李長庚,趙思宇,李旭,趙春光,徐慶陽,3,4*

(1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院,天津 300457;2.寧夏伊品生物科技股份有限公司,銀川 750100;3.代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實驗室,天津 300457;4.天津市氨基酸高效綠色制造工程實驗室,天津 300457)

L-酪氨酸(L-tyrosine)是一種條件必需氨基酸,在動物及人體的新陳代謝和生長發(fā)育中起重要作用,廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工等行業(yè)[1-5]。隨著對酪氨酸功能開發(fā)研究的逐漸深入,其市場需求仍在不斷擴大。當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)L-酪氨酸的方式主要為提取法、酶催化法、化學(xué)法及生物發(fā)酵法[6],而利用代謝工程改造的大腸桿菌以葡萄糖為原料的生物發(fā)酵法具備成本低、生產(chǎn)周期較短、環(huán)境污染相對較小等優(yōu)點適合工業(yè)化生產(chǎn),成為目前最具潛力的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)L-酪氨酸的方式之一。但目前此方法生產(chǎn)L-酪氨酸依然存在產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率偏低及副產(chǎn)物較多等問題,這些問題亟待解決。

探究合適的發(fā)酵培養(yǎng)基配方且對發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化是提升大腸桿菌發(fā)酵能力的有效方法之一[7]。而膽堿類物質(zhì)是磷脂、卵磷脂合成過程中的前體物,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動中起到非常重要的作用[8-9]。研究表明,提供適量的氯化膽堿有利于菌體細(xì)胞膜的合成,可提高菌體生長速率[10];氯化膽堿作為甲基供體能夠在菌體代謝中的多種甲基化反應(yīng)中提供所需的活性甲基,進(jìn)而提高菌體活力,利于產(chǎn)酸[11]。因此,本試驗以氯化膽堿作為優(yōu)化因素,以達(dá)到提升大腸桿菌L-酪氨酸發(fā)酵能力的目標(biāo)。

本研究探究了發(fā)酵培養(yǎng)基中氯化膽堿的最佳添加量,并在此基礎(chǔ)上探究不同的添加方式對發(fā)酵能力的影響,從中選定最佳添加方式為全營養(yǎng)流加,并對此進(jìn)行工藝優(yōu)化。優(yōu)化后的菌體量、L-酪氨酸產(chǎn)量及轉(zhuǎn)化率得到不同程度的提升,且副產(chǎn)物的積累也大幅度降低,為今后大腸桿菌工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

大腸桿菌TYR-05(PT7-aroGfbr+PT7-tyrAfbrtyrB+PxylF-T7RNAP+ΔpheLA):天津科技大學(xué)代謝工程實驗室保藏菌種。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:酵母浸出粉5 g/L,氯化鈉2.5 g/L,KH2PO41.0 g/L,MgSO40.2 g/L,牛肉膏10 g/L,瓊脂粉25 g/L,葡萄糖1 g/L,蛋白胨10 g/L,pH 7.0～7.2,121 ℃濕熱滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基:葡萄糖30 g/L,微量元素混合液1 mL/L,檸檬酸鈉 2.0 g/L,酵母粉5 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,KH2PO43.0 g/L,蛋白胨2.0 g/L,(NH4)2SO44.0 g/L,FeSO4·7H2O 5 mg/L,MnSO4·H2O 1.2 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液 0.5 mg/L,微量元素混合液 1 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃濕熱滅菌15 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基:葡萄糖10 g/L,檸檬酸鈉 2.0 g/L,FeSO4·7H2O 30 mg/L,酵母粉5.0 g/L,(NH4)2SO45.0 g/L,KH2PO4·3H2O 4.0 g/L,MgSO4·7H2O 2.0 g/L,MnSO4·H2O 10 mg/L,VH1 mg/L,VB混合液 0.5 mg/L,微量元素混合液 1.5 mL/L,pH 7.0～7.2,115 ℃濕熱滅菌15 min。

1.1.3 試劑

MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、(NH4)2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O(均為分析純):天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;蛋白胨、酵母粉(均為生化試劑):英國Thermo Fisher Oxoid公司;NaCl(分析純):天津市登峰化學(xué)試劑廠;一水合葡萄糖(食品級):天津金匯太亞化學(xué)試劑有限公司;檸檬酸鈉(分析純):上海阿拉丁生化科技股份有限公司;谷氨酸(分析純):天津希恩思生化科技有限公司;氯化膽堿、酪氨酸(均為分析純):上海麥克林生化科技有限公司;乙酸(色譜級)、乙腈(色譜純):國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1800系列紫外分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;TG16-W高速臺式離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;SBA-40E 生物傳感分析儀 山東省科學(xué)院生物研究所;YXQ-LB-100SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司;5 L機械攪拌發(fā)酵罐 上海保興生物設(shè)備工程有限公司;JADE-PAK?ODS-AQ C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 廣州太瑋生物科技有限公司;LC-UV100液相色譜儀 上海伍豐科學(xué)儀器有限公司;

1.3 方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵

取試驗菌株大腸桿菌TYR-05劃線接種于活化斜面,37 ℃培養(yǎng)12 h后轉(zhuǎn)接至茄形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)12 h;取適量無菌水于茄形瓶中,將菌液接入含種子培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中繼續(xù)培養(yǎng),pH維持在7.0～7.2,溫度恒定在37 ℃,溶氧在30%～50%;待種子菌體量(OD600 nm)達(dá)到25左右時,按照20%接種量將種子液接入新鮮的發(fā)酵培養(yǎng)基中,定容至3 L。發(fā)酵過程中pH控制在7.0～7.2,溫度維持在37 ℃,溶氧在30%～60%,每2 h取1～3 mL發(fā)酵液進(jìn)行測定,pH通過蠕動泵流加氨水維持。

1.3.2 試驗方法

1.3.2.1 氯化膽堿添加濃度優(yōu)化試驗

在不同批次發(fā)酵培養(yǎng)基底物中分別添加濃度為0,0.2,0.4,0.6 g/L的氯化膽堿進(jìn)行5 L發(fā)酵罐試驗,確定最佳的濃度。

1.3.2.2 氯化膽堿添加方式優(yōu)化試驗

氯化膽堿的添加方式見表1。

表1 氯化膽堿的添加方式Table 1 Addition methods of choline chloride

1.3.2.3 氯化膽堿全營養(yǎng)流加工藝優(yōu)化試驗

氯化膽堿在底物培養(yǎng)基與流加培養(yǎng)基中比例優(yōu)化試驗見表2,氯化膽堿的流加時間與流加速度優(yōu)化試驗見表3。

表2 氯化膽堿在底物培養(yǎng)基與流加培養(yǎng)基中比例優(yōu)化試驗Table 2 Optimization test of choline chloride ratio in substrate medium and fed-batch medium

表3 氯化膽堿的流加時間與流加速度優(yōu)化試驗Table 3 Optimization test of feeding time and feeding speed of choline chloride

1.3.3 檢測方法

發(fā)酵過程中pH、溫度、溶氧、罐壓、通風(fēng)量、菌體量、殘?zhí)堑臏y定方法見參考文獻(xiàn)[12]。

L-酪氨酸濃度的測定:將發(fā)酵液進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)的稀釋以使L-酪氨酸晶體全部溶解,以13 000 r/min離心2 min,再用去離子水將上清液稀釋至一定倍數(shù),經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用高效液相色譜儀(HPLC)進(jìn)行檢測。色譜條件:JADE-PAK?ODS-AQ C18高效液相色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為10%乙腈溶液,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃,保留時間為12 min,紫外檢測波長為230 nm[13]。

1.3.4 糖酸轉(zhuǎn)化率的計算

糖酸轉(zhuǎn)化率的計算見參考文獻(xiàn)[14]。

1.3.5 乙酸等副產(chǎn)物的測定

乙酸的檢測見參考文獻(xiàn)[15],谷氨酸的檢測見參考文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 氯化膽堿濃度對發(fā)酵能力的影響

在原發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為0,0.2,0.4,0.6 g/L的氯化膽堿,并以0 g/L的發(fā)酵組作為空白組,探究添加不同濃度的氯化膽堿對大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸的影響。

2.1.1 氯化膽堿濃度對菌體生長與L-酪氨酸產(chǎn)量的影響

由圖1可知,隨著氯化膽堿添加濃度逐漸增加,發(fā)酵前期的生長速率也隨之加快,且進(jìn)入菌體穩(wěn)定期的時間縮短,當(dāng)培養(yǎng)基中氯化膽堿添加量大于0.4 g/L時,菌體生長速率提升不明顯,最大菌體量也隨添加濃度的增加而提高。當(dāng)氯化膽堿濃度為0.6 g/L時達(dá)最高,此時OD600 nm為86.6,較空白組提升了14.55%;隨著底物中氯化膽堿添加濃度逐漸增加,L-酪氨酸的最終產(chǎn)量也隨之增長,當(dāng)添加量為0.6 g/L時達(dá)最高產(chǎn)量50.5 g/L,較空白組提高了7.91%。

圖1 氯化膽堿添加濃度對菌體量和L-酪氨酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of choline chloride addition concetration on biomass and L-tyrosine yield

2.1.2 氯化膽堿濃度對副產(chǎn)物與糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

乙酸和谷氨酸都是大腸桿菌有氧發(fā)酵中常見的副產(chǎn)物,其中乙酸的積累不僅會限制菌體的生長[17-18],而且會抑制產(chǎn)物的合成[19],但蛋氨酸可以有效緩解乙酸積累對大腸桿菌的抑制作用[20],乙酸與谷氨酸的形成仍會造成碳源的流失進(jìn)而降低糖酸轉(zhuǎn)化率[21]。

由圖2可知,隨著氯化膽堿添加濃度的提高,乙酸及谷氨酸的產(chǎn)量均呈上升趨勢,添加0.6 g/L氯化膽堿組最高,較空白對照組分別提高了53.23%、48.57%;糖酸轉(zhuǎn)化率隨氯化膽堿添加濃度的增加呈下降趨勢,0.2 g/L組、0.4 g/L組與0.6 g/L組較空白對照組分別下降了1.54%、2.32%、6.79%,其中0.6 g/L組下降幅度較大。

圖2 氯化膽堿添加量對副產(chǎn)物量與糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effect of choline chloride addition amount on the yied of by-products and sugar-acid conversion rate

以上試驗結(jié)果顯示,當(dāng)氯化膽堿添加濃度為0.4,0.6 g/L時,對L-酪氨酸最終產(chǎn)量及菌體生長均有較明顯的促進(jìn)作用,但兩組之間影響效果差異較小;除此之外,隨著氯化膽堿添加濃度的增加,乙酸等副產(chǎn)物增多,糖酸轉(zhuǎn)化率隨之下降,但0.4 g/L組下降趨勢較小,此時糖酸轉(zhuǎn)化率比0.6 g/L組高4.8%。故選擇氯化膽堿的最佳添加濃度為0.4 g/L,此時L-酪氨酸終產(chǎn)量和最大菌體量較空白組分別提升了6.2%、13.36%。

2.2 氯化膽堿的添加方式對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響

本部分試驗以2.1中底物添加0.4 g/L氯化膽堿濃度發(fā)酵組為對照組(對應(yīng)圖3與圖4中A組),探究氯化膽堿的添加方式對L-酪氨酸發(fā)酵的影響。

圖3 氯化膽堿添加方式對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig.3 Effect of choline chloride addition methods on L-tyrosine fermentation production

圖4 氯化膽堿添加方式對副產(chǎn)物產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.4 Effect of choline chloride addition methods on the yield and sugar-acid conversion rate of by-products

由圖3和圖4可知,添加方式A組由于在底物培養(yǎng)基中一次性加入了全部量氯化膽堿,使得原體系中的營養(yǎng)充足,菌體在前10 h生物量的增長速度最快,但是隨著發(fā)酵的進(jìn)行,方式A組的弊端逐漸顯露,后期由于氯化膽堿的缺乏,菌體無法保持前期的生長態(tài)勢。添加方式B組的結(jié)果顯示在補料添加后的4 h內(nèi),菌體量增長速度有一定程度的提升,隨后漲幅逐漸下降,最高的OD600 nm和產(chǎn)量分別為86.90,51.50 g/L,較方式A組分別提高了1.4%和3.6%。添加方式C組使得整個發(fā)酵周期內(nèi)菌體所需的氯化膽堿都處于一個相對穩(wěn)定的水平,在第20 h達(dá)到菌體量穩(wěn)定期,較A組延長了4 h,從最終的結(jié)果來看,添加方式C組展現(xiàn)出了持續(xù)流加的優(yōu)勢,最終的菌體生物量(OD600 nm)為88.98,較方式A組和方式B組分別提高了3.82%和2.39%,最終的L-酪氨酸產(chǎn)量為53.08 g/L,較方式A組和方式B組分別提高了6.79%和3.06%,除此之外,添加方式C組有效降低了乙酸和谷氨酸等副產(chǎn)物的產(chǎn)量,較方式A組分別降低了29.8%、26.7%,隨著糖酸轉(zhuǎn)化率的增加有所提高,較方式A組提升了4.58%。

2.3 氯化膽堿全營養(yǎng)流加工藝優(yōu)化試驗

全營養(yǎng)流加工藝[22]是將傳統(tǒng)分批補料發(fā)酵工藝中全部的發(fā)酵培養(yǎng)基分成兩部分:一部分直接投入罐內(nèi),為發(fā)酵初期提供營養(yǎng)物質(zhì);另一部分單獨分裝,在發(fā)酵過程中按需流加,為不同生長階段的菌體提供最適的營養(yǎng)物質(zhì)濃度。

2.3.1 底物與流加培養(yǎng)基中氯化膽堿添加比例對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響

本部分研究以2.2中添加方式C(底物添加∶流加添加為2∶8)發(fā)酵組為對照組。由圖5和圖6可知,C組菌體前期生長受到明顯的抑制,生長速度低于其余3組,但在18 h時,仍保持著一定活力,于第20 h達(dá)到菌體穩(wěn)定期;E組、F組在發(fā)酵前期的菌體生長和產(chǎn)量增長曲線與D組基本類似,說明底物中30%的氯化膽堿達(dá)到菌體發(fā)酵前期需求的臨界值,隨著流加培養(yǎng)基的持續(xù)流入,發(fā)酵后半程依舊處于營養(yǎng)過飽和狀態(tài),從而導(dǎo)致乙酸等副產(chǎn)物產(chǎn)量增高,糖酸轉(zhuǎn)化率降低,并不能發(fā)揮出流加的優(yōu)勢;D組氯化膽堿的分配接近亞適量狀態(tài),即最大程度利用營養(yǎng)物質(zhì),在各個發(fā)酵時期恰好夠支撐菌體生長,保持菌體活力。D組最終L-酪氨酸產(chǎn)量及最大菌體量(OD600 nm)分別為54.30 g/L、92.15,較對照組分別提高了2.3%、3.6%;副產(chǎn)物乙酸及谷氨酸分別為0.9,2.2 g/L,較對照組分別降低了25%、33%;此時糖酸轉(zhuǎn)化率達(dá)到最高,為23.2%,較對照組提升了1.5%。

圖5 底物與流加培養(yǎng)基中氯化膽堿不同的添加比例對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響Fig.5 Effect of different addition ratios of choline chloride in substrate medium and fed-batch medium on the fermentation production of L-tyrosine

圖6 底物與流加培養(yǎng)基中氯化膽堿不同的添加比例對副產(chǎn)物產(chǎn)量和糖酸轉(zhuǎn)化率的影響Fig.6 Effect of different addition ratios of choline chloride in substrate medium and fed-batch medium on the yield of by-products and sugar-acid conversion rate

2.3.2 流加培養(yǎng)基流加持續(xù)時間及各階段流加速度對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響

以2.3.1中D組(對應(yīng)表3中恒速流加至發(fā)酵末期)為對照組,進(jìn)一步對全營養(yǎng)流加工藝進(jìn)行優(yōu)化。

由表4可知,G組是將總量70%的氯化膽堿以恒速流加至菌體穩(wěn)定期,菌體量和產(chǎn)量與對照組相比無明顯差異,但最終副產(chǎn)物乙酸及谷氨酸產(chǎn)量較對照組分別提升了8.7%、18.2%;糖酸轉(zhuǎn)化率下降了2.6%。H組隨菌體生長速度提高流加速度是指在葡萄糖亞適量[23]狀態(tài)下,始終保持穩(wěn)定的低溶氧(dissolved oxygen,DO)變速流加。H組最大菌體量為98.32,較對照組提高了6.7%,但L-酪氨酸產(chǎn)量提升不明顯,副產(chǎn)物也大量積累,乙酸和谷氨酸產(chǎn)量較對照組分別提升了30.4%、27.3%,糖酸轉(zhuǎn)化率下降了2.6%。I組營養(yǎng)物質(zhì)亞適量流加是指在葡萄糖亞適量狀態(tài)下,當(dāng)DO緩慢上升時,提高補糖速率,DO未見明顯下降,此時流加營養(yǎng)物質(zhì),DO迅速下降,即認(rèn)為此時為營養(yǎng)亞適量狀態(tài)[16],應(yīng)提高流加培養(yǎng)基流加速度。I組最終L-酪氨酸產(chǎn)量達(dá)到55.7 g/L,較對照組提高了2.6%,最大菌體量(OD600 nm)為95.15,較對照組增長了3.3%,副產(chǎn)物乙酸及谷氨酸產(chǎn)量較對照組分別降低了65.2%、29.1%,糖酸轉(zhuǎn)化率提高了3.9%,為本優(yōu)化試驗最佳方案。

表4 流加培養(yǎng)基流加持續(xù)時間及各階段流加速度對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響Table 4 Effect of feeding duration time of fed-batch medium and feeding speed at each stage on the fermentation production of L-tyrosine

3 結(jié)論

本文通過探究不同濃度的氯化膽堿對L-酪氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的影響,發(fā)現(xiàn)適量添加氯化膽堿能夠有效加快菌體生長,提高菌體產(chǎn)酸能力,并且確定了氯化膽堿的最適添加濃度為0.4 g/L,在此基礎(chǔ)上探究不同的添加方式對發(fā)酵能力的影響,得出全營養(yǎng)流加工藝具有一定發(fā)酵優(yōu)勢,并對該工藝進(jìn)一步優(yōu)化,最終確定了底物與流加培養(yǎng)基中氯化膽堿的添加比例為3∶7,流加培養(yǎng)基的流加速度隨罐內(nèi)溶氧值的波動而變化,以維持營養(yǎng)物質(zhì)亞適量狀態(tài)的全營養(yǎng)流加工藝。優(yōu)化后的最大菌體量(OD600 nm)、L-酪氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到了95.15、55.7 g/L、24.1%,較優(yōu)化前分別提升了25.9%、19.0%、7.7%;副產(chǎn)物乙酸和谷氨酸產(chǎn)量分別為0.32,1.56 g/L,較優(yōu)化前分別降低了74.2%、55.4%。本研究所確定的新發(fā)酵工藝與原發(fā)酵策略相比,不僅實現(xiàn)了最大菌體量、L-酪氨酸產(chǎn)量及糖酸轉(zhuǎn)化率不同程度的提升,且大幅降低了副產(chǎn)物谷氨酸、乙酸的積累,為今后工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)L-酪氨酸提供了一定的參考依據(jù)。