李 陽, 李曉琪, 楊佳瀅, 孫麗娟, 陳媛媛, 余 樂, 吳靜珠*

1. 北京工商大學(xué)食品安全大數(shù)據(jù)技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100048

2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所, 北京 100081

引 言

農(nóng)作物種子成分分布及其含量的不同決定了種子在萌發(fā)、 成熟、 劣變等生理活動(dòng)過程中所表現(xiàn)出的生化特性和機(jī)能存在顯著差異。 淀粉是玉米種子的重要成分, 其含量通?？蛇_(dá)種子的60%～75%[1-3]。 探究種子活力變化過程中玉米種子淀粉分布變化規(guī)律, 對(duì)于種子活力機(jī)制研究, 預(yù)防種子活力喪失、 促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有極為重要的意義。

傳統(tǒng)的種子活力變化過程中的成分檢測(cè)大都以化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法為主, 存在試樣破壞性、 操作復(fù)雜等弊端[4-5], 難以滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展提出的快速、 無損的檢測(cè)需求, 且鮮有種子成分分布研究。 近年來, 太赫茲(Terahertz, THz)時(shí)域光譜及成像技術(shù)[6-8]以其豐富的圖譜特性、 安全性和穿透性, 迅速成為農(nóng)業(yè)快速無損檢測(cè)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-12], 極有潛力成為繼近紅外、 X光技術(shù)之后的一項(xiàng)新興補(bǔ)充技術(shù)。

步正延等[13]提出一種基于THz時(shí)域光譜成像技術(shù)的大豆葉片水分含量測(cè)定方法。 實(shí)驗(yàn)利用THz透射成像系統(tǒng)采集0～2 THz范圍內(nèi)96份大豆葉片的光譜圖像; 采用自適應(yīng)閾值分割方法對(duì)3個(gè)水分敏感特征波段下的葉片圖像進(jìn)行分割, 劃分出葉片特征組、 葉脈特征組和葉肉特征組; 分別采用MLR、 BP和LS-SVM算法建立葉片水分含量預(yù)測(cè)模型, 其中基于葉肉特征組的LS-SVM模型預(yù)測(cè)集的決定系數(shù)和均方根誤差分別為0.963 2和0.046 5。 Nakajima等[14]采集了綠豆種子萌發(fā)后1～7 d的吸光度譜(3.0～13.5 THz), 基于淀粉共價(jià)振動(dòng)THz特征頻率(9.0 THz)建立綠豆幼苗淀粉含量預(yù)測(cè)模型, 相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.98。 利用THz技術(shù)進(jìn)行作物成分檢測(cè)理論上是可行的, 但現(xiàn)有研究大都采用粉碎壓片的形式制樣, 直接應(yīng)用THz時(shí)域成像技術(shù)非破壞性檢測(cè)作物成分鮮有研究報(bào)道。

本工作將THz光譜反射成像技術(shù)與移動(dòng)窗口相關(guān)系數(shù)成像法相結(jié)合, 探索無損可視化構(gòu)建玉米種子淀粉空間分布圖的可行性, 擬通過統(tǒng)計(jì)分析不同活力階段的種子淀粉分布圖探索種子活力變化與種子成分分布的內(nèi)在關(guān)系, 以期為無損探測(cè)和解析種子生理活動(dòng)提供嶄新的視角和方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品制備

實(shí)驗(yàn)以鄭單958玉米品種為例, 采用種子老化箱, 在溫度為40 ℃、 100% RH(相對(duì)濕度)條件下將種子樣本分批老化0、 18、 36、 54、 72 h, 如圖1(a)所示。

圖1 樣本制備

純淀粉標(biāo)樣所需的玉米淀粉及聚乙烯粉末均購自于賽譜銳思公司, 將玉米淀粉與高密度聚乙烯粉末按照1∶1的比例進(jìn)行充分混合, 在壓片機(jī)下制成厚度約為1 mm的薄片樣本, 圖1(b)所示。

1.2 THz-TDS反射圖像采集

采用英國Teraview公司的TeraPulse 4000太赫茲時(shí)域光譜儀以及反射成像附件, 參數(shù)設(shè)定如下: 成像區(qū)域?yàn)?0 mm×20 mm, 橫/縱向步長(zhǎng)為200 μm。

將老化0、 18、 36、 54、 72 h的玉米種子樣本(胚朝下)及純淀粉標(biāo)樣分別置于反射成像系統(tǒng)中心位置, 單個(gè)像素點(diǎn)掃描3次取平均。 環(huán)境溫度為22 ℃。 圖2所示為反射成像采集實(shí)驗(yàn)。

圖2 THz光譜反射成像儀器

1.3 相關(guān)系數(shù)成像法

相關(guān)系數(shù)成像法[15]以某一條光譜為標(biāo)準(zhǔn), 計(jì)算圖像上每一個(gè)像素點(diǎn)的光譜與標(biāo)準(zhǔn)光譜的相關(guān)系數(shù)來衡量?jī)蓚€(gè)變量因素的相關(guān)密切程度, 再根據(jù)相關(guān)系數(shù)值進(jìn)行偽彩色成像。 相關(guān)系數(shù)計(jì)算如式(1)所示

(1)

采用上述相關(guān)系數(shù)成像法計(jì)算種子各像素點(diǎn)光譜與純淀粉標(biāo)樣光譜之間的相關(guān)系數(shù), 對(duì)相關(guān)系數(shù)進(jìn)行偽彩色成像得到種子淀粉分布圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 目標(biāo)區(qū)域分割及光譜提取

單個(gè)樣本的THz反射成像數(shù)據(jù)集共包含0～269.5 cm-1區(qū)間內(nèi)281個(gè)波長(zhǎng)的灰度圖像(如圖3所示), 灰度值即為樣本在該波長(zhǎng)處的吸光度值。 在>70 cm-1后的圖像質(zhì)量較差, 種子輪廓信息幾乎被噪點(diǎn)淹沒, 因此僅保留0～70 cm-1區(qū)間內(nèi)71個(gè)波長(zhǎng)的灰度圖像做后續(xù)分析。

圖3 部分波長(zhǎng)下的種子灰度圖

以與非目標(biāo)區(qū)域區(qū)分較為明顯的16.35 cm-1的灰度圖像為基準(zhǔn), 采用閾值分割方法剔除背景, 提取種子種胚、 胚乳以及純淀粉標(biāo)樣區(qū)域。

以老化0 h樣本為例, 圖4所示為玉米種子樣本中提取的胚乳、 種胚及純淀粉標(biāo)樣區(qū)域內(nèi)計(jì)算得到的THz吸光度平均譜。 其中紅色實(shí)線所示的胚乳在28.86和51.96 cm-1處存在明顯吸收峰; 藍(lán)色實(shí)線所示的種胚在0～70 cm-1范圍內(nèi)無明顯吸收峰; 黑色實(shí)線所示的淀粉純物質(zhì)在3.84以及51.96 cm-1有明顯的吸收峰。 從圖4中可見胚乳和種胚光譜差異明顯, 這是由于兩者所含的主要成分不同導(dǎo)致的: 玉米種子胚乳成分以淀粉為主, 而種胚成分則以蛋白和脂肪為主。 胚乳和淀粉純物質(zhì)在51.96 cm-1附近存在明顯的共同吸收峰, 也從側(cè)面反映了胚乳中主要成分以含淀粉為主。

圖4 太赫茲吸光度平均譜

2.2 移動(dòng)窗口相關(guān)系數(shù)成像

以老化0 h的種子樣本為例, 應(yīng)用移動(dòng)窗口相關(guān)系數(shù)成像法構(gòu)建淀粉可視化分布圖, 步驟如下:

①移動(dòng)窗口劃分: 不同區(qū)間的光譜信息所反映的種子成分信息不同, 為找到能夠表征淀粉成分的合適譜區(qū)窗口, 實(shí)驗(yàn)設(shè)窗口寬度為20, 移動(dòng)步長(zhǎng)為10, 在0～70 cm-1范圍內(nèi)劃分得到如下6個(gè)子窗口: 1—21(0～19.24 cm-1), 11—31(9.62～28.87 cm-1), 21—41(20.21～38.49 cm-1), 31—51(29.83～48.11 cm-1), 41—61(38.49～57.74 cm-1), 51—71(48.11～67.36 cm-1);

②相關(guān)系數(shù)計(jì)算: 采用式(1)分別計(jì)算玉米種子各像素點(diǎn)與淀粉純物質(zhì)光譜在6個(gè)子窗口中的相關(guān)系數(shù);

③偽彩色成像: 根據(jù)相關(guān)系數(shù)值以及坐標(biāo)信息繪制偽彩色熱力圖, 以相關(guān)系數(shù)值大小劃分色階, 其中相關(guān)系數(shù)為1用紅色表示, 表明該像素點(diǎn)成分主要為淀粉, 相關(guān)系數(shù)為0用藍(lán)色表示, 表明該像素點(diǎn)成分與淀粉基本無關(guān), 最終6個(gè)子窗口的玉米種子-淀粉純物質(zhì)相關(guān)系數(shù)值可視化分布圖如圖5(a—f)所示。

圖5 六個(gè)移動(dòng)子窗口相關(guān)系數(shù)成像圖

圖5(d)—(f)能夠較為明顯地分辨種胚和胚乳區(qū)域淀粉分布情況, 其中胚乳區(qū)域內(nèi)的相關(guān)系數(shù)大多在0.5～1.0之間, 而種胚區(qū)域內(nèi)的相關(guān)系數(shù)大多在0～0.5之間。 胚乳區(qū)域大部分呈現(xiàn)紅色, 表明淀粉主要分布在胚乳區(qū)域, 與實(shí)際情況較為相符。

2.3 不同活力階段淀粉分布解析

當(dāng)0.80.8的像素點(diǎn)占比來量化統(tǒng)計(jì)不同活力階段的淀粉分布變化。 Ratior>0.8值越大表明種子淀粉含量越高。

(2)

由于淀粉在胚乳和種胚中含量存在顯著差異, 為精細(xì)化分析不同活力階段胚乳和種胚中淀粉的分布變化, 實(shí)驗(yàn)分別針對(duì)胚乳、 種胚、 整粒的Ratior>0.8進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3.1 胚乳淀粉分布分析

根據(jù)式(2)計(jì)算相關(guān)系數(shù)>0.8的像素點(diǎn)占胚乳比Ratior>0.8, 統(tǒng)計(jì)信息如表1所示。

表1 胚乳Ratior>0.8統(tǒng)計(jì)信息表

根據(jù)表1可得圖6所示胚乳Ratior>0.8折線圖。 在6個(gè)子窗口下, 可以直觀的觀察到Ratior>0.8在不同老化階段的數(shù)值并線性擬合出Ratior>0.8的趨勢(shì)線。 (a)—(f)窗口Ratior>0.8沒有統(tǒng)一的變化趨勢(shì)。 然而根據(jù)2.2節(jié)移動(dòng)窗口相關(guān)系數(shù)成像分析可得, 子窗口(d)—(f)的淀粉可視化分布圖與淀粉實(shí)際分布情況較為相符。 因此這里重點(diǎn)分析子窗口(d)—(f)下淀粉分布變化情況: 隨著老化時(shí)間增加, 活力逐漸下降過程中, 三個(gè)子窗口中的Ratior>0.8也在不斷變化, 可能是淀粉在分解過程中直鏈淀粉增加與支鏈淀粉減少相互抵消所導(dǎo)致; 三個(gè)子窗口中淀粉含量分布總體上均呈下降趨勢(shì), 與種子活力下降成正相關(guān)關(guān)系。

圖6 胚乳Ratior>0.8折線圖

2.3.2 種胚淀粉分布分析

與2.3.1節(jié)分析類似, 首先根據(jù)式(2)計(jì)算相關(guān)系數(shù)r>0.8的像素點(diǎn)占種胚比Ratior>0.8, 統(tǒng)計(jì)信息如表2所示。

表2 種胚Ratior>0.8統(tǒng)計(jì)信息表

根據(jù)表2得到圖7所示種胚Ratior>0.8折線圖。 種胚的Ratior>0.8總體上小于胚乳的Ratior>0.8, 這與淀粉實(shí)際分布情況相符。 種胚6個(gè)子窗口的Ratior>0.8也沒有統(tǒng)一的變化趨勢(shì)。 選取與胚乳分析相同的子窗口(d)—(f)可得: 隨著老化時(shí)間延長(zhǎng), 活力逐漸下降過程中, 三個(gè)子窗口中的Ratior>0.8也在不斷變化, 可能是淀粉在分解過程中直鏈淀粉增加與支鏈淀粉減少相互抵消所導(dǎo)致; (d)、 (e)子窗口中淀粉含量擬合曲線呈下降趨勢(shì), 與種子活力下降成正相關(guān)關(guān)系, 但(f)窗口例外, 盡管72 h的Ratior>0.8小于0 h的Ratior>0.8, 但擬合曲線整體呈上升趨勢(shì)。

圖7 種胚Ratior>0.8折線圖

2.3.3 種子淀粉分布分析

圖8所示為整粒種子相關(guān)系數(shù)>0.8的像素點(diǎn)占整體比的折線圖。 同樣在(d)—(f)窗口, 可以得到和胚乳中淀粉分布相似結(jié)論, 即隨著種子老化進(jìn)程的加劇, Ratior>0.8逐漸減小, 與擬合曲線變化趨勢(shì)線一致, 與種子活力下降成正比關(guān)系。

圖8 種子Ratior>0.8折線圖

綜合2.3.1—2.3.3節(jié)胚乳、 種胚以及整粒種子淀粉分布Ratior>0.8可得: 表征淀粉變化的特征波段位于(d)—(f)窗口即29.83～67.36 cm-1范圍內(nèi), 與純淀粉標(biāo)樣光譜特征吸收峰波段位置基本一致(50～60 cm-1之間); 在該特征譜區(qū)窗口內(nèi), 胚乳和整粒種子的Ratior>0.8振蕩下降, 且擬合趨勢(shì)線線斜率<0, 表明淀粉含量隨著活力下降在不斷降低, 這與文獻(xiàn)[16]中結(jié)論一致: 即玉米種子隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)直鏈淀粉含量增加, 支鏈淀粉含量下降, 總淀粉含量呈下降的趨勢(shì)。

3 結(jié) 論

應(yīng)用THz時(shí)域光譜反射成像技術(shù)結(jié)合相關(guān)系數(shù)成像法無損可視化構(gòu)建玉米種子淀粉分布圖: ①在29.83～67.36 cm-1特征譜區(qū)內(nèi), 淀粉分布與實(shí)際情況相符, 即淀粉主要分布在胚乳區(qū)域; ②在上述特征譜區(qū)內(nèi), 隨著老化進(jìn)程的加劇, 種子活力不斷下降, 統(tǒng)計(jì)不同活力階段的胚乳、 種胚和整粒種子的相關(guān)系數(shù)>0.8的像素點(diǎn)占比可得, 胚乳和整粒種子的Ratior>0.8不斷下降, 擬合趨勢(shì)線斜率<0, 淀粉含量總體下降, 與種子活力變化呈正相關(guān)關(guān)系。 研究結(jié)果表明: THz時(shí)域光譜成像技術(shù)結(jié)合移動(dòng)窗口相關(guān)系數(shù)偽彩色成像分析方法可以初步實(shí)現(xiàn)種子活力變化過程中玉米種子淀粉空間分布特性的無損探測(cè), 該技術(shù)有望為無損解析種子生理生態(tài)變化提供嶄新的視角和方法。