左云洋，胡 萍*，許浩翔，馮丹丹，石媛媛，李久長，王 令，魏茂洋

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽 550025）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種全球性疾病[1]，屬于炎癥性腸病，與環(huán)境、遺傳、心理和自身免疫等多種因素有關(guān)[2]。UC患者會出現(xiàn)腹痛、便血等癥狀，并且治療后會反復發(fā)作，給人生理和心理健康帶來巨大負擔[3-4]。目前關(guān)于UC的發(fā)病機制還未明確，也沒有針對該病的有效治療方式，但已有許多學者認為炎癥因子的干擾、氧化應激的影響和腸道屏障的破壞在UC病理生理學中有重要作用[5-6]。據(jù)報道，UC在我國發(fā)病率逐漸升高[7]，因此迫切需要開發(fā)安全有效的針對UC預防和治療的功能性產(chǎn)品。

利用乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）發(fā)酵果蔬汁是目前的研究熱點[8]，通過發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸、脂肪酸、維生素和有機酸等具有良好營養(yǎng)價值的物質(zhì)[9]。許多研究證明一些具有益生功能的LAB與發(fā)酵物具有抗氧化、抗炎癥等功效，并證實對UC有一定的改善作用[10-12]。刺梨（Rosa roxburghiiTratt.）含有豐富的活性物質(zhì)，尤其富含VC、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、多酚、多糖、黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫和改善糖尿病等功能特性[13-15]。但目前對刺梨及其加工產(chǎn)品輔助治療腸炎的研究還較少。本課題組前期自傳統(tǒng)侗族發(fā)酵酸肉中篩選出LAB——副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）SR10-1（以下簡稱SR10-1），采用其發(fā)酵刺梨汁（Rosa roxburghiiTratt.juice，RRTJ），經(jīng)研究證實該發(fā)酵液具有α-葡萄糖苷酶抑制活性，且SR10-1具有較強的耐酸性和較好的發(fā)酵性能[16-17]。本研究采用SR10-1發(fā)酵刺梨汁（LAB-RRTJ）為研究對象，通過評價其抗炎能力、抗氧化能力及其對腸道屏障相關(guān)基因表達水平的影響，研究LAB-RRTJ對UC緩解效果，為刺梨功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺梨鮮果購于貴州省龍里縣刺梨種植基地，置于－4 ℃冰箱冷藏備用；副干酪乳桿菌SR10-1由本實驗室分離篩選自侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉，菌種保藏號：CCTCC No.M2016527。

SPF級昆明雄性小鼠，5～6 周齡，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2019-0010，飼養(yǎng)環(huán)境溫度（23±1）℃、相對濕度50%～60%，并保持每天光照和黑暗時間各半，自由攝食取水。該研究由貴州大學實驗動物倫理分委員會批準，申請編號：EAE-GZU-2022-E003。

MRS培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS） 美國MP Biomedicals公司；美沙拉嗪腸溶片 佳木斯鹿靈制藥有限公司；白細胞介素（interleukin，IL）6、IL-1β、IL-10、IL-17A、干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒，以及BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、SOD、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測試劑盒 泉州市睿信生物科技有限公司；RNA提取液、2×SYBR Green qPCR Master Mix (None ROX) 武漢賽維爾生物科技有限公司；其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

AR223CN電子分析天平 奧豪斯儀器（常州）有限公司；Heraeus Fresco17離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；病理切片機 德國徠卡儀器有限公司；正置光學顯微鏡（成像系統(tǒng)） 日本尼康公司；熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵刺梨汁的制備

刺梨鮮果經(jīng)打漿、過濾、超高溫瞬時滅菌后無菌灌裝，備用。無菌條件下接種副干酪乳桿菌SR10-1至MRS肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃無菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，離心收集菌體，用0.85 g/100 mL生理鹽水調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，備用。刺梨汁加入4 倍飲用水，過濾，然后加入9.7 g/100 mL白砂糖（以刺梨汁總體積計，下同），經(jīng)過巴氏殺菌后接種4.3%SR10-1菌液，在32 ℃下發(fā)酵64.5 h。

1.3.2 實驗設計與樣本采集

將小鼠按照體質(zhì)量隨機分為5 組，每組10 只，即空白對照組（Control，生理鹽水10 mL/kgmb）、DSS模型組（生理鹽水10 mL/kgmb）、陽性對照組（300 mg/kg美沙拉嗪腸溶片，10 mL/kgmb）、LAB-RRTJ組（10 mL/kgmb）、刺梨原汁組（RRTJ，10 mL/kgmb）。Control組正常飲水，其他組采用0.03 g/mL DSS溶液代替正常飲水，連續(xù)5 d進行建模，于第6天開始給藥，在給藥開始后的第8天和第15天將其飲用水替換為0.03 g/mL DSS溶液以維持模型[18-21]。每天監(jiān)測小鼠結(jié)腸炎癥的臨床癥狀，包括日?；顒?、血便、腹瀉等。給藥持續(xù)21 d。給藥結(jié)束后小鼠乙醚致死，眼眶取血，取結(jié)腸、其他組織和器官測量與稱質(zhì)量，然后處理或立即于－80 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 免疫器官系數(shù)測定

解剖小鼠后，快速分離脾臟，稱質(zhì)量，按下式計算免疫器官系數(shù)。

1.3.4 細胞因子與抗氧化指標檢測

小鼠處死后眼眶取血，在4 ℃、3 200 r/min離心10 min制備血清；用預冷的pH 7.2、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗小鼠結(jié)腸組織并剪碎，在冰上研磨制成勻漿液，根據(jù)BCA試劑盒測定結(jié)腸組織蛋白質(zhì)濃度。嚴格按照試劑盒說明書操作，測定炎癥因子（結(jié)腸IL-6、IL-1β，血清IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α）水平，以及抗氧化指標（結(jié)腸MPO、MDA、SOD水平及血清GSH水平）。

1.3.5 組織學指標檢測

按時記錄小鼠喂養(yǎng)狀態(tài)，根據(jù)體質(zhì)量減少量、糞便稠度和便血評分之和計算疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分[22]。具體評分細則為：體質(zhì)量減輕評分：0（沒有降低）、1（1%～5%）、2（5%～10%）、3（10%～20%）、4（＞20%）；大便稠度評分：0（正常）、2（稀便）、4（腹瀉）；便血評分：0（無血）、1（糞便顏色改變）、2（糞便帶血）和4（嚴重出血，肛門周圍有血液）。收集小鼠距離肛門1 cm處末端結(jié)腸組織于質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液中固定24 h，取部分進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察結(jié)腸形態(tài)學的改變。

1.3.6 qPCR檢測

取適量結(jié)腸組織樣本，組織勻漿機勻漿，參照試劑盒提取細胞總RNA操作說明書提取結(jié)腸組織內(nèi)總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，并配制反應液，采用qPCR系統(tǒng)進行擴增。引物序列見表1。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃、15 s，循環(huán)40 次，內(nèi)參基因為GAPDH，按照2－ΔΔCt法計算樣本中封閉蛋白3（Claudin-3）、閉鎖小帶1（zonula occludens 1，ZO-1）、黏蛋白2（mucin-2，MUC2）mRNA的相對表達水平。

表1 qPCR引物序列的設計Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR)

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果均以平均值±標準偏差表示，采用S P S S Statistics 25軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05表示差異顯著。采用Origin 2018軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠DAI評分和免疫器官的影響

體質(zhì)量減輕、大便黏稠、腹痛便血是結(jié)腸炎的臨床癥狀[23]，部分伴隨結(jié)腸縮短、肝臟和脾臟腫大等癥狀。DSS造模期間，小鼠出現(xiàn)嚴重便血和糞便松散情況，某些小鼠體質(zhì)量嚴重下降。如表2所示，DSS組在第9天DAI評分達到最大（8.75±1.92），與先前的研究結(jié)果[24]一致，給藥結(jié)束后DSS組DAI評分仍最高，為3.25±0.43。DAI是表示結(jié)腸炎患病程度的基礎指標，DAI評分越高，說明腸炎越嚴重。給藥結(jié)束時，與DSS組相比，除RRTJ組外，其余DAI評分均顯著降低（P＜0.05），且能夠改善小鼠便血情況和糞便形狀。

表2 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠DAI評分的影響Table 2 Effect of LAB-RRTJ on DAI score in UC mice

動物臟器系數(shù)可一定程度反映該器官的生物學功能強弱[25]。如圖1所示，與Control組相比，DSS組小鼠肝臟系數(shù)由（3.59±0.15）%增加到（4.20±0.31）%（P＜0.001），增加幅度為11.42%；脾臟系數(shù)由（0.33±0.11）%增加至（0.95±0.31）%（P＜0.001），增加幅度為187.88%，說明DSS能引起小鼠肝臟和脾臟損傷。脾臟是重要的外周免疫器官[26]，能產(chǎn)生特異性抗體等活性物質(zhì)，脾臟發(fā)生腫大是因為炎癥細胞的擴張[27]。經(jīng)過各組干預后，陽性對照、LAB-RRTJ和RRTJ組肝臟系數(shù)較DSS組分別降低了9.05%、10.48%、4.76%，脾臟系數(shù)降低幅度均達到70%以上（P＜0.001）。綜合來看，LAB-RRTJ能夠緩解由結(jié)腸炎引起的肝臟和脾臟腫大，且緩解效果趨近于Control組和陽性對照組。

圖1 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠免疫器官指數(shù)的影響及飼養(yǎng)狀態(tài)Fig.1 Effect of LAB-RRTJ on immune organ indices and feeding status of mice with DSS-induced UC

2.2 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸組織的影響

結(jié)腸縮短和腸內(nèi)容物不成形是U C 模型的特征之一[28]。如圖2A、B所示，與Control組相比，DSS組小鼠結(jié)腸長度由（10.04±0.93）cm縮短至（8.80±0.55）cm（P＜0.05）。與DSS組相比，LAB-RRRJ組小鼠結(jié)腸長度顯著增加至（10.45±0.92）cm（P＜0.001），其余組別結(jié)腸長度均有不同程度增加，但不具有統(tǒng)計學意義。通過結(jié)腸切片HE染色可以評估小鼠結(jié)腸病理損傷程度，如圖2C所示，Control組小鼠結(jié)腸形態(tài)良好，腸上皮完整，隱窩結(jié)構(gòu)完整，細胞排列有序且含有大量的杯狀細胞，沒有發(fā)現(xiàn)炎癥細胞浸潤。與Control組相比，DSS組小鼠結(jié)腸可見大量黏膜上皮細胞變性、壞死，黏膜層可見部分炎細胞浸潤，杯狀細胞數(shù)量明顯減少并有部分腸隱窩損傷；RRTJ組黏膜層可見部分炎癥細胞浸潤；而陽性對照組和LAB-RRTJ組小鼠結(jié)腸損傷情況明顯緩解，說明LAB-RRTJ對結(jié)腸黏膜病變具有改善作用，并且效果優(yōu)于RRTJ。

圖2 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸長度和病理學形態(tài)的影響Fig.2 Effect of LAB-RRTJ on colon length and pathological morphology in mice with DSS-induced UC

2.3 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸MPO活力的影響

結(jié)腸MPO活力可作為以中性粒細胞為主的炎癥浸潤指標，并作為評價結(jié)腸炎癥嚴重程度的指標[29]，MPO活力越高，炎癥情況越嚴重。如圖3所示，與Control相比，DSS組MPO活力由（70.93±10.15）U/L升高至（94.79±11.80）U/L，增加了33.64%（P＜0.001），可見DSS導致小鼠結(jié)腸炎癥浸潤顯著增加。研究表明，細胞MPO活力的升高可促進炎癥效應細胞的增殖與活化[30]，進一步導致結(jié)腸炎癥和潰瘍病灶的形成。與DSS組相比，陽性對照組MPO活力降低至（85.24±10.72）U/L，但變化不顯著，RRTJ組MPO活力沒有降低趨勢，而LAB-RRTJ組MPO活力降低至（80.93±8.01）U/L（P＜0.05），降低效果優(yōu)于陽性藥物美沙拉嗪，且與RRTJ組差異高度顯著（P＜0.001）。

圖3 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸MPO活力的影響Fig.3 Effect of LAB-RRTJ on colonic MPO activity in mice with UC induced by DSS

2.4 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸與血清炎癥因子水平的影響

研究表明，大量炎癥因子在結(jié)腸中的聚集會加重結(jié)腸上皮細胞的損傷，增加腸道通透性，UC的治療是通過抑制促炎細胞因子和增強抗炎細胞因子的作用改善免疫失調(diào)[31]。如表3所示，DSS會導致小鼠結(jié)腸和血清中炎癥因子水平的變化。與Control組相比，DSS組結(jié)腸IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平分別增加38.28%、49.51%、44.11%、57.84%，血清IL-17A水平增加了16.04%，IL-10水平降低了19.42%（P＜0.05），說明DSS能夠誘導結(jié)腸炎。與DSS組相比，經(jīng)LAB-RRTJ處理后，小鼠結(jié)腸IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平分別降低了9.79%、15.98%、21.39%、19.66%，血清IL-17A水平降低了11.90%，IL-10水平增加了11.29%（P＜0.05），并趨于正常，且效果優(yōu)于RRTJ組。研究表明，IL-1β、IL-6和TNF-α、IFN-γ等因子水平降低可以明顯緩解DSS誘導的小鼠結(jié)腸炎癥狀[32-34]；IL-10對UC的治療具有重要作用，在疾病感染期間，IL-10本身可以抑制促炎反應，并限制由炎癥引起的不必要的組織破壞[35]。在改善炎癥因子方面，LAB-RRTJ與陽性對照藥物美沙拉嗪具有相似效果，說明LAB-RRTJ可以通過降低促炎因子和提高抑炎因子的水平緩解UC。

表3 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸與血清炎癥因子水平的影響Table 3 Effect of LAB-RRTJ on the levels of inflammatory factors in the colon and serum of mice with DSS-induced UC

2.5 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸與血清氧化應激指標的影響

氧化應激已證明與多種疾病相關(guān)，包括與UC相關(guān)的結(jié)直腸癌，在免疫調(diào)節(jié)因素中，UC患者體內(nèi)的活性氧水平異常高[36-37]。體內(nèi)MDA、SOD和GSH水平是評價機體氧化應激水平的重要指標。如圖4所示，相比Control組，DSS組結(jié)腸SOD活力和血清GSH濃度分別下降了24.98%和30.30%，結(jié)腸MDA含量增加了64.24%（P＜0.001）。脂質(zhì)過氧化會導致抗氧化體系（如SOD和GSH）水平降低和MDA含量增加，從而加重組織和器官炎癥[38]。與DSS組相比，LAB-RRTJ組SOD活力增加了18.64%（P＜0.01），GSH濃度增加了18.18%（P＜0.05），MDA含量下降了33.83%（P＜0.01），效果優(yōu)于陽性對照組。與LAB-RRTJ相比，RRTJ在改善抗氧化水平方面效果不明顯。氧化應激水平在結(jié)腸炎調(diào)節(jié)過程中具有重要作用，LAB-RRTJ能通過調(diào)節(jié)體內(nèi)SOD、MDA、GSH水平，緩解DSS誘導的過氧化狀態(tài)，從而緩解UC。

圖4 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸與血清氧化應激指標的影響Fig.4 Effect of LAB-RRTJ on oxidative stress indicators in colon and serum of mice with DSS-induced UC

2.6 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸腸道屏障基因mRNA表達水平的影響

腸道屏障的破壞是UC患者的發(fā)病特征之一，其導致腸道通透性增加，加重結(jié)腸炎患病程度[39]。如圖5所示，與Control組相比，DSS誘導后小鼠結(jié)腸Claudin-3mRNA表達水平高度顯著降低（P＜0.001），但對ZO-1和MUC2mRNA的表達沒有顯著影響?？缒さ鞍追忾]蛋白3在UC患者腸黏膜愈合和炎癥表達的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其具有屏障、柵欄和信號轉(zhuǎn)導功能[40]，當封閉蛋白發(fā)生異常表達時，細胞通透性發(fā)生異常，促進結(jié)腸癌的發(fā)生[41]。與DSS組相比，陽性藥物美沙拉嗪對ZO-1mRNA表達的影響不顯著，但能夠高度顯著提高MUC2mRNA表達水平（P＜0.001）。研究表明，表面黏液是腸屏障的重要組成部分，黏液屏障和杯狀細胞黏蛋白的缺失是UC的一個重要特征，此時能夠觀察到MUC2的表達減少[42]；MUC2缺陷小鼠會出現(xiàn)腸上皮細胞形態(tài)的異常和潰瘍產(chǎn)生，導致UC發(fā)生[43]。與DSS組相比，RRTJ對Claudin-3mRNA表達水平?jīng)]有顯著作用，但能顯著提高MUC2和ZO-1mRNA表達水平（P＜0.01、P＜0.001）。ZO-1蛋白水平可間接反映腸道黏膜的完整性和通透性，ZO-1表達量增加表明腸上皮緊密連接的修復，腸道通透性改善[44]。相比DSS組，LAB-RRTJ組Claudin-3、ZO-1、MUC2的mRNA表達水平均有不同程度升高，表明其在對改善腸道屏障相關(guān)基因mRNA表達水平方面表現(xiàn)出一定的效果。

圖5 LAB-RRTJ對DSS誘導UC小鼠結(jié)腸腸道屏障基因mRNA表達水平的影響Fig.5 Effect of LAB-RRTJ on the mRNA expression levels of colonic barrier-related genes in mice with DSS-induced UC

3 討 論

UC作為一種全球性疾病，患病率不斷增長，而大多數(shù)化學治療藥物都有副作用。許多研究發(fā)現(xiàn)，益生菌發(fā)酵果蔬產(chǎn)品在預防和治療UC方面具有較大潛力[45-47]。本研究對RRTJ、LAB-RRTJ及藥物（美沙拉嗪腸溶片）對結(jié)腸炎干預和治療效果進行比較，結(jié)果表明，LAB-RRTJ對UC的改善作用顯著優(yōu)于RRTJ，能夠通過多種途徑改善DSS誘導的UC。

本研究中，LAB-RRTJ有效緩解了UC小鼠的臨床癥狀和結(jié)腸病理情況；能夠下調(diào)促炎因子IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α、IFN-γ的水平，上調(diào)抗炎因子IL-10水平，其效果接近美沙拉嗪治療組，且在調(diào)節(jié)IL-17A和IL-10水平方面效果更好；在抗氧化方面，LAB-RRTJ能夠顯著提高SOD和GSH水平，降低MDA含量；此外，其能夠改善Claudin-3、ZO-1和MUC2基因的表達水平，通過提高結(jié)腸中緊密連接蛋白的表達，維持腸道通透性。

副干酪乳桿菌SR10-1和刺梨汁的結(jié)合具有協(xié)同增效作用。研究表明，刺梨汁和刺梨渣的醇提物對致炎劑引起小鼠不同組織的炎癥均具有較好的抗炎作用[48]；刺梨多糖和黃酮能夠緩解小鼠UC[49-50]；乳酸菌活菌體可通過抑制腸上皮細胞中的炎性因子，發(fā)揮抗腸炎作用[51]。本團隊前期研究表明，經(jīng)SR10-1發(fā)酵后的刺梨汁保留了大部分原有活性物質(zhì)，包括VC、SOD、多糖和黃酮等，能夠顯著提高免疫力低下小鼠的免疫能力[21]；此外，團隊研究還證實RRTJ、SR10-1和LAB-RRTJ均具有良好的體外降血糖和降血脂活性[17]。本研究中，RRTJ能夠顯著降低UC小鼠脾臟指數(shù)，改善結(jié)腸病理狀態(tài)和提高ZO-1表達水平，表明RRTJ有一定的抗炎效果。但是，RRTJ在調(diào)節(jié)小鼠炎癥因子水平和氧化應激能力方面效果不明顯。而LAB-RRTJ能夠彌補RRTJ的不足，在調(diào)節(jié)炎癥因子水平、氧化應激能力和改善腸道屏障等諸多方面均有顯著效果，說明經(jīng)過發(fā)酵的RRTJ對小鼠結(jié)腸炎能夠起到更好的緩解和保護作用。SR10-1具有較強的抗氧化能力和耐酸性[16]，通過SR10-1發(fā)酵，LAB-RRTJ能夠發(fā)揮較RRTJ更優(yōu)的功效。其次，刺梨中單寧等多酚物質(zhì)含量較高[52-53]，果汁酸澀而不被大眾接受，而乳酸菌發(fā)酵降解轉(zhuǎn)化了單寧[21]，減少了果汁刺激性，使小鼠能夠較好地攝入，且微生物發(fā)酵能夠增加刺梨汁中的小分子物質(zhì)，促進體內(nèi)吸收[54-55]。因此，LAB-RRTJ在緩解UC方面效果突出，兩者的協(xié)同作用值得進一步研究，這也為刺梨功能性產(chǎn)品的開發(fā)和應用提供了新方向。此外，推測副干酪乳桿菌SR10-1發(fā)酵刺梨汁的過程中產(chǎn)生的代謝物質(zhì)也會有積極的影響，后續(xù)將對此進行深入研究。

LAB-RRTJ能夠通過調(diào)節(jié)炎癥因子、提高抗氧化能力和改善腸道屏障緩解小鼠UC癥狀。發(fā)酵后的LAB-RRTJ對UC的保護效果優(yōu)于未發(fā)酵的RRTJ，說明副干酪乳桿菌SR10-1發(fā)酵能夠增強RRTJ的功效。