楊婉藝，姜 毅，湯 靜，席 飛，孫佩馨，肖紅梅*

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

無(wú)花果（Ficus caricaL.）風(fēng)味獨(dú)特、肉質(zhì)鮮美，富含糖類、纖維素、維生素、礦物質(zhì)和多種氨基酸[1]，是酚類物質(zhì)的良好來(lái)源，具有優(yōu)秀的抗氧化能力[2]。但無(wú)花果皮薄多汁，采后呼吸代謝旺盛，其果目結(jié)構(gòu)又極易遭受病原微生物的侵染，因此會(huì)造成嚴(yán)重的采后病害。炭疽病是無(wú)花果采后主要病害之一[3]，病狀為褐色的圓形病斑，隨著病害程度加重，病斑面積不斷擴(kuò)大，使果實(shí)軟化腐爛，失去食用價(jià)值。炭疽菌侵染寄主類型的范圍甚為廣泛，不同的寄主中均具有1 種或多種優(yōu)勢(shì)炭疽菌株[4]，明確無(wú)花果炭疽病原體的種屬對(duì)無(wú)花果炭疽病的防控具有重要的意義。由于炭疽菌的分生孢子、附著胞、菌落形態(tài)等特征穩(wěn)定性差，且利用單一的內(nèi)源轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internally transcribed spacer，ITS）基因序列鑒定往往難以準(zhǔn)確劃分炭疽菌歸屬?gòu)?fù)合種下的生理小種[5]，而多基因聯(lián)合鑒定能夠很好地區(qū)分親緣關(guān)系較近的小種，多基因序列聯(lián)合鑒定的物種進(jìn)化研究方法逐漸成為植物病菌菌株鑒定常用的有效方法之一[6]。

炭疽病的頻發(fā)限制了無(wú)花果產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，尋找一種合適的防控技術(shù)迫在眉睫。目前，農(nóng)業(yè)上主要采用傳統(tǒng)的化學(xué)方法防控?zé)o花果的炭疽病害，但化學(xué)物質(zhì)的長(zhǎng)期超量使用容易造成藥物殘留、環(huán)境嚴(yán)重污染、病菌耐藥性增強(qiáng)等問(wèn)題[3,7]。生防菌的應(yīng)用可以有效規(guī)避或減輕化學(xué)藥劑所帶來(lái)的問(wèn)題[8]，綠色安全健康的生物防治成為國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）是生防菌的主要微生物之一，許多種[9-11]都對(duì)炭疽菌的生長(zhǎng)具有抑制能力，且對(duì)果蔬炭疽病的防治應(yīng)用效果往往優(yōu)于假單胞桿菌屬（Pseudomonassp.）[12-13]、木霉屬（Trichodermasp.）[14-15]等拮抗微生物。其中，貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）已被證實(shí)可以有效控制多種果蔬真菌病害如番茄早疫病[16]、蘋果灰霉病[17]、芒果炭疽病[18]和細(xì)菌病害如柑橘細(xì)菌性潰瘍病[19]、香蕉軟腐病[20]，具有優(yōu)秀的生防應(yīng)用潛力。芽孢桿菌一方面可以產(chǎn)生對(duì)病原菌有直接殺傷作用的抑菌物質(zhì)[21]；另一方面，芽孢桿菌還可以通過(guò)誘導(dǎo)寄主抗病基因的表達(dá)增強(qiáng)果實(shí)的抗病性[22]，從而減少采后病害的發(fā)生。目前鮮見(jiàn)貝萊斯芽孢桿菌防控?zé)o花果炭疽病相關(guān)研究與報(bào)道。

2022年中央一號(hào)文件強(qiáng)調(diào)“推進(jìn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綠色發(fā)展”“深入推進(jìn)農(nóng)業(yè)投入品減量化”。病原菌的分離、鑒定是分析無(wú)花果病害流行規(guī)律的前提。本課題組從具有典型炭疽病發(fā)病癥狀的無(wú)花果病果上獲得一株炭疽病菌FC.006（以下簡(jiǎn)稱FC.006），前期研究發(fā)現(xiàn)，生防菌B.velezensisRD.006（以下簡(jiǎn)稱RD.006）對(duì)FC.006菌絲生長(zhǎng)具有顯著抑制作用；果實(shí)異孔接種實(shí)驗(yàn)證明RD.006可以誘導(dǎo)提高果實(shí)對(duì)FC.006的抵御能力；RD.006處理能夠降低采后‘布蘭瑞克’無(wú)花果的病情指數(shù)，有效保持果實(shí)品質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用多基因序列聯(lián)合鑒定FC.006的基因序列，同時(shí)進(jìn)一步探究RD.006對(duì)其的防治效果，以期為無(wú)花果采后病害的鑒定和生物防治提供理論基礎(chǔ)，為我國(guó)農(nóng)林產(chǎn)業(yè)“兩減一增”戰(zhàn)略實(shí)施和相關(guān)技術(shù)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensisRD.006）保存于LB培養(yǎng)基（4 ℃）。

‘布蘭瑞克’無(wú)花果果實(shí)，采摘于江蘇省句容市虎耳山無(wú)花果專業(yè)合作社，采后2 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。挑選具有明顯炭疽病發(fā)病癥狀的果實(shí)用于病原菌的分離；挑選色澤統(tǒng)一、大小一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的健康果實(shí)用于貯藏保鮮實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

HVE-50自動(dòng)蒸汽滅菌鍋 日本Hirayama有限公司；HP-2136便攜式色差儀 上海譜熙光電科技有限公司；UV BlueStar A紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京萊伯泰科儀器有限公司；TGL20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湘潭湘儀儀器有限公司；WYT-4型手持糖量?jī)x 紹興市億納儀器制造有限公司；102光學(xué)顯微鏡 日本尼康公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波海曙賽富實(shí)驗(yàn)儀器廠；XB-K-25血球計(jì)數(shù)板 上海醫(yī)用光學(xué)儀器廠；HH-6恒溫水浴鍋常州國(guó)華電器有限公司；NanoDrop2000分光光度計(jì)、QuantStudioTM6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）系統(tǒng) 美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 無(wú)花果采后病原菌的分離與鑒定

1.3.1.1 病原菌株的分離與純化

選取‘布蘭瑞克’典型病果，采用組織分離法進(jìn)行病原菌株的分離。切取病果病健交界處組織塊，依次放入體積分?jǐn)?shù)75%乙醇10 s、質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%次氯酸鈉溶液20 s，隨后用無(wú)菌水漂洗3 次，切取組織塊中央的部分（約5 mm×5 mm）于無(wú)菌濾紙上吸干組織表面水分，用無(wú)菌鑷子將組織塊置于PDA培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)皿于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)3～5 d，用無(wú)菌接種針挑取單菌落邊緣菌絲于新的PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化，重復(fù)2～3 次直至得到純化的菌株，觀察菌株的菌落形態(tài)、菌絲和孢子的形態(tài)特征。結(jié)合《真菌鑒定手冊(cè)》[23]對(duì)病原菌進(jìn)行初步鑒定。將分離純化的菌株回接于健康的‘布蘭瑞克’果實(shí)，根據(jù)科赫法則驗(yàn)證分離菌株的致病性，獲得致病菌株。

1.3.1.2 病原菌株多基因聯(lián)合生物學(xué)鑒定

利用十六烷基三甲基溴化銨（c e t y l t r i m e t h y l ammonium bromide，CTAB）法[5]提取25 ℃培養(yǎng)7 d的菌絲體DNA。取100 mg菌絲體于裝有500 μL CTAB裂解液（提前65 ℃預(yù)熱）的離心管中，65 ℃水浴1 h，水浴期間每隔 10 min振蕩一次，水浴結(jié)束后室溫冷卻，加入500 mL氯仿-異戊醇溶液（體積比24∶1，下同），翻轉(zhuǎn)混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，吸取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積氯仿-異戊醇溶液，重復(fù)抽提一次。向上清液中加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，置于4 ℃冰箱過(guò)夜沉淀DNA，在4 ℃、12 000 r/min條件下離心15 min，棄去上清液。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌沉淀2 次，棄上清液。待殘余乙醇揮發(fā)之后加入適量1×TE緩沖液溶解。取部分樣品分別用于1%的瓊脂糖凝膠電泳和濃度檢測(cè)，質(zhì)量合格的樣品置于－20 ℃冰箱中保存待用。

基于各基因序列引物（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性4 min，95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，有清晰條帶的PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將所得結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中與己知同源序列進(jìn)行同源性比較，利用MEGA-X軟件通過(guò)鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

表1 病原菌株多基因序列引物Table 1 Primers used for amplification of multiple gene sequences of pathogenic strains

1.3.2 FC.006的致病孢子濃度篩選

取健康的無(wú)花果果實(shí)，體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒20 s，用無(wú)菌水沖洗3 次，自然晾干后，在果實(shí)腰部用滅菌打孔器形成1 個(gè)直徑3 mm、深4 mm的圓孔，在圓孔處分別接種20 μL FC.006孢子懸液：1×103、1×104、1×105、1×106、1×107個(gè)/mL，并設(shè)置FC.006菌碟貼于果實(shí)傷口處（菌碟菌絲朝向果肉）陽(yáng)性對(duì)照和無(wú)菌水陰性對(duì)照。自然晾干后，用聚乙烯保鮮袋單果包裝，置于25℃、相對(duì)濕度85%～95%的恒溫培養(yǎng)箱中存放，分別于3 d和5 d時(shí)采用十字交叉法測(cè)定果實(shí)發(fā)病直徑，以篩選后續(xù)實(shí)驗(yàn)中孢子使用濃度。

1.3.3 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)FC.006的離體抑制效果測(cè)定

在P DA 平板中央打孔，接入培養(yǎng)7 d 的病原菌FC.006，用無(wú)菌接種針在病原菌兩側(cè)平行劃線接入RD.006（距平板中央大約2.5 cm），在28 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的條件下培養(yǎng)4～12 d。以僅接種病原菌的平板作為對(duì)照，從平板背面采用十字交叉法測(cè)量病原菌菌落的直徑大小，并根據(jù)以下公式計(jì)算抑菌率。

1.3.4 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果果實(shí)炭疽防治效果檢測(cè)

果實(shí)消毒和打孔處理同1.3.2節(jié)，對(duì)果實(shí)接種以下處理液20 mL：1）FC組：1×105個(gè)/mL FC.006孢子懸液；2）RD組：1×108個(gè)/mL RD.006菌懸液；3）FC-RD組：先接種1×105個(gè)/mL FC.006孢子懸液，24 h后接種1×108個(gè)/mL RD.006菌懸液；4）RD-FC組：先接種1×108個(gè)/mL RD.006菌懸液，24 h后接種1×105個(gè)/mL FC.006孢子懸液。

接種完畢室溫自然晾干后，用聚乙烯保鮮袋單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度85%～95%的恒溫培養(yǎng)箱中貯藏。每組處理3 個(gè)平行，每平行15 個(gè)果實(shí)。貯藏5、7 d時(shí)測(cè)量果實(shí)的病斑直徑。

1.3.5 無(wú)花果果實(shí)抗性基因表達(dá)量的測(cè)定

果實(shí)處理方式同1.3.4節(jié)中FC組和RD-FC組接種方式，每組設(shè)置3 個(gè)平行，每平行75 個(gè)果實(shí)。在第二次接種完成后的0、12、24、48、54、72 h后，用滅菌的手術(shù)刀取果實(shí)傷口周圍1 cm寬的組織，放入液氮中速凍，再置于－80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆茫崛」麑?shí)組織樣品RNA進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量測(cè)定。

采用改良CTAB法[28]提取無(wú)花果總RNA，反轉(zhuǎn)錄和去除基因組DNA采用Takara RR047A試劑盒方法操作，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)上述提取RNA樣品的質(zhì)量和濃度，合格樣品用于后續(xù)的qPCR反應(yīng)。基因表達(dá)水平的測(cè)定采用Takara RR420A試劑盒的方法操作，采用ABI 7500 system qPCR儀器研究無(wú)花果果實(shí)6 個(gè)抗病相關(guān)基因的表達(dá)。相關(guān)引物如表2所示。上機(jī)反應(yīng)條件為：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，共40 個(gè)循環(huán)。將反應(yīng)結(jié)果用閾值周期（CT值）進(jìn)行歸一化處理，用2?ΔΔCT法表示目標(biāo)基因相對(duì)于管家基因（Actin）的相對(duì)表達(dá)水平。

表2 無(wú)花果相關(guān)抗病基因引物Table 2 Primers for amplification of disease resistance genes in fig fruits

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 8.2軟件進(jìn)行Duncan’s多重比較，P＜0.05表示差異顯著；圖表用Excel、Graphpad軟件進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)花果采后病原菌株FC.006的分離與鑒定

2.1.1 病原菌FC.006形態(tài)鑒定結(jié)果

從無(wú)花果病果上分離得到一株病原菌株（圖1A）。依據(jù)科赫法則，將其接種至無(wú)花果上進(jìn)行回接驗(yàn)證致病性并再次分離，得到再分離菌株FC.006（圖1B），顯微鏡下觀察其菌絲細(xì)長(zhǎng)，表面較平滑，存在部分分支（圖1C）。FC.006在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落邊緣規(guī)則，顏色由中央黑褐色向外擴(kuò)至四周顏色變淡至邊緣帶呈白色，在培養(yǎng)后期菌落背面處可以觀察到黑色附著胞形成的輪紋狀特征，易產(chǎn)生橙色分生孢子堆，分生孢子呈柱形，兩端鈍圓（圖1D）。

圖1 病原菌株FC.006的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of FC.006

2.1.2 病原菌FC.006的多基因序列分析鑒定

無(wú)花果病原菌株FC.006經(jīng)rDNA-ITS序列初步鑒定為膠孢刺盤孢復(fù)合種（Colletotrichum gloeosporioides），對(duì)ITS-GAPDH-TUB-CHS-ACT-CAL6 個(gè)基因聯(lián)合序列與表3所示的模式菌株序列進(jìn)行同源性比較，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖2），F(xiàn)C.006鑒定為膠孢刺盤孢下的小種哈銳炭疽菌（C.Horii）。

圖2 FC.006的多基因序列聯(lián)合構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of FC.006 based on multigene sequence combination

表3 多基因聯(lián)合鑒定分離菌株FC.006膠孢刺盤孢復(fù)合種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析中相關(guān)模式菌株信息Table 3 Information about type strains used for multi-gene phylogenetic analysis for identification of Colletotrichum gloeosporioides FC.006

2.1.3 FC.006的致病孢子濃度篩選結(jié)果

哈銳炭疽菌FC.006的孢子能夠有效引起無(wú)花果炭疽病的發(fā)生。無(wú)花果果實(shí)炭疽病害發(fā)病初期傷口周圍發(fā)黑，后期黑色病斑逐漸擴(kuò)大，呈輪紋狀且向內(nèi)凹陷，并伴有白色菌絲和橙色孢子產(chǎn)生，果實(shí)軟爛且果目滲有腐爛汁水。由圖3可知，在設(shè)置的接種范圍（1×103～1×107個(gè)/mL）內(nèi)，隨著孢子接種濃度的增高，果實(shí)的病斑直徑增加，果實(shí)炭疽病發(fā)病情況嚴(yán)重程度加大。接種孢子濃度1×105個(gè)/mL和1×106個(gè)/mL果實(shí)的病斑直徑接近，在接種3 d和5 d時(shí)，病斑直徑分別約為1.5 cm和2.4 cm；接種5 d時(shí)，接種孢子濃度1×107個(gè)/mL的果實(shí)完全腐爛。感染低孢子濃度（1×103個(gè)/mL）的果實(shí)顯現(xiàn)較為輕微的病狀，果實(shí)組織對(duì)病原菌侵染具有一定的抵御能力；接種高孢子濃度（1×106個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL）的果實(shí)發(fā)病嚴(yán)重，果實(shí)組織快速進(jìn)入死亡狀態(tài)；孢子中間濃度（1×104個(gè)/mL和1×105個(gè)/mL）侵染引起果實(shí)較為嚴(yán)重的炭疽病，果實(shí)發(fā)病進(jìn)程適中，因而接種1×105個(gè)/mL孢子濃度果實(shí)的生理狀態(tài)可用于本實(shí)驗(yàn)后續(xù)研究。

圖3 接種FC.006不同孢子濃度的無(wú)花果果實(shí)5 d時(shí)發(fā)病情況（A）和病斑直徑（B）Fig.3 Disease symptom (A) and lesion diameter (B) of fig fruits at 5 days after inoculation with different spore concentrations of FC.006

2.2 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)炭疽菌FC.006的抑制作用

在RD.006和FC.006對(duì)峙平板上發(fā)現(xiàn)，RD.006對(duì)FC.006具有明顯的抑制作用，加入RD.006后，F(xiàn)C.006的生長(zhǎng)直徑明顯變小，菌落呈現(xiàn)規(guī)則的梭形；在RD.006的生物脅迫下，F(xiàn)C.006已顯示出逆境下的特殊生理形態(tài)，菌落中央提前生成了橙色的孢子（圖4B）。培養(yǎng)至8 d時(shí)，對(duì)照組FC.006菌落已生長(zhǎng)至整個(gè)平板（圖4A），此時(shí)RD.006的抑菌率達(dá)到85%（圖5），對(duì)峙平板中FC.006菌落停止擴(kuò)展且與RD.006之間存在著明顯的抑菌帶。

圖4 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)炭疽菌FC.006的抑菌效果Fig.4 Antimicrobial effect of Bacillus velezensis RD.006 on FC.006

圖5 貝斯芽孢桿菌RD.006對(duì)炭疽菌FC.006的抑菌率Fig.5 Inhibition rate of Bacillus velezensis RD.006 against FC.006

2.3 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果炭疽病的防治效果

如圖6所示，在貯藏5 d時(shí)，RD-FC組的果實(shí)病斑直徑顯著小于FC組和FC-RD組果實(shí)（P＜0.05）；貯藏7 d時(shí)，RD-FC組果實(shí)的病斑直徑是同時(shí)期FC組果實(shí)的41.5%，而FC-RD組果實(shí)的病斑直徑達(dá)2.3 cm，與此時(shí)只接種病原菌的FC組果實(shí)病斑直徑接近，說(shuō)明預(yù)防接種貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果采后炭疽病有良好的防控作用，且提前接種生防菌的接種方式有助于降低感染炭疽病果實(shí)腐爛的嚴(yán)重程度，這可能是因?yàn)樘崆敖臃N生防菌會(huì)誘導(dǎo)果實(shí)組織產(chǎn)生更強(qiáng)的抗病性。

圖6 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果炭疽病害的預(yù)防和防治作用Fig.6 Preventive and control effects of Bacillus velezensis RD.006 on anthracnose disease of fig

2.4 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果果實(shí)抗性基因的影響

苯丙氨酸解氨酶（phenylalanineammonialyase，PAL）、肉桂酸-4-羥化酶（cinnamate 4-hydroxylase，C4H）和4-香豆酰-輔酶A連接酶（4-coumarate: coenzyme A ligase，4CL）是苯丙烷代謝途徑中的3 個(gè)關(guān)鍵酶[29]。取樣時(shí)間0 h對(duì)應(yīng)果實(shí)損傷接種RD.006菌懸液（RD-FC組）和無(wú)菌水（FC組）之后的24 h。由圖7A～C可知，RD-FC組中FcPAL、FcC4H、Fc4CL表達(dá)量分別在取樣0 h呈現(xiàn)較高的表達(dá)量，可能是因?yàn)樯谰鷮儆谏镌醇ぐl(fā)子，可以誘導(dǎo)果實(shí)的抗性基因表達(dá)上升，取樣0 h之后這3 個(gè)基因的表達(dá)量都出現(xiàn)不同程度的下降，之后在不同時(shí)間點(diǎn)又恢復(fù)上升趨勢(shì)并在54 h左右達(dá)到峰值。FcPAL在FC組的最高表達(dá)量顯著小于其在RD-FC組的最大表達(dá)量（P＜0.05），同時(shí)后期表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間滯后于RD-FC組，F(xiàn)cC4H和Fc4CL基因的表達(dá)結(jié)果與FcPAL相類似，說(shuō)明生防菌RD.006處理可以誘導(dǎo)果實(shí)迅速發(fā)生抗病反應(yīng)，并且在貯藏后期維持抗病相關(guān)基因FcPAL、FcC4H、Fc4CL更高的表達(dá)水平。

圖7 貝萊斯芽孢桿菌RD.006對(duì)無(wú)花果果實(shí)FcPAL（A）、FcC4H（B）、Fc4CL（C）、FcAPX（D）、FcCAT（E）、FcPOD（F）基因表達(dá)的影響Fig.7 Effect of Bacillus velezensis RD.006 on the expression of the FcPAL (A), FcC4H (B), Fc4CL (C), FcAPX (D), FcCAT (E) and FcPOD (F) genes in fig

木質(zhì)素等化合物的合成與植物抗病性密切相關(guān)，過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）參與木質(zhì)素合成反應(yīng)的最后一部分，即木質(zhì)素單體氧化聚合反應(yīng)，此反應(yīng)需要H2O2的參與。抗壞血酸酶（aseorbate peroxidase，APX）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）可以協(xié)同清除細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2，進(jìn)而減少過(guò)氧化物對(duì)細(xì)胞的破壞。由圖7D～E可知，取樣0 h兩組的FcAPX表達(dá)量無(wú)顯著差異；在12 h時(shí)RD-FC組果實(shí)的FcAPX表達(dá)量迅速上調(diào)至最高值，而FC組的變化并不顯著；在取樣后期（36～72 h），RD-FC組FcAPX表達(dá)量顯著小于FC組（P＜0.05）。FcCAT的表達(dá)結(jié)果與FcAPX表達(dá)模式相類似。這可能是因?yàn)镽D.006的接種誘導(dǎo)了活性氧的爆發(fā)，促使植物細(xì)胞APX和CAT活性上升以清除產(chǎn)生的過(guò)氧化物。而FC組果實(shí)FcAPX、FcCAT在取樣后期（36～72 h）的表達(dá)水平較高，促進(jìn)APX和CAT的合成以清除H2O2等有害物質(zhì)，這可能是因?yàn)镕C.006侵染也會(huì)使果實(shí)細(xì)胞遭到破壞并產(chǎn)生大量H2O2、自由基等有害物質(zhì)，激活了果實(shí)的抗病性，但這種抗病反應(yīng)具有一定的滯后性。

由圖7F可知，RD-FC組果實(shí)的FcPOD表達(dá)水平在取樣0 h時(shí)顯著提高，在取樣前期（0～24 h）始終維持較高的表達(dá)水平，同時(shí)期果實(shí)組織的苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵酶FcPAL、FcC4H、Fc4CL同樣有較高的表達(dá)水平，因此推測(cè)RD.006的接種可以迅速激活果實(shí)的苯丙烷途徑，增強(qiáng)寄主的抗病性，促使果實(shí)類黃酮、木質(zhì)素等相關(guān)抗性代謝物的生成。

3 討 論

炭疽菌（Colletotrichumsp.）是世界上侵染植物的十大致病性真菌之一[30]，炭疽病的病程較短，若不加以防控，一旦感染無(wú)花果，在短時(shí)間內(nèi)果實(shí)便會(huì)發(fā)生不可控制的軟爛。無(wú)花果炭疽病病原菌的鑒定是生物防治炭疽病的基礎(chǔ)。目前，炭疽菌的分類主要依賴于形態(tài)學(xué)特征結(jié)合基因ITS進(jìn)行鑒定，但炭疽菌的純培養(yǎng)特征會(huì)因培養(yǎng)條件的不同而存在差異，而單一的ITS序列可能會(huì)存在一定的錯(cuò)誤率，因此采用多基因序列對(duì)近親緣關(guān)系的炭疽菌的研究更加可靠。李丹丹等[31]從安徽‘108B’無(wú)花果發(fā)病果實(shí)和葉子上分離得到病原菌株，并通過(guò)形態(tài)學(xué)和多基因（ITS、ACT、GAPDH、CAL、TUB2、CHS-1）鑒定為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）；本實(shí)驗(yàn)從‘布蘭瑞克’無(wú)花果病果上分離出菌株FC.006，采用多基因序列聯(lián)合分析鑒定其屬于膠孢刺盤孢復(fù)合種下的哈銳炭疽菌（C.horri），可見(jiàn)引起無(wú)花果炭疽病的病原菌種類與果實(shí)品種、地理位置、栽培等條件有關(guān)。

對(duì)植物病原菌具有良好拮抗效力的芽孢桿菌中，多數(shù)菌株可以通過(guò)分泌具有抑菌活性的代謝物質(zhì)來(lái)達(dá)到抑菌的目的。有研究表明，貝萊斯芽孢桿菌可以分泌抗菌蛋白[32]、聚酮類化合物[33]、脂肽類抗生素[34]等抑菌物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)中的離體平板對(duì)峙實(shí)驗(yàn)表明，貝萊斯芽孢桿菌RD.006能通過(guò)產(chǎn)生擴(kuò)散性抑菌物質(zhì)有效抑制哈銳炭疽菌FC.006菌絲的生長(zhǎng)。

Priming機(jī)制是指植物組織被生物或非生物激發(fā)子處理后，植物顯示出更強(qiáng)的防御能力[35]，被認(rèn)為是植物中不同類型誘導(dǎo)抗性的共同機(jī)理。生防菌對(duì)寄主果實(shí)抗性的誘導(dǎo)主要是通過(guò)激活一系列生化防御反應(yīng)及果實(shí)的免疫系統(tǒng)，同時(shí)能夠促進(jìn)傷口處結(jié)構(gòu)性壁壘物質(zhì)的積累，病原菌侵染時(shí)會(huì)發(fā)揮更強(qiáng)的組織抗病性。苯丙烷代謝途徑是與植物抗病性密切相關(guān)的次級(jí)代謝途徑，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生防菌RD.006的預(yù)防接種會(huì)誘導(dǎo)無(wú)花果苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶相關(guān)基因的表達(dá)上調(diào)，表明RD.006會(huì)一定程度上激活苯丙烷代謝途徑。該途徑會(huì)產(chǎn)生酚類物質(zhì)、類黃酮和木質(zhì)素等物質(zhì)，其中酚類物質(zhì)和類黃酮對(duì)病原菌有直接的殺死作用，而木質(zhì)素能提高細(xì)胞壁組織木質(zhì)化的程度，從而提高對(duì)病原菌的抵御能力。Wang Xiaoli等[36]發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)接種病原菌或生防菌的枇杷果實(shí)相比，兩者同時(shí)接種的處理方式會(huì)誘導(dǎo)果實(shí)產(chǎn)生更高的PAL、POD、PPO等防御相關(guān)基因的表達(dá)水平，這種誘導(dǎo)作用是Priming機(jī)制介導(dǎo)的果實(shí)防御體系被激發(fā)的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)，相較單獨(dú)接種病原菌的果實(shí)，生防菌和病原菌都接種的果實(shí)FcPAL、FcC4H、Fc4CL、FcAPX、FcCAT、FcPOD基因在接種后有較高的表達(dá)水平，而只接種病原菌的果實(shí)6 個(gè)抗性基因的相對(duì)表達(dá)量在不同時(shí)間點(diǎn)也有較高的表達(dá)量，但最高值普遍小于生防菌和病原菌同時(shí)接種的處理組。佐長(zhǎng)賡等[37]的研究同樣表明，貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisBG-2與病原菌協(xié)同參與誘導(dǎo)厚皮甜瓜CAT、POD、SOD等防御酶的激活。此外，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可以發(fā)現(xiàn)，在貯藏期間的部分時(shí)間點(diǎn)，只接種病原菌的FC處理組果實(shí)的6 個(gè)抗性基因表達(dá)量高于生防菌和病原菌都接種的RD-FC組果實(shí)，可能是FC.006的強(qiáng)致病作用對(duì)生防菌RD.006誘導(dǎo)果實(shí)組織的免疫響應(yīng)具有一定的抑制作用。有研究同樣表明，生防菌直立頂孢霉（Acremonium strictum）產(chǎn)生的枯草菌素類似蛋白AsES可以作為生物激發(fā)子誘導(dǎo)植物的防御反應(yīng)，促進(jìn)活性氧的積累，加強(qiáng)木質(zhì)素、胼胝質(zhì)等加強(qiáng)細(xì)胞壁支撐物質(zhì)的生物合成，上調(diào)FaPR1、FaCHI23、FaPDF1.2、FaCAT、FaCDPK、FaCML39等抗性基因的表達(dá)，而病原菌隱秘刺盤孢（Colletotrichum acutatumM11）能夠產(chǎn)生一種擴(kuò)散化合物抑制AsES誘導(dǎo)的植物抗性響應(yīng)[38]。

4 結(jié) 論

從無(wú)花果病果上分離出一株病原菌FC.006，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果結(jié)合基于ITS、GAPDH、TUB、CHS、ACT、CAL多基因聯(lián)合系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析鑒定為Colletotrichum horri，其能夠引起無(wú)花果炭疽病的發(fā)生。在離體條件下貝萊斯芽孢桿菌RD.006可以直接抑制FC.006菌絲的生長(zhǎng)，在培養(yǎng)8 d時(shí)的體外抑菌率達(dá)到85%，預(yù)防接種RD.006能夠激活無(wú)花果果實(shí)的苯丙烷途徑，誘導(dǎo)抗氧化相關(guān)基因表達(dá)迅速上升，RD.006可以作為一種生物激發(fā)子誘導(dǎo)果實(shí)抗性，有效防治無(wú)花果采后炭疽病害。后續(xù)研究可聚焦于RD.006抑菌活性代謝物質(zhì)的鑒定，此外，苯丙烷代謝途徑分子調(diào)控機(jī)制等還需深入研究。本研究結(jié)果可豐富無(wú)花果采后病原菌的種類，同時(shí)為采后病害的綠色防控提供理論基礎(chǔ)。