biāo)、結(jié)腸病理組織學(xué)觀察與腸道內(nèi)SCFAs質(zhì)量濃度的測定探究LCBP對免疫抑制模型小鼠免疫功能調(diào)節(jié)與腸道菌群分布的影響。結(jié)果表明，LCBP能夠顯著提高免疫抑制小鼠的免疫器官（胸腺、脾臟）指數(shù)以及血液中免疫細(xì)胞的水平；改善免疫抑制病理狀態(tài)下結(jié)腸組織的炎性等損傷狀態(tài)，增加免疫抑制小鼠腸道菌群的多樣性，改善有益有害菌群分布比例，促進(jìn)厚壁菌門、ε-變形菌綱、變形菌門、狄氏副擬桿菌、放線菌門和藍(lán)細(xì)菌門的生長，抑制擬桿菌門的增殖；顯著提高免疫抑制小鼠體內(nèi)的SCFAs總量，并使乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、正戊酸、異戊酸6 種SCFAs的質(zhì)量濃度顯著提高。因此，LCBP可能通過調(diào)節(jié)腸道的上皮屏障功能以及免疫細(xì)胞的募集程度，進(jìn)而調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫狀態(tài)。本研究為植物多酚對人體腸道內(nèi)環(huán)境的調(diào)節(jié)提供了理論依據(jù)，同時(shí)為機(jī)體免疫調(diào)節(jié)與腸道環(huán)境的關(guān)聯(lián)性研究提供了新的思路與證據(jù)，為藍(lán)靛果應(yīng)用于食品、保健食品、特殊醫(yī)學(xué)用途食品等領(lǐng)域提供了科學(xué)依據(jù)，為益生元產(chǎn)業(yè)中多酚的應(yīng)用提供了新的方向。本研究通過GC-MS檢測技術(shù)對腸道微生物的代謝產(chǎn)物SCFAs進(jìn)行檢測，并探索了其與宿主免疫功能的關(guān)聯(lián)性，確認(rèn)二者存在關(guān)聯(lián)，但對其他腸道微生物類代謝產(chǎn)物的功能仍需進(jìn)一步探究。