楊春暉,王文平,續(xù)丹丹

(北京食品科學(xué)研究院,北京 100068)

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種革蘭氏陽(yáng)性桿菌,其廣泛存在于灰塵、土壤和水中[1]。蠟樣芽孢桿菌在20～40 ℃的溫度條件下會(huì)迅速繁殖,并產(chǎn)生腸毒素,且蠟樣芽孢桿菌不分解蛋白質(zhì),導(dǎo)致食物在感官上變化不明顯且食用無(wú)異味,因此食用過(guò)程中不易察覺(jué)變質(zhì)情況,容易誤食而引發(fā)食物中毒[2]。蠟樣芽孢桿菌從功能上可分為益生性蠟樣芽孢桿菌和條件致病性蠟樣芽孢桿菌。益生性蠟樣芽孢桿菌具有一定的耐受性,可耐受酸堿、高溫等,可產(chǎn)生耐高熱的抗菌活性蛋白,其菌制劑已被廣泛應(yīng)用于飼料、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[3]。條件致病性蠟樣芽孢桿菌通常當(dāng)其在食物中的含量超過(guò)105CFU/mL(g)時(shí),就有可能帶來(lái)中毒癥狀。條件致病性蠟樣芽孢桿菌也成為我國(guó)食源性微生物污染的主要菌種之一,其生長(zhǎng)條件寬松,常規(guī)熱處理無(wú)法對(duì)蠟樣芽孢桿菌的孢子造成毀滅性傷害,且蠟樣芽孢桿菌能產(chǎn)生致密的生物膜,這些生物膜可以附著在食品加工設(shè)備上,形成持續(xù)污染源[4]。

腐乳是以大豆為主要原料,經(jīng)過(guò)多種發(fā)酵工藝制得的發(fā)酵食品。其味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)豐富,既可以作為烹飪輔料又可以作為佐餐食品,還具有抗氧化、抗炎等功效,在我國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中占有十分重要的地位[5]。由于腐乳的生產(chǎn)是敞開(kāi)式發(fā)酵,且不能后期滅菌,所以環(huán)境中的微生物可通過(guò)空氣、設(shè)備等在腐乳中定殖生長(zhǎng),影響腐乳品質(zhì)。近年來(lái),與腐乳相關(guān)的食品安全事件也不斷引起人們的注意,在近幾年歐盟及其他國(guó)家通報(bào)的食品數(shù)據(jù)中,腐乳、醬油都因蠟樣芽孢桿菌含量不合格而使產(chǎn)品出口受到影響[6]。因此,從腐乳食用安全與品質(zhì)的角度出發(fā),對(duì)腐乳中蠟狀芽孢桿菌的菌株來(lái)源、毒理特性、控制措施以及檢測(cè)方法進(jìn)行研究是有必要的。本文主要對(duì)蠟樣芽孢桿菌的特征、產(chǎn)毒素特性、腐乳中蠟樣芽孢桿菌的來(lái)源以及腐乳生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施等方面進(jìn)行了綜述,同時(shí)對(duì)蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法進(jìn)行了介紹,旨在為降低腐乳中蠟樣芽孢桿菌的含量、提升腐乳產(chǎn)品的質(zhì)量安全、增強(qiáng)腐乳產(chǎn)品的競(jìng)爭(zhēng)力提供參考。

1 蠟樣芽孢桿菌

1.1 蠟樣芽孢桿菌的特性

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)大小為(1.0～1.3) μm×(3.0～5.0) μm,為桿狀菌體,呼吸類型為兼性需氧,菌體表面粗糙,形狀扁平,兩端較平整。菌體周身分布有鞭毛,可以運(yùn)動(dòng),且鞭毛具有一定黏附作用。蠟樣芽孢桿菌最適生長(zhǎng)溫度為20～45 ℃,菌株耐熱,其產(chǎn)生的孢子在100 ℃下加熱30 min仍無(wú)法將其完全滅活,而干熱滅菌需要120 ℃處理60 min以上才能將其全完殺滅[7]。蠟樣芽孢桿菌具有耐高溫、耐酸堿等特點(diǎn),能產(chǎn)生耐高熱的抗菌活性蛋白。蠟樣芽孢桿菌是一種食源性致病菌,廣泛分布于大米、谷物、肉制品及豆制品等食品中[8]。據(jù)報(bào)道,全世界約20%的食源性疾病暴發(fā)是由于食物中的蠟樣芽孢桿菌污染[9],歐盟和韓國(guó)的法規(guī)要求蠟樣芽孢桿菌含量分別為低于104CFU/g[10]和不得超過(guò)103CFU/g[11]。國(guó)標(biāo)GB 31607—2021《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》中表明,對(duì)部分散裝或未經(jīng)熱處理散裝即食食品中蠟樣芽孢桿菌的限量要求為≤105CFU/g(mL)[12]。

1.2 蠟樣芽孢桿菌產(chǎn)生的毒素及致病性

蠟樣芽孢桿菌超過(guò)一定限量會(huì)產(chǎn)生毒素,從而導(dǎo)致食物中毒,引起食物中毒的兩種毒素是腹瀉型毒素和嘔吐型毒素。腹瀉型毒素主要包括溶血性腸毒素、非溶血性腸毒素、細(xì)胞毒素和腸毒素等[13],主要是不耐熱的腸毒素,這類毒素在45 ℃、30 min或56 ℃、5 min的情況下被破壞失去毒性;此類型食物中毒較少,主要中毒癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹瀉,偶有發(fā)熱、水樣腹瀉、腹部疼痛,少見(jiàn)嘔吐。一般潛伏期為6～15 h,持續(xù)時(shí)間為24 h[14]。蠟樣芽孢桿菌腹瀉綜合征是由作為活細(xì)胞或孢子攝入的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞引起的感染,被認(rèn)為在小腸中產(chǎn)生蛋白質(zhì)腸毒素[15]。

嘔吐型毒素(cereulide)引起的食物中毒比腹瀉型更嚴(yán)重,主要表現(xiàn)為惡心和嘔吐,偶爾有發(fā)燒和四肢無(wú)力等癥狀[16]。嘔吐型腸毒素是一種通過(guò)非核糖體途徑合成的十二環(huán)形多肽,其具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu),使其能夠抵抗各種惡劣環(huán)境,它在酸堿環(huán)境和126 ℃、90 min的條件下具有活性,對(duì)理化因素穩(wěn)定[13]。攜帶ces基因的蠟樣芽孢桿菌在食物中預(yù)先產(chǎn)生該毒素,進(jìn)入人體后在胃中與其受體5-HT3結(jié)合導(dǎo)致嘔吐[17]。國(guó)內(nèi)報(bào)道的蠟樣芽孢桿菌食物中毒事件多為此型毒素,引起食物中毒的食品主要有炒飯和米飯等淀粉類食物,涼面、豆腐也可以引發(fā),由于其毒素的耐熱性,所以含有此毒素的食品即使經(jīng)過(guò)高溫加熱,仍會(huì)引起食物中毒[18],潛伏期一般為0.5～6.0 h[19]。

因蠟樣芽孢桿菌導(dǎo)致的人體中毒,除腹瀉病和嘔吐病外,嚴(yán)重的還會(huì)通過(guò)菌體誘發(fā)嚴(yán)重疾病如骨髓炎、眼內(nèi)炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎和菌血癥等[20]。其致病性特點(diǎn)為死亡率不高、癥狀發(fā)生快、中毒事件廣泛。據(jù)報(bào)道,蠟樣芽孢桿菌引起的疾病不僅與攝入芽孢桿菌的量有關(guān),也可能與蠟樣芽孢桿菌菌株、宿主生理及食物本身有關(guān)[21]。近年來(lái)關(guān)于蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒事件較多,2021年北京海淀區(qū)某小學(xué)有9名學(xué)生共同食用配餐公司的營(yíng)養(yǎng)午餐后出現(xiàn)腹痛、腹瀉、嘔吐等癥狀,留樣食品檢測(cè)、接觸食品的工具檢測(cè)結(jié)果表明盒飯中的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量為4.0×105CFU/g,因此該事件判定為營(yíng)養(yǎng)配餐公司提供的盒飯引起的蠟樣芽孢桿菌食物中毒[22]。2021年6月,山東淄博的2名大學(xué)生同時(shí)出現(xiàn)惡心、嘔吐、精神萎靡的癥狀,病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明,2人食用了長(zhǎng)時(shí)間存放且儲(chǔ)存條件不當(dāng)?shù)陌b雞腿,該食物長(zhǎng)期存放在較高溫度下,蠟樣芽孢桿菌快速繁殖達(dá)到致病數(shù)量,造成蠟樣芽孢桿菌食物中毒[23]。

2 腐乳及其生產(chǎn)過(guò)程中的蠟樣芽孢桿菌

腐乳是我國(guó)傳統(tǒng)的大豆發(fā)酵食品之一,其滋味鮮美、風(fēng)味獨(dú)特、富含優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)素,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,深受廣大消費(fèi)者青睞[24]。腐乳是經(jīng)過(guò)大豆浸泡、磨豆、煮漿、點(diǎn)漿、壓榨、切塊、排塊、接種毛霉、前發(fā)酵、加鹽腌制、裝瓶、灌湯、后酵等一系列工藝制作而成的,腐乳的生產(chǎn)工藝流程見(jiàn)圖1。由于腐乳生產(chǎn)的一些環(huán)節(jié)需要在開(kāi)放的環(huán)境中進(jìn)行,無(wú)法避免地引入環(huán)境中的微生物,且后期不能滅菌,故腐乳中檢出的微生物種類繁多[5]。其中食源性致病菌蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌在市售腐乳中有檢出[25]。腐乳中蠟樣芽孢桿菌問(wèn)題不容忽視,因此有必要對(duì)腐乳生產(chǎn)過(guò)程中的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行溯源。

圖1 腐乳的生產(chǎn)工藝流程Fig.1 Production process of sufu

點(diǎn)漿過(guò)程用到的酸漿水是豆腐壓榨產(chǎn)生的大豆黃漿水經(jīng)自然發(fā)酵得到的,如果黃漿水和工器具被蠟樣芽孢桿菌污染,則二者就會(huì)成為傳遞蠟樣芽孢桿菌的介質(zhì),蠟樣芽孢桿菌被帶到豆腐中快速繁殖;豆腐塊排放冷卻時(shí),豆腐塊接觸人手和器具,可能使豆腐塊污染蠟樣芽孢桿菌,此后蠟樣芽孢桿菌附著在營(yíng)養(yǎng)豐富的豆腐塊上快速生長(zhǎng);豆腐塊接種毛霉發(fā)酵后,在開(kāi)放的環(huán)境中蠟樣芽孢桿菌快速生長(zhǎng)繁殖,其數(shù)量可增長(zhǎng)至106CFU/g;由于鹽可在一定程度上抑制蠟樣芽孢桿菌,所以豆腐塊加鹽腌制過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌增長(zhǎng)緩慢;裝瓶灌湯后,由于食鹽、酒精及厭氧環(huán)境的作用,蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制,在腐乳發(fā)酵后熟和制成成品后,其數(shù)量分別降至105CFU/g和104CFU/g數(shù)量級(jí)[26]。因此,腐乳生產(chǎn)過(guò)程中點(diǎn)漿、豆腐排塊、發(fā)酵、腌制等環(huán)節(jié)是蠟樣芽孢桿菌污染的高風(fēng)險(xiǎn)環(huán)節(jié),如能嚴(yán)格控制豆腐和毛坯中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量,則腐乳產(chǎn)品中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量可相應(yīng)降低。

多數(shù)學(xué)者對(duì)腐乳生產(chǎn)過(guò)程中的蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了監(jiān)測(cè),Guan等[27]檢出的腐乳中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量略有不同,但是蠟樣芽孢桿菌數(shù)量趨勢(shì)依然為豆腐坯子中的含量高于鹽漬后的豆腐坯。金澤坤[7]對(duì)腐乳工廠的蠟樣芽孢桿菌污染狀況進(jìn)行了分析,結(jié)果表明78.91%的樣品呈蠟樣芽孢桿菌陽(yáng)性,且毛霉發(fā)酵階段是腐乳中蠟樣芽孢桿菌的增殖關(guān)鍵階段。對(duì)不同工藝的紅腐乳、白腐乳和青腐乳制作工藝環(huán)節(jié)進(jìn)行采樣分析考察,結(jié)果表明不同工藝的腐乳在各環(huán)節(jié)污染程度不同,原材料、人工操作污染、空氣環(huán)境以及設(shè)備污染等都能引入蠟樣芽孢桿菌導(dǎo)致腐乳污染[28]。張偉偉對(duì)腐乳生產(chǎn)流程的蠟樣芽孢桿菌及菌落總數(shù)進(jìn)行了測(cè)定和分析,結(jié)果表明蠟樣芽孢桿菌主要分布于車間的空氣、生產(chǎn)器具、毛坯車間的空氣、毛坯及毛坯屜以及湯料車間的空氣及湯料中。

3 腐乳及其生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施

3.1 添加植物精油

很多植物都具有天然抗菌功效,人們也經(jīng)常使用植物中萃取得到的精油來(lái)抑制食物腐敗變質(zhì)。精油最常見(jiàn)的抑菌機(jī)制是膜破壞(見(jiàn)圖2),精油的親脂疏水性促進(jìn)其在細(xì)胞質(zhì)膜的磷脂雙分子層中積累,影響細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)完整性和功能,還可導(dǎo)致細(xì)胞成分和功能的喪失,甚至細(xì)胞破裂、凋亡,阻止細(xì)菌正常代謝。雖然細(xì)菌對(duì)滲漏有一定的耐受性,但這些細(xì)胞化合物的大量損失可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡,從而達(dá)到抑菌作用[29]。

圖2 植物精油中生物活性化合物的抑菌作用機(jī)制Fig.2 The antibacterial mechanism of bioactive compounds in plant essential oils

大蒜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富,大蒜精油中含有多種殺菌物質(zhì),如大蒜辣素、蒜氨酸、阿藿烯等,是一種天然抑菌劑[30]。將大豆煮漿后添加32.5 μg/L大蒜精油,以此處理的腐乳各加工階段的蠟樣芽孢桿菌數(shù)量均有所下降,成品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量控制在5 log CFU/g以下,極大地降低了腐乳引起食源性疾病的風(fēng)險(xiǎn);同時(shí)加入的大蒜精油可優(yōu)化細(xì)菌成分,促進(jìn)乳酸菌在發(fā)酵過(guò)程中的生長(zhǎng),可能是大蒜精油改變了部分細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性[31]。而且在腐乳發(fā)酵過(guò)程中加入大蒜精油對(duì)中極性代謝產(chǎn)物(碳水化合物、有機(jī)酸、生物胺、游離氨基酸)和揮發(fā)性化合物均無(wú)顯著影響[32]。

肉桂中含約2%的揮發(fā)油,其氣味溫和,很多試驗(yàn)證明其有很明顯的抑菌作用,且主要有效殺菌成分為肉桂醛。向蠟樣芽孢桿菌總數(shù)為106CFU/mL的腐乳湯汁中添加用95%乙醇稀釋至10-6和10-7的肉桂精油時(shí),37 ℃培養(yǎng)1 d后檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌總數(shù),結(jié)果表明其數(shù)量降低至103CFU/mL,降低了3個(gè)數(shù)量級(jí)[16]。青花椒精油是一種天然的精油,是食品工業(yè)中有前途的化學(xué)食品防腐劑代替品。青花椒精油同樣可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜和細(xì)胞壁,引起細(xì)胞質(zhì)滲漏、細(xì)胞膜損傷、能量代謝紊亂和氨基酸代謝紊亂,其對(duì)蠟樣芽孢桿菌的最小殺菌濃度和最小抑菌濃度分別為2.0 mg/mL和4.0 mg/mL[33]。

佛手柑精油是從佛手柑果皮中萃取得到的,其味道清新,有類似檸檬的香氣。其可以通過(guò)影響細(xì)胞膜完整性的作用機(jī)制,抑制蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)[34]。以上研究均表明,添加天然植物精油于食品中,在保證食品安全性的同時(shí),還能起到有效抑菌作用,具有廣闊的應(yīng)用前景。

3.2 添加抑菌素

表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)和乳酸鏈球菌素(Nisin)等已逐漸成為具有應(yīng)用前景的抑菌素。乳酸鏈球菌素可以改變有害微生物細(xì)胞的pH,使細(xì)胞瀕臨死亡。王舒叆等研究表明,添加0.025%的EGCG以及Nisin對(duì)青稞濕面中的蠟樣芽孢桿菌菌落數(shù)有一定的抑制作用,但是Nisin受環(huán)境的影響較大[35]。黃現(xiàn)青等研究了Nisin、聚賴氨酸、殼聚糖對(duì)蠟樣芽孢桿菌指示菌的抑菌效果,結(jié)果表明三者對(duì)蠟樣芽孢桿菌均有一定的抑制效果,Nisin和聚賴氨酸對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺菌效果最好,在質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL和0.01 mg/mL時(shí)殺菌率達(dá)83.85%[36]。將乳酸鏈球菌素作用于萌發(fā)狀態(tài)的蠟樣芽孢桿菌處理15 min,其芽孢殺滅率可達(dá)到99.62%,且作用體系中加入萌發(fā)劑可以明顯提升芽孢的殺滅率[37]。

3.3 使用環(huán)境消毒劑

莫金觀等[38]分別采用含量為750 mg/L的二氧化氯、2 000 mg/L的過(guò)氧乙酸對(duì)蠟樣芽孢桿菌菌懸液作用1.5 min,采用15 g/L過(guò)氧化氫作用1.5 min,考察了其對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺菌效果。結(jié)果表明,二氧化氯和過(guò)氧乙酸對(duì)菌懸液內(nèi)蠟樣芽孢桿菌殺滅數(shù)量均大于105數(shù)量級(jí),過(guò)氧化氫對(duì)蠟樣芽孢桿菌的殺菌效率則相對(duì)較低,表明采用二氧化氯和過(guò)氧乙酸溶液噴灑生產(chǎn)工具有一定的殺滅蠟樣芽孢桿菌效果。張鑒平提到以2%的過(guò)氧乙酸溶液噴霧室內(nèi)表面30 min,室內(nèi)空氣熏蒸60 min后可以有效殺滅蠟樣芽孢桿菌。

3.4 工藝環(huán)節(jié)的監(jiān)控

腐乳生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)該將蠟樣芽孢桿菌數(shù)量降到最低范圍,以保證后期發(fā)酵時(shí)及成品中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量處于安全范圍。所以提出以下幾條針對(duì)性的控制措施:

第一,輔料微生物控制。由于酸漿水和鹽水直接參與腐乳的發(fā)酵,其微生物種類和數(shù)量會(huì)直接影響腐乳的品質(zhì),所以對(duì)二者存在的環(huán)節(jié)應(yīng)該嚴(yán)格把控,如對(duì)酸漿水和鹽水進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù),一旦有異常應(yīng)及時(shí)采取措施。配制鹽水時(shí)應(yīng)使用涼開(kāi)水,且鹽水不能長(zhǎng)期存放或者循環(huán)使用,應(yīng)該現(xiàn)用現(xiàn)配,也可考慮加大食鹽用量、縮短腌制時(shí)間來(lái)抑制蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)[28]。紅腐乳灌湯所用的湯料中含有面曲及紅曲,其淀粉含量高,適宜蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng),所以還需加強(qiáng)對(duì)湯料品質(zhì)的監(jiān)控。

第二,生產(chǎn)工具消毒。由于生產(chǎn)過(guò)程中壓豆腐產(chǎn)生的黃漿水是敞開(kāi)放置的,隔夜自然發(fā)酵至第2天成為酸漿水,其通過(guò)靠近地面的半封閉管道進(jìn)入下一生產(chǎn)環(huán)節(jié),用于豆腐點(diǎn)漿。但是黃漿水營(yíng)養(yǎng)成分豐富,有機(jī)物含量高,易于微生物生長(zhǎng)繁殖,容易變質(zhì)污染管道以及周邊空氣環(huán)境,所以應(yīng)使用食品級(jí)的清洗溶液對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中管道進(jìn)行CIP系統(tǒng)清洗消毒處理,且管道須全密閉[39]。由于蠟樣芽孢桿菌能附著于食物接觸面、生產(chǎn)設(shè)備、不銹鋼工具等表面并形成生物膜,并在表面積累繁殖,所以在白坯車間應(yīng)該對(duì)放置白坯的托盤(pán)、鏈條等工具進(jìn)行按時(shí)滅菌消毒處理。如采用濕熱滅菌的方式對(duì)腐乳生產(chǎn)用布料進(jìn)行滅菌、用次氯酸鈉對(duì)器具進(jìn)行清洗消毒再高溫蒸汽滅菌等[40]。

第三,車間控制措施。整個(gè)廠區(qū)的環(huán)境衛(wèi)生應(yīng)保持清潔,加強(qiáng)防蟲(chóng)、防鼠措施,對(duì)腐乳生產(chǎn)車間進(jìn)行消毒,對(duì)發(fā)酵房進(jìn)行噴灑醋酸預(yù)處理,形成弱酸性環(huán)境后再進(jìn)行發(fā)酵,這樣可以進(jìn)一步改善發(fā)酵環(huán)境,抑制雜菌生長(zhǎng)[41]。在發(fā)酵房的預(yù)處理方面,還可以使用紫外燈照射25～40 min,或者采用臭氧、冰醋酸對(duì)生產(chǎn)車間進(jìn)行消毒,通過(guò)以上處理后,空氣中蠟樣芽孢桿菌數(shù)量明顯降低[26]。

腐乳生產(chǎn)行業(yè)應(yīng)進(jìn)一步強(qiáng)化管理,加強(qiáng)對(duì)腐乳生產(chǎn)環(huán)節(jié)的監(jiān)測(cè),制定嚴(yán)格的操作衛(wèi)生管理制度,建立有效的危害分析與關(guān)鍵控制點(diǎn)(hazard analysis and critical control point,HACCP)體系以及ISO22000食品安全質(zhì)量管理體系,從而有效控制腐乳及生產(chǎn)過(guò)程中的蠟樣芽孢桿菌。

3.5 其他控制措施

電離輻射可作用于環(huán)境或者組成微生物的物質(zhì),使物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基,再作用于生物分子,破壞或者改變微生物大分子結(jié)構(gòu),從而起到抑菌作用。常用放射性同位素銫-137和鈷-60發(fā)射出γ射線,對(duì)食品進(jìn)行輻照處理,該方法效率高、無(wú)殘留、對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)成分不造成破壞,但是缺點(diǎn)是設(shè)備貴重,需專業(yè)人員管理[7]。黃訓(xùn)端等[42]采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì),考察了高靜壓處理蠟樣芽孢桿菌菌懸液對(duì)其致死率的影響,結(jié)果表明壓力、溫度、時(shí)間對(duì)菌株致死率均有顯著影響,在500 MPa、60 ℃處理20 min的條件下蠟樣芽孢桿菌致死率達(dá)100%。低溫發(fā)酵對(duì)蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞的影響結(jié)果表明,低溫和厭氧條件限制了蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng),部分原因是無(wú)法合成適應(yīng)低溫所必需的低熔點(diǎn)脂肪酸,且低溫條件下發(fā)酵代謝也進(jìn)行了改變,所以可以通過(guò)調(diào)整后酵溫度和真空條件來(lái)抑制包裝腐乳中蠟樣芽孢桿菌的生長(zhǎng)[43]。Bandara等[44]研究了噬菌體對(duì)發(fā)酵食品中蠟樣芽孢桿菌的殺滅效果,從13個(gè)韓國(guó)發(fā)酵食品中分離得到2個(gè)噬菌體,它們的寄主范圍均局限于蠟樣芽孢桿菌,可以用于抑制蠟樣芽孢桿菌在發(fā)酵食品系統(tǒng)模型中的生長(zhǎng),優(yōu)化噬菌體的反應(yīng)條件是成功利用噬菌體進(jìn)行生物防治的關(guān)鍵。

4 蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法

4.1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

蠟樣芽孢桿菌傳統(tǒng)檢測(cè)方法包括平板計(jì)數(shù)法和MPN計(jì)數(shù)法。國(guó)標(biāo)GB 4789.14—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)》是我國(guó)規(guī)定的檢測(cè)食品中蠟樣芽孢桿菌的標(biāo)準(zhǔn)方法。傳統(tǒng)培養(yǎng)即通過(guò)各種不同的顯色培養(yǎng)基,使該菌產(chǎn)生特有的顏色與菌落形態(tài)。除了以上傳統(tǒng)的方法外,還可通過(guò)自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)菌種進(jìn)行鑒定。目前常用的全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀有PhoenixTM-100和VITEK 2。前者可以同時(shí)對(duì)100個(gè)樣本進(jìn)行51項(xiàng)藥敏試驗(yàn)和生化反應(yīng),僅有革蘭氏陰性和陽(yáng)性兩種檢測(cè)卡,選板方便;后者可以進(jìn)行30多項(xiàng)生化反應(yīng)。全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)優(yōu)于普通生化反應(yīng)項(xiàng)目,可信度高、簡(jiǎn)單快速、結(jié)果準(zhǔn)確[45-46]。但是通過(guò)以上傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法和生化檢測(cè)方法無(wú)法說(shuō)明細(xì)菌產(chǎn)毒素的能力,具有一定的局限性。

4.2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

4.2.1 傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)是一種廣泛使用的食源性病原體檢測(cè)技術(shù),基于DNA聚合酶產(chǎn)生特定DNA序列的體外擴(kuò)增。直到2004年,PCR才可用于特異性檢測(cè)嘔吐型蠟樣芽孢桿菌引物,因?yàn)橄灅与纳锖铣傻姆肿訖C(jī)制尚不清楚。基于微生物特異性靶基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)方法,利用DNA聚合酶擴(kuò)增蠟樣芽孢桿菌的特異性基因片段,從而對(duì)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行快速檢測(cè)。PCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌的特異性靶基因主要有16S rRNA、rpoB、gyrB和groEL等,其中16S rRNA具有高度保守性,是蠟樣芽孢桿菌的高拷貝保守基因;rpoB和gyrB分別編碼RNA聚合酶β-亞基和DNA旋轉(zhuǎn)酶β-亞基,groEL可編碼分子伴侶蛋白[47-48]。當(dāng)使用不同的引物時(shí),測(cè)定的快速性和靈敏性可能不同。目前用于檢測(cè)嘔吐型蠟樣芽孢桿菌的主要方法是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),且PCR法仍然是嘔吐型蠟樣芽孢桿菌檢測(cè)的最可靠方法[49]。

4.2.2 多重PCR檢測(cè)

多重PCR檢測(cè)指在同一體系中,放入多對(duì)引物對(duì)其進(jìn)行同時(shí)擴(kuò)增的一種PCR檢測(cè),其原理類似于普通PCR。但是多重PCR更加敏捷快速,可以同時(shí)檢測(cè)較高同源性的芽孢桿菌菌株[50]。通過(guò)設(shè)計(jì)引物和探針,優(yōu)化反應(yīng)條件,建立多重PCR方法檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌16S rRNA保守區(qū)基因及其編碼致嘔吐型毒素cereulide的ces基因,結(jié)果表明與菌株鑒定結(jié)果的符合率為100%[51]。Hikmate等[52]用多重PCR方法分離并檢測(cè)了谷物和玉米發(fā)酵制品中蠟樣芽孢桿菌的pXO1和pXO2質(zhì)粒[53],結(jié)果表明大部分族群有溶血素,其中兩個(gè)亞種具有腸毒素活性。

4.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)檢測(cè)技術(shù)是通過(guò)將可被檢測(cè)到的熒光化學(xué)劑放入PCR體系中,根據(jù)其產(chǎn)生信號(hào)的強(qiáng)弱判斷PCR產(chǎn)物的量從而實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的方法。王振國(guó)等[54]采用RT-qPCR檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌,其檢出限為8 CFU/mL,且用PCR技術(shù)對(duì)食物樣品中致病性蠟樣芽孢桿菌的檢出限低。劉芳等[55]采用實(shí)時(shí)熒光PCR法對(duì)與腸毒素、非溶血性腸毒素、嘔吐型毒素等相關(guān)的基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明方法特異性好,檢出限可達(dá)63 CFU/mL。RT-qPCR的擴(kuò)增和檢測(cè)一步即可完成,特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)周期短;缺點(diǎn)是需要昂貴的設(shè)備和試劑。

4.2.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技術(shù)是一種核酸擴(kuò)增方法,與常規(guī)PCR相比,不需要模板熱變形、溫度循環(huán)等過(guò)程,等溫環(huán)境下即可工作,陽(yáng)性結(jié)果可以肉眼直接觀察評(píng)估,可用于蠟樣芽孢桿菌的快速檢測(cè)[56]。LAMP針對(duì)靶基因的6個(gè)不同區(qū)域,然后設(shè)計(jì)4個(gè)特異性引物以高選擇性擴(kuò)增靶序列。賈雅菁等[57]根據(jù)蠟樣芽孢桿菌溶血性腸毒素基因hblA序列設(shè)計(jì)引物后建立環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)方法,對(duì)溶血毒素的hblA基因進(jìn)行鑒定,結(jié)果表明該方法比普通環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的敏感度高出10倍。齊哲[58]通過(guò)建立LAMP對(duì)蠟樣芽孢桿菌的快速測(cè)定方法進(jìn)行研究,結(jié)果表明LAMP擴(kuò)增時(shí)間段最短僅需20 min,實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果顯示,該方法敏感性為100%,特異性為72.7%,符合率為94.5%。該方法擴(kuò)增反應(yīng)程序比經(jīng)典PCR和RT-qPCR需要的時(shí)間更少,不需要昂貴的設(shè)備,但是該方法存在假陽(yáng)性率,且需要復(fù)雜的多引物設(shè)計(jì),對(duì)初學(xué)者來(lái)說(shuō)比較麻煩。

4.3 免疫學(xué)檢測(cè)方法

免疫學(xué)檢測(cè)方法是將被檢測(cè)的樣品作為抗原,通過(guò)免疫反應(yīng)制備單克隆抗體,再通過(guò)抗原抗體的反應(yīng)判斷其含量的方法[47],最常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法,其次為膠體金法。ELISA是將待測(cè)物與酶連接,通過(guò)酶與底物的顏色反應(yīng)可以直接定量大分子質(zhì)量的蛋白或細(xì)菌,也可以直接檢測(cè)蠟樣芽孢桿菌細(xì)胞以及毒素。即使樣品中有多種致病菌,也可以準(zhǔn)確地定量到蠟樣芽孢桿菌。通過(guò)膠體金檢測(cè)試紙條法測(cè)定蠟樣芽孢桿菌溶血素和非溶血性腸毒素,檢測(cè)時(shí)間短,僅需30 min。但是由于蠟樣芽孢桿菌不同菌株的產(chǎn)毒能力不同,以少數(shù)毒素作為檢測(cè)靶標(biāo)可能導(dǎo)致漏檢。但與酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法相比,膠體金法操作程序簡(jiǎn)單,結(jié)果直觀,適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[59]。

4.4 全基因組測(cè)序技術(shù)

全基因組測(cè)序是一種分析細(xì)菌全基因組的綜合方法。該方法不但能對(duì)菌種進(jìn)行鑒定,而且能對(duì)致病菌進(jìn)行分型,鑒定其毒力基因與耐藥基因,進(jìn)一步分析致病性[60]。與傳統(tǒng)PCR預(yù)測(cè)毒素產(chǎn)生能力相比,全基因組測(cè)序可以更好地預(yù)測(cè)溶血性腸毒素基因hbl和非溶血性腸毒素基因nhe的表達(dá),提供更多有關(guān)遺傳流行病學(xué)、毒理和抗菌基因的存在以及與這種被低估的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的潛在危害的有用信息[49]。盡管蠟樣芽孢桿菌每年會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)多的食源性疾病病例,但其相對(duì)溫和的感染過(guò)程導(dǎo)致很少以足夠嚴(yán)格的方法來(lái)調(diào)查感染情況,所以關(guān)于嘔吐型蠟樣芽孢桿菌基因組多樣性的全基因組測(cè)序參考數(shù)據(jù)和信息比較有限。

5 結(jié)論與展望

本研究對(duì)腐乳中蠟樣芽孢桿菌的來(lái)源、產(chǎn)生的毒素類型進(jìn)行了綜述,對(duì)腐乳及生產(chǎn)過(guò)程中蠟樣芽孢桿菌的控制措施進(jìn)行了分析,最后對(duì)蠟樣芽孢桿菌的檢測(cè)方法進(jìn)行了介紹。雖然蠟樣芽孢桿菌及其孢子在食品中的存在確實(shí)難以避免,但如果采用適當(dāng)?shù)募庸l件和防治措施,則可以有效降低各生產(chǎn)階段中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量,從而降低蠟樣芽孢桿菌污染。因此,良好的操作規(guī)范和嚴(yán)格執(zhí)行食品標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)對(duì)食品生產(chǎn)者來(lái)說(shuō)是必要的。本研究為腐乳生產(chǎn)中蠟樣芽孢桿菌的控制提供了參考,為提高生產(chǎn)企業(yè)的腐乳質(zhì)量安全水平提供了借鑒。