翁飛，孟盈，李騰，程時棟

（1.武漢大學(xué)中南醫(yī)院設(shè)備處，武漢 430071；2.湖北省計量測試技術(shù)研究院，武漢 430223）

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)[1?2]是一種對特定的DNA或RNA 片段在體外記性快速擴增的方法，由變性、退火、延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。PCR儀是基于聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)原理，模擬DNA 或RNA 的復(fù)制過程，在模板、引物、聚合酶等存在的條件下，特異擴增已知序列，對其進行檢測分析的儀器設(shè)備。

根據(jù)JJF 1527—2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析校準規(guī)范》[3]，PCR 儀的計量特性有溫度示值誤差、溫度均勻性、平均升溫速率、平均降溫速率、樣本濃度示值誤差、樣本線性。在對樣本濃度示值誤差進行校準時，由于標準曲線的擬合方法、樣本濃度測量平均值的計算方法存在多樣性，導(dǎo)致樣本濃度示值誤差的計算以及不確定度評定方法也存在多樣性。筆者通過20 組PCR 儀擴增獲取的數(shù)據(jù)對這幾種校準方法的結(jié)果進行對比，探討出兼顧數(shù)據(jù)準確性和計算簡潔性的PCR儀樣本濃度示值誤差校準方法。

1 實驗部分

1.1 標準物質(zhì)

該方法使用的標準物質(zhì)生產(chǎn)機構(gòu)為中國計量科學(xué)院，標準物質(zhì)以重量法制備值作為標準值，并采用數(shù)字PCR方法進行突變基因拷貝數(shù)濃度驗證。標準物質(zhì)的相關(guān)信息如表1，其包裝規(guī)格為96孔，反應(yīng)孔排布圖如圖1，設(shè)定U1、U2為目標樣本。從冰箱內(nèi)取出標準物質(zhì)，平衡至室溫并混勻，以3 000 r/min離心后使用。

圖1 PCR儀反應(yīng)孔排布圖

表1 標準物質(zhì)的信息表

1.2 主要儀器

PCR 儀：隨機選取10 臺使用狀況良好的96 孔的定量PCR儀作為實驗用設(shè)備。

1.3 PCR儀樣本濃度示值誤差校準

1.3.1 校準流程

依據(jù)JJF 1527—2015《聚合酶鏈反應(yīng)分析校準規(guī)范》，樣本濃度示值誤差的校準步驟如圖2。

圖2 PCR儀樣本濃度示值誤差校準步驟

PCR 儀樣本濃度示值誤差的不確定度評定基于GUM[4?5]進行評定，其流程圖如圖3所示。

圖3 基于GUM的測量不確定度評定流程圖

1.3.2 校準方法

在樣本濃度示值誤差的校準過程中，標準曲線的擬合是基于最小二乘法[6?7]完成，有兩種方法；(1)采用配制標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)進行擬合；(2)先取同一濃度的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進行擬合。根據(jù)擬合的標準曲線以及樣本所在反應(yīng)孔擴增Ct值可求得若干個濃度對數(shù)值后，樣本濃度測量平均值的計算方法有兩種：(1)取濃度對數(shù)值的均值，根據(jù)均值求得對應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測量平均值；(2)求得每一個濃度對數(shù)值對應(yīng)的濃度測量值，取濃度測量值的均值作為目標樣本濃度的測量平均值。在標準曲線擬合和樣本濃度測量平均值的計算過程中，不同方法的組合導(dǎo)致樣本濃度示值誤差的計算以及不確定度評定方法有以下4種：

方法一，標準曲線通過配制的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴增Ct值及擬合的標準曲線求得若干個濃度對數(shù)值，取濃度對數(shù)值的均值，再根據(jù)均值求得對應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測量平均值。

方法二，標準曲線通過配制的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的全部原始數(shù)據(jù)擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴增Ct值及擬合的標準曲線求得若干個濃度對數(shù)值，求得每一個濃度對數(shù)值對應(yīng)的濃度測量值，取濃度測量值的均值作為目標樣本濃度的測量平均值。

方法三，標準曲線通過先取同一濃度的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進行擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴增Ct值及擬合的標準曲線求得若干個濃度對數(shù)值，取濃度對數(shù)值的均值，再根據(jù)均值求得對應(yīng)的濃度值作為樣本濃度的測量平均值。

方法四，標準曲線通過先取同一濃度的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)平均值，再根據(jù)這些平均值進行擬合獲取，根據(jù)樣本所在反應(yīng)孔擴增Ct值及擬合的標準曲線求得若干個濃度對數(shù)值，求得每一個濃度對數(shù)值對應(yīng)的濃度測量值，取濃度測量值的均值作為目標樣本濃度的測量平均值。

2 PCR儀樣本濃度示值誤差不確定度評定

2.1 基于最小二乘法的不確定度評定

對于變量x和y，如果存在線性關(guān)系，則可以表示為y=a+bx，其中斜率b、截距a由獨立測得的n組值(x1，y1)，(x2，y2)，…，(xn，yn)確定。當(dāng)對測量值y進行m次測量，被測量值的估計值xˉj的不確定度計算公式為[8?10]：

式中：xˉi——被測量值的平均值；

i——測量次數(shù)，i=1，2，…，n；

s(xˉi)——被測量值平均值的實驗標準偏差；

xˉj——被測量值的估計值；

s(y)——測量值的實驗標準偏差；

b——擬合線性方程的斜率；

j——測量次數(shù)，j=1，2，…，m；

xi——第i次測量值。

2.2 PCR儀樣本濃度示值誤差不確定度評定

2.2.1 數(shù)學(xué)模型

樣本濃度示值誤差測量模型為：

式中：Δc——樣本濃度示值誤差；

cˉ——樣本濃度測量平均值；

cs——樣本濃度標稱值。

根據(jù)不確定度傳播規(guī)律[11?12]可知Δc不確定度的計算公式為：

其中u(cs)可以由標準物質(zhì)原始濃度及稀釋系數(shù)求得，因此Δc不確定度評定的關(guān)鍵為樣本濃度測量平均值cˉ的不確定度u(cˉ)的評定。

2.2.2cˉ測量不確定度分量評定

(1)方法一。樣本濃度測量平均值cˉ測量模型為：

式中：xˉ——樣本濃度對數(shù)值xi的均值，i=1，2，…，n；

n——標準物質(zhì)(S1～S7)反應(yīng)孔的數(shù)量。

樣本濃度測量平均值cˉ的不確定度為：

cˉ測量不確定度來源包括兩部分：測量重復(fù)性引入的u1(xˉ)和測量模型引入的u2(xˉ)。因此樣本濃度測量平均值的不確定度為：

式中：yi——標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔擴增Ct值，i=1，2，…，n；

s(y)——yi的標準偏差；

k——包含因子，k=2；

ci——標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的樣本濃度，i=1，2，…，n。

將公式(7)、(8)代入到公式(6)中即可得到樣本濃度測量平均值cˉ的合成不確定度。

(2)方法二。目標樣本濃度測量平均值測量模型為：

式中：cj——樣本濃度的測量值，j=1，2，…，m。

cˉ測量不確定度來源包括兩部分：測量重復(fù)性引入的u1(cˉ)；測量模型引入的u2(cˉ)。因此目標樣本濃度測量平均值的不確定度：

將式(13)～(16)代入式(12)即可得到樣本濃度測量平均值cˉ的合成不確定度。

(3)方法三。該方法與方法一中樣本濃度測量平均值的不確定計算公式類似，同樣由公式(7)、(8)代入到公式(6)，只是標準偏差s(y)計算不同：

式中：p——配制的標準物質(zhì)的濃度梯度數(shù)，且由p替代公式(8)中的n。

(4)方法四。與方法二中樣本濃度測量平均值的不確定計算公式類似，同樣是由式(13)～(16)代入式(12)，只是用配制的標準物質(zhì)的濃度梯度數(shù)p代替測量次數(shù)n。

2.2.3 Δc不確定度評定

根據(jù)公式(3)計算出u(Δc)后，樣本濃度示值誤差的擴展不確定度為：

3 結(jié)果分析

3.1 實驗結(jié)果

運行PCR 儀擴增程序，分別用4 種方法對樣本示值誤差進行校準，總共進行了20組實驗，4種方法的校準結(jié)果如表2所示。

表2 4種方法的校準結(jié)果

3.2 差異顯著性檢驗

3.2.1 樣本濃度相對示值誤差差異顯著性檢驗

樣本濃度相對示值誤差計算公式為：δ(Δc)=Δc/cs×100%，用F檢驗對4 種方法計算出的樣本濃度相對示值誤差進行差異顯著性分析[13?15]，P=0.998>0.05，結(jié)果如表3所示。

表3 樣本濃度相對示值誤差差異顯著性檢驗結(jié)果

3.2.2 樣本濃度示值誤差相對擴展不確定度差異顯著性檢驗

樣本濃度示值誤差的相對擴展不確定度[16]計算公式為：urel(Δc)=u(Δc)/Δc，用F檢驗對4種方法計算出的樣本濃度示值誤差相對擴展不確定度進行差異顯著性分析，P=0.351>0.05，結(jié)果如表4。

表4 樣本濃度示值誤差相對擴展不確定度差異顯著性檢驗結(jié)果

3.3 結(jié)果分析

從4 種方法的計算公式可以看出：(1) 4 種方法中，方法一和方法二是基于實驗原始數(shù)據(jù)進行計算，其結(jié)果更能真實反映儀器的性能；(2)方法二和方法四中的計算更為繁瑣。

從表2 中的計算結(jié)果可知：(1)每一組實驗結(jié)果中，方法一和方法二的相關(guān)系數(shù)r值一致，方法三和方法四的相關(guān)系數(shù)r值一致，并且后者的r值更接近1，即先將同一濃度的標準物質(zhì)所在反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)取平均值，再根據(jù)這些平均值擬合標準曲線，樣本線性[17]更好；(2)方法一和方法三計算得到的示值誤差一樣，方法二和方法四得到的示值誤差一樣，即樣本濃度示值誤差值大小只與樣本濃度平均值的計算方法有關(guān)，并且方法一和方法三得到的示值誤差更??；(3) 20 組實驗結(jié)果中，4 種方法計算的樣本濃度示值誤差不確定度大小均不一致，即濃度示值誤差不確定度大小與標準曲線擬合方法、樣本濃度平均值的計算方法均有關(guān)，并且4 種方法中方法四計算出的不確定度值最小。

從表3中結(jié)果可知，4種方法計算的樣本濃度相對示值誤差差異性不顯著，從表4 中的結(jié)果可知，4種方法計算的樣本濃度示值誤差相對不確定度差異性不顯著(P=0.351>0.05)。

4 結(jié)語

基于以上的實驗結(jié)果，4 種PCR 儀樣本濃度示值誤差校準方法的結(jié)果差異性不顯著。因此綜合考慮計算的復(fù)雜度、計算結(jié)果反應(yīng)儀器性能的真實程度等因素，推薦采用原始數(shù)據(jù)進行標準曲線擬合、將依據(jù)濃度對數(shù)值的均值求得的濃度值作為樣本濃度的測量平均值這種方法進行PCR 儀樣本示值誤差校準。