黃炯力，范菲，王喻，王為梁

（1.西安計量技術研究院，西安 710068；2.西安市食品藥品檢驗所，西安 710054）

《化妝品安全技術規(guī)范》[1]（2015年版）將吡硫鎓鋅、水楊酸、山梨酸、苯氧異丙醇、2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、鄰傘花烴-5-醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、芐氯酚、吡羅克酮乙醇胺鹽、三氯卡班、三氯生、溴氯芬、硫柳汞鈉等19種化合物列為防腐劑限用成分，并規(guī)定了高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分含量的方法[2-4]，對組分含量的準確測定是保障化妝品質(zhì)量安全的重要保證。測量不確定度是對測量結果質(zhì)量的定量表征，其測量結果的可信度和可用性很大程度上取決于其不確定度的大小[5-11]。所以，測量結果數(shù)據(jù)應該附有測量不確定度說明才是完整并有意義的?？紤]到上述的影響因素和測量過程的不確定性，筆者參考相關文獻[12?15]，對吡硫鎓鋅等19 種組分的高效液相含量測定方法建立了數(shù)學模型，進行了不確定度評定，為檢驗結果評定的準確性和合理性，提供一定參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：ULTIMATE U-3000 型，二極管陣列檢測器，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

電子天平：(1) BSA124S-CW 型，分度值為0.1 mg，德國賽多利斯科學儀器有限公司，(2) MS105型，分度值為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

高速冷凍離心機：HC-3018R型，安徽中科中佳科學儀器有限公司。

渦旋混勻器：V2S025 型，艾卡(廣州)儀器設備有限公司。

吡硫鎓鋅、山梨酸、三氯卡班、溴氯芬標準品：質(zhì)量分數(shù)分別為99.8%、99.9%、99.4%、99.6%，北京曼哈格生物科技有限公司。

水楊酸、苯氧異丙醇、氯二甲酚、氯咪巴唑、三氯生標準品：質(zhì)量分數(shù)分別為99.9%、99.8%、99.16%、99.46%、99.90%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、鄰傘花烴-5-醇、芐氯酚、吡羅克酮乙醇胺鹽、硫柳汞鈉標準品：質(zhì)量分數(shù)分別為100.00%、99.60%、98.52%、99.08%、98.23%、99.94%、99.85%、99.02%、99.86%、98.8%，美國Stanford Chemicals 公司。

化妝品樣品：洗發(fā)乳，市售。

甲醇、乙腈：色譜純，美國賽默飛世爾科技公司。

實驗所用其它試劑均為分析純。

實驗用水為高純水。

1.2 色譜條件

色 譜 柱：Thermo Acclaim TM 120-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國賽默飛世爾科技公司)；柱溫：30 ℃；流動相：(A)磷酸二氫鈉溶液(pH值3.80)，(B)甲醇溶液，流量為1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，0.0～5.0 min 80%～55% A，5.0～15.0 min 55%A，15.0～32.0 min 55%～30% A，32.0～47.0 min，30%～15% A，47.0～54.0 min 15% A，54.0～55.0 min 15%～55% A，55.0～60.0 min 55% A，60.0～60.1 min 55%～80% A，60.1～65.0 min 80% A；檢測波長：吡硫鎓鋅、水楊酸、山梨酸、苯氧異丙醇、鄰傘花烴-5-醇、氯二甲酚、三氯卡班、三氯生的測定采用280 nm，2,6-二氯苯甲醇、苯甲酸甲酯、碘丙炔醇丁基氨甲酸酯、對氯間甲酚、2,4-二氯苯甲醇、鄰苯基苯酚、氯咪巴唑、芐氯酚、溴氯芬、硫柳汞鈉的測定采用230 nm，吡羅克酮乙醇胺鹽的測定采用300 nm；進樣體積：10 μL。

1.3 溶液制備

17種組分的混合標準儲備溶液：精密稱取除硫柳汞鈉、吡硫鎓鋅以外的17 種組分標準品適量，置于同一20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，搖勻。

吡硫鎓鋅標準儲備溶液：1.00 mg/mL，精密稱取吡硫鎓鋅標準品100 mg，置于100 mL 容量瓶中，先加入20 mL 二甲亞砜溶解，再用甲醇定容至標線，搖勻。

硫柳汞鈉標準儲備溶液：2.5 mg/mL，精密稱取硫柳汞鈉標準品50 mg，置于20 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至標線，搖勻。

18種組分的混合標準系列溶液：分別精密量取17 種組分的混合標準儲備溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，吡硫鎓鋅標準儲備溶液0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10 mL，分別置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，搖勻。

硫柳汞鈉系列標準工作溶液：分別精密量取硫柳汞鈉標準儲備溶液0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 mL，置于6只50 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標線，搖勻。

化妝品樣品溶液A：準確稱取樣品1.0 g (精確至0.001 g)，置于50 mL 具塞比色管中，加入甲醇8 mL，渦旋振蕩30 s，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，用甲醇定容至10 mL，搖勻，以10 000 r/min 離心5 min。上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得。該溶液用于測定除吡硫鎓鋅外的18 種組分。

化妝品樣品溶液B：準確稱取樣品0.5 g (精確至0.001 g)，置于50 mL具塞比色管中，加入乙腈-甲醇(體積比為95∶5) 40 mL，渦旋振蕩30 s，使試樣與提取溶劑充分混勻，超聲提取20 min，用乙腈-甲醇(體積比95∶5)定容至50 mL，搖勻，以10 000 r/min離心5 min。取上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，即得。該溶液用于測定樣品中的吡硫鎓鋅。

1.4 實驗步驟

按1.2 色譜條件，取混合標準系列溶液分別進樣，進行色譜分析，以標準系列溶液濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。取樣品溶液進樣，進行色譜分析，根據(jù)保留時間和紫外光圖譜定性，測得色譜峰面積，以標準曲線法得到待測溶液中各測定組分的濃度，計算樣品中各待測組分的含量。

2 數(shù)學模型

2.1 數(shù)學模型建立

根據(jù)保留時間定性，測得峰面積，根據(jù)標準曲線得到待測溶液中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量濃度，按式（1）計算其中的含量。

式中：w——化妝品中待測組分的質(zhì)量分數(shù)，μg/g；

m——樣品稱取質(zhì)量，g；

ρ——從標準曲線得到的目標組分質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——樣品定容體積，mL。

2.2 測量不確定度來源

根據(jù)測定數(shù)學模型分析，其測量不確定的來源主要有：

（1）標準物質(zhì)引入的不確定度：標準物質(zhì)稱量引入的不確定度u(ms)、玻璃量器移液定容引入的不確定度u(Vs)及由標準曲線擬合引入的不確定度u(L)；

（2）樣品引入的不確定度：樣品稱量引入的不確定度u(mx)、樣品定容引入的不確定度u(Vx)；

（3）高效液相色譜儀引入的不確定度u(D)；

（4）樣品測量重復性引入的不確定度u(f)。

測量模型中輸入量估計值相互獨立，采用相對標準不確定度合成公式計算：

由上式可推導出被測樣品的相對標準不確定度合成公式（2）為：

3 測量不確定度分量的量化

3.1 標準物質(zhì)引入的相對標準不確定度

3.1.1 標準物質(zhì)稱量引入的相對標準不確定度urel(ms)

標準物質(zhì)稱量采用分度值為0.01 mg 的電子天平，其測量不確定度分量應包括天平最大示值誤差、重復性、分辨力及偏載等的影響，但考慮為單次稱量，重復性、分辨力及偏載等影響均包含在最大示值誤差內(nèi)，故主要考慮天平最大示值誤差引入的標準不確定度u(ms,1)。此外，環(huán)境溫度、大氣浮力、重力加速度可忽略不計。根據(jù)計量檢定證書結果，天平最大允許誤差為±0.05 mg，則其區(qū)間半寬為0.05 mg，估計為均勻分布，包含因子k=2，對其標準不確定度進行計算，得到u(ms,1)=2.89×10-2mg。

由于采用差減法稱量，存在2次讀數(shù)，因此標準物質(zhì)稱量引入的標準不確定度為：

稱取質(zhì)量為ms，則標準物質(zhì)稱量質(zhì)量引入的相對合成標準不確定度按式（3）計算，結果見表1。

表1 稱量引入的相對標準不確定度

3.1.2 玻璃量器移液定容引入的相對標準不確定度u(Vs)

玻璃量器移液定容引入的不確定度分量基本由三部分組成：容量允差u(V1)及溶劑體積膨脹系數(shù)u(V2)的影響。

由以上2項合成得出相對合成標準不確定度：

其它玻璃量器移液定容引入的不確定度計算同上，結果見表2。

表2 各玻璃量器引入的相對標準不確定度

3.1.3 標準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel(L)

精密吸取標準系列工作溶液，分別進樣測定，以色譜峰平均面積與標準溶液濃度用最小二乘法進行擬合，由線性方程計算樣品溶液平均質(zhì)量濃度產(chǎn)生的標準不確定度由式（4）計算：

式中：s(A)——標準溶液色譜峰面積的標準偏差，9.08；

ρx——樣品溶液的平均質(zhì)量濃度,μg/mL；

ρˉ——系列標準工作溶液的平均質(zhì)量濃度，μg/mL；

A——線性方程斜率；

N——樣品平行測定次數(shù)，N=2；

n——標準溶液測定次數(shù)，n=6×2。

將上述各值代入公式得出u(L)，得標準曲線擬合引入的相對標準不確定度為：

計算結果見表3。

3.2 樣品引入的不確定度

3.2.1 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel(mx)

配制化妝品樣品溶液A、化妝品樣品溶液B，分別取樣兩份。配制樣品溶液A樣品稱取質(zhì)量分別為1.012 3、1.024 6 g，則稱量結果引入的相對合成標準不確定度為urel(mx)=2.53×10-3。

配制樣品溶液B 樣品稱取質(zhì)量分別為0.506 4、0.517 8 g，則稱量引入的相對合成標準不確定度為1.50×10-3。

3.2.2 樣品溶液定容引入的相對標準不確定度urel(Vx)

同理，測定吡硫鎓鋅時使用50 mL 比色管的相對合成標準不確定度為5.11×10-3。

3.3 高效液相色譜儀引入的相對標準不確定度urel(D)

由檢定證書可知，高效液相色譜儀DAD檢測器的定量測量誤差為0.05%，即其相對擴展不確定度為0.05%，按均勻分布計算，k= 3，則相對標準不確定度為：

3.4 測量重復性引入的相對標準不確定度urel(f)

在重復條件下，精密稱取6份樣品各測定2次（n=6，N=2），實驗結果按式(5)和式(6)計算，標準不確定度結果見表4。

表4 樣品重復性測定結果

3.5 測量結果的不確定度

將以上各不確定度分量的值代入式(2)計算6份化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量分數(shù)均值w，取包含因子k=2(置信概率95%)，則液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19 種組分的相對擴展不確定度按式(8)和式(9)計算：

高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的質(zhì)量分數(shù)及相對擴展不確定度(k=2)見表5。

表5 化妝品中吡硫鎓鋅等19種組分的含量

4 結語

通過對各分量不確定度的考察表明，高效液相色譜法測定化妝品中吡硫鎓鋅等19 種組分，7 個不確定度來源對測定結果的影響較大，其中標準物質(zhì)稱重、玻璃量器移液定容和標準曲線引入的不確定度分量為合成不確定度的主要貢獻量，標準物質(zhì)純度、重復性、樣品稱量和液相色譜儀引入的不確定度分量相對較小，可采用配制的工作曲線標準點盡量與被測組分濃度接近，增加系列標準工作溶液實驗點數(shù)，定期對儀器及量器進行檢定和維護，使其保持較高靈敏度等，降低相應測量不確定度分量對測量結果的影響，對于基質(zhì)相對復雜的樣品，可采用內(nèi)標法等方法進行測定，降低樣品基質(zhì)引入的不確定度。