余俊琪 徐一峰 郭 瑤, 劉相粉, 李亞華 姚 璐 王 培吳振斌 周巧紅

(1. 武漢理工大學(xué)資源與環(huán)境工程學(xué)院, 武漢 430070; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 4. 中國地質(zhì)大學(xué), 武漢 430074)

環(huán)境中鎘含量的升高來源于各種人為活動, 例如采礦、冶煉、施肥、灌溉和化石燃料的使用等將鎘釋放到環(huán)境中[1]。與有機(jī)污染物不同, 鎘不能自然分解, 僅能直接或間接通過地表徑流被排放到水環(huán)境中, 并在沉積物中累積。在貴州草海[2]、大冶湖[3]和洪澤湖[4]等湖泊沉積物中鎘濃度高達(dá)31.38、22.5和24.11 mg/kg, 超過湖泊沉積物地球化學(xué)背景值0.22—9 mg/kg。Li等[5]對2000—2019年中國五個地理區(qū)域的190個湖泊沉積物中重金屬(Cu、Pb、Zn、Ni、Cr、As、Hg和Cd)數(shù)據(jù)分析研究, 得出中國湖泊沉積物表現(xiàn)出中等的潛在生態(tài)風(fēng)險, 鎘是其主要污染物。因此, 迫切需要制定低成本的鎘污染沉積物修復(fù)策略。

植物修復(fù)是一種通過根系富集重金屬后收獲組織的原位處理技術(shù), 由于其有效、低成本和環(huán)境友好性已被用于修復(fù)受鎘污染的沉積物[6—8]。已經(jīng)證明, 水生植物如輪葉黑藻(Hydrilla verticillata)、加拿大伊樂藻(Elodea canadensi)和苦草(Vallisneria natans)可以從受污染的沉積物中積累重金屬鎘[6,9]。然而植物修復(fù)只適合于一定程度的重金屬污染。如高濃度的鎘會通過影響碳水化合物代謝、硝酸鹽的吸收、光合活性、抗氧化系統(tǒng)及破壞主要細(xì)胞器等來影響水生植物生長[7,10,11], 進(jìn)而導(dǎo)致水生植物修復(fù)重金屬鎘污染沉積物受到限制。近年來,研究人員致力于調(diào)節(jié)根際區(qū)域環(huán)境, 使之能夠提高植物修復(fù)效果[12]。微生物是鎘遷移和植物解毒的重要參與者[13]。根際微生物群落中的一些細(xì)菌可以通過分泌鐵載體和植物激素來促進(jìn)植物根系的生長, 提高養(yǎng)分的利用率[6,14,15], 增加重金屬可利用性, 從而促進(jìn)植物吸收和積累重金屬[14,16]。所以了解植物根際微生物對沉積物鎘污染的響應(yīng)特征將有助于有效地進(jìn)行植物修復(fù)。

苦草廣泛存在于水生態(tài)系統(tǒng)中, 具有耐受性強(qiáng)、光補(bǔ)償點(diǎn)低、繁殖能力強(qiáng)和重金屬富集效果好等優(yōu)點(diǎn), 因此常被作為富營養(yǎng)化湖泊中沉水植物恢復(fù)重建和水體底泥重金屬污染生態(tài)修復(fù)的先鋒物種[9,17]。目前對苦草的研究主要是鎘污染底泥的富集效果和對其生理指標(biāo)的影響, 對根際微生物群落結(jié)構(gòu)的研究相對較少。因此, 本研究以苦草為研究對象, 研究在不同濃度鎘污染脅迫下苦草生長特性和生理特征, 并且明晰苦草根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化, 旨在找到沉水植物苦草耐受的沉積物鎘含量以指導(dǎo)實(shí)際的植物修復(fù)措施的使用, 并為根際微生物促進(jìn)植物修復(fù)沉積物鎘污染的研究提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本研究采用的水生植物苦草來源于江蘇省宿遷市水生植物基地。挑選生長狀態(tài)一致的植株, 用1/10 Hoagland 營養(yǎng)液預(yù)培養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)采用梁子湖沉積物, 風(fēng)干后去除其中的粗雜質(zhì), 并過80目篩后均質(zhì)化。用CdCl2·2.5H2O(分析純)配制1 g/L的鎘儲存液, 稀釋不同的倍數(shù)倒入沉積物中, 均勻混合并老化風(fēng)干, 最終制成0、1、5、10、20 和50 mg/kg五個含量梯度的鎘污染實(shí)驗(yàn)沉積物備用[6,18]。實(shí)驗(yàn)采用高×直徑=15 cm×13 cm 的塑料小桶來模擬靜態(tài)條件下的水體環(huán)境。每個小桶中稱取300 g的實(shí)驗(yàn)沉積物, 將苦草葉片統(tǒng)一修剪至10 cm, 根修剪至3 cm以每桶5株的密度植入, 恒溫室內(nèi)培養(yǎng), 培養(yǎng)溫度為(25±1)℃, 每天用90 μmol/(m2·s)的光照12h/黑暗12h, 每隔4d用自來水補(bǔ)充蒸發(fā)的水分, 實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個平行, 實(shí)驗(yàn)周期為36d。

1.2 植物、水體與沉積物中鎘含量測定

植物中鎘含量測定: 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取出植物整株用去離子水沖洗2—3遍, 擦干植物表面水分后置于烘箱中, 在80℃烘干至恒重, 磨碎后稱取0.1 g用H2O2﹕HNO3=1﹕3(v/v)進(jìn)行微波消解[19], 然后采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP-OES PekinElmer Optima 8000DV)測定鎘含量[20]。沉積物樣本在去除爛根及碎屑后, 冷凍干燥并研磨過100目篩用于重金屬和理化性質(zhì)測定, 沉積物鎘含量經(jīng)酸性混合物(HNO3、HF)微波消解后, 采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS PekinElmer NexION300X)測定。取植物樣開始前取上覆水樣10 mL, 用0.22 μm濾膜過濾后, 測定其中的鎘含量。

1.3 植物指標(biāo)分析方法

植株形態(tài)學(xué)測定取樣時每個裝置中各取3株植物, 用去離子水沖洗干凈, 將植物用吸水紙吸干植物表面殘留的水分, 在電子天平上稱量鮮重,并用直尺測量植株高度(在測量植株高度時, 均取整株最高的葉脈測量)。

植物生理生化指標(biāo)測定葉綠素含量的測定采用分光光度法, 用95%乙醇研磨提取后, 于470、649和665 nm處測定吸光度, 計(jì)算葉綠素a、葉綠素b含量和葉綠素總量[21,22]; 丙二醛(Malondialdehyde, MDA)含量采用2-硫代巴比妥酸(TBA)比色法測定[23—25]: 新鮮的葉片組織在冰浴中均質(zhì)化, 并用5 mL 10%三氯乙酸 (TCA) 溶液提取。勻漿在4℃下以5000 r/min離心10min。將2 mL TCA(含0.67% TBA)加入到2 mL提取液中, 純水為空白對照, 將混合液在100℃水浴加熱30min, 立即用冰水冷卻, 離心后, 在450、532和600 nm處測量吸光度;超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase, SOD)活性采用氮藍(lán)四唑法測定, 過氧化物酶(Peroxidase,POD)采用愈創(chuàng)木酚法測定[26]。

葉片活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)采用試劑盒方法進(jìn)行測定: 用熒光染料DCFHDA對苦草葉片細(xì)胞進(jìn)行染色, 將苦草葉片上端葉尖處剪成小塊, 用PBS沖洗2—3遍, 加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA工作液(10 μmol /L)。加入的體積能充分蓋住葉片為宜, 在37℃黑暗條件下染色30min, 之后用PBS緩沖液將葉片上的染液沖洗干凈。將葉片固定于載玻片上, 置于激光共聚焦顯微鏡(Leica)下直接觀察, 使用488 nm的激發(fā)波長, 525 nm的發(fā)射波長。

1.4 沉積物指標(biāo)分析方法

沉積物樣品分為兩部分: 一份用于理化性質(zhì)分析, 另一份儲存在-80℃用于DNA提取。沉積物pH測定采用水土質(zhì)量比10﹕1電位法測定; 總氮(TN)測定用過硫酸鉀氧化—紫外分光光度法, 總磷(TP)測定用鉬銻抗分光光度法[21]。采用酶活性檢測試劑盒(Solarbio, 北京), 通過可見分光光度法測定沉積物中脲酶(S-UE)和磷酸酶(S-NP)活性的大小。

1.5 微生物群落的測序分析

使用FastDNA SPIN試劑盒(MP Biomedicals,USA)從沉積物樣品中提取細(xì)菌群落基因組DNA。在1%瓊脂糖凝膠上檢查DNA提取物, 并使用Nano-Drop 2000紫外—可見分光光度計(jì)(Thermo Scientific, Wilmington, USA)測定 DNA 濃度和純度。使用PCR引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3—V4高變區(qū)[27]。PCR擴(kuò)增如下: 95℃初始變性3min, 95℃變性30s 27個循環(huán), 55℃退火30s, 72℃延伸45s, 然后在72℃單次延伸10min, 最后維持在10℃。5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2 μL、Forward Primer (5 μmol/L)0.8 μL、Reverse Primer (5 μmol/L) 0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL、BSA 0.2 μL、Template DNA 10 ng, 最后加ddH2O至20 μL, PCR反應(yīng)一式三份進(jìn)行[28]。從2%瓊脂糖凝膠中提取PCR產(chǎn)物并使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒進(jìn)行純化, 將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測定量。然后將擴(kuò)增好的產(chǎn)物的兩個末端加上接頭, 采用IlluminaMiseq配對引物(2×300 bp)測序平臺進(jìn)行測序分析。使用USEARCH11-uparse算法對具有97%相似性的序列進(jìn)行聚類并定義為操作分類單位(OTU), 并基于Silva138數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分類, 置信度閾值為0.7。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

生物/底泥富集因子(Biota-Sediment Accumulation Factor, BSAF)是衡量植物對底泥中重金屬的富集累積情況, 可以反映植物對該重金屬的去除能力。富集因子越大, 植物對重金屬的去除效果就越強(qiáng), 其公式為[18,24]:

轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(Translocation Factor, TF)可以表征植物根部向地上部分轉(zhuǎn)移重金屬的能力, 其公式為[19]:

所有測定均重復(fù)3次, 采用SPSS 26統(tǒng)計(jì)軟件和DPS7.05進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA),不同處理組間的差異性通過最小顯著性差異法(Least Significant Difference, LSD)檢驗(yàn), 差異顯著性水平設(shè)為0.05, 采用Origin 2021繪制相關(guān)圖形。利用Majorbio Cloud提供的微生物多樣性分析平臺,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 苦草形態(tài)學(xué)及生理生化指標(biāo)變化情況

由表1可知, 苦草的鮮重和株高隨著鎘處理濃度的增加呈現(xiàn)下降趨勢, 在脅迫處理36d后, 20和50 mg/kg處理組苦草鮮重顯著低于對照組(P<0.05),鎘抑制了苦草的生長且濃度越高對其毒害作用越大。株高生長量是衡量植物吸收轉(zhuǎn)化營養(yǎng)成分的重要指標(biāo), 在50 mg/kg處理時苦草株高最低, 為對照組的58.42%, 表明高濃度的鎘顯著抑制了植物的生長, 導(dǎo)致苦草葉片失綠和根部發(fā)黑?？嗖莸腂SAF隨鎘脅迫濃度的增加呈下降趨勢, 且在所有處理組中BSAF均超過1時, 表明苦草具有一定的鎘污染底泥富集能力。本研究同時還分析了鎘脅迫處理組中苦草葉片和根鎘含量, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)苦草根系鎘含量大于葉片, 轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)(TF)均小于1, 說明苦草依靠植物根濾的機(jī)制來富集鎘。

表1 不同濃度的鎘處理對苦草生長的影響Tab. 1 Effects of different Cd concentrations on growth of Vallisneria natans (mean±SD, n=3)

為了解實(shí)驗(yàn)期間沉積物中的鎘向上覆水釋放情況, 對水樣中的鎘含量進(jìn)行了測定, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)水樣中鎘污染物質(zhì)濃度很低, 僅在50 mg/kg時的實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)有少量鎘存在, 檢出濃度為0.24 μg/L, 與沉積物鎘含量相比很低, 因此本研究不考慮水體中的鎘污染對植物的影響。

從圖1A可以看出: 葉綠素含量隨脅迫濃度的增加呈下降趨勢, 在50 mg/kg時脅迫處理36d時葉綠素含量最低為0.65 mg/g, 為對照組的45.85%, 此時苦草葉片較對照明顯變黃、根部變黑, 表明高鎘脅迫明顯影響植物葉綠素的合成。從圖1B可以看出: MDA含量隨鎘濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢, 在20 mg/kg脅迫處理36d后MDA含量達(dá)到最大值為37.24 nmol/g, 比對照增加了48.68%。在50 mg/kg時苦草體內(nèi)MDA含量下降可能是鎘對苦草葉片細(xì)胞膜的毒害作用已經(jīng)超過了自身調(diào)節(jié)能力, 使得植株的生長受到抑制。從圖1C可以看出:在20 mg/kg 脅迫處理36d后SOD活性達(dá)到最大值為167.39 U/g, 與對照組相比存在顯著性差異(P<0.05),增加了67.11%, 說明苦草對鎘脅迫具有一定的抗性和適應(yīng)能力。從圖1D可以看出: POD活性隨鎘濃度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢, 在脅迫處理36d后, 在20 mg/kg處理組時達(dá)到最大值為83.77 U/(min·g), 比對照增加了107.81%。在20和50 mg/kg處理時, POD活性與對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)。在50 mg/kg處理時, POD活性開始下降說明此時植物抗氧化系統(tǒng)受到了毒害作用, 但此時POD活性依然高于對照組, 說明苦草對鎘脅迫有一定的耐受性。

圖1 不同濃度的鎘處理對苦草葉片葉綠素、MDA、SOD和POD含量的變化Fig. 1 Changes of contents of Chlorophyll, MDA, SOD and POD in leaves of Vallisneria natans treat with different concentrations of Cd (mean±SD, n=3)

圖2是鎘脅迫36d時苦草葉片的ROS分布, 綠色表示葉片中ROS的含量, 顏色越亮表示葉片ROS含量越高, 從圖中可以看出隨著鎘濃度的增加苦草葉片中ROS的含量逐漸升高, 在20和50 mg/kg 處理組ROS含量明顯高于對照組, 說明苦草葉片中受鎘毒害后產(chǎn)生的ROS增多, ROS的過量積累是造成苦草生長抑制及植株矮小且葉片逐漸變黃的主要原因之一。

圖2 不同濃度的鎘處理苦草葉片ROS分布Fig. 2 The distribution of ROS in the leaves of Vallisneria natans treat with different concentrations of Cd

2.2 沉積物理化性質(zhì)和酶活性

隨著沉積物中鎘污染濃度的升高, pH呈現(xiàn)上升趨勢, 沉積物中的TN和TP的含量隨鎘濃度的增加呈現(xiàn)出先下降后上升的變化, 說明苦草在受到鎘毒性后植物獲取養(yǎng)分來滿足自身生長(表2)。鎘對沉積物中的酶活性產(chǎn)生了一定的影響, 且隨著鎘濃度的增加而變化。脲酶隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢, 在10 mg/kg處理水平下達(dá)到最小值為對照組的68.09%; 磷酸酶隨著鎘濃度的增加呈現(xiàn)降低的趨勢, 處理組與對照組存在顯著性差異,在10 mg/kg處理水平下達(dá)到最小值為對照組的49.51%。

表2 沉積物pH、氮磷和酶活性Tab. 2 pH, nitrogen and phosphorus, and enzyme activities of sediments (mean±SD, n=3)

2.3 苦草細(xì)菌群落組成與多樣性分析

對 Illumina Miseq 測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、質(zhì)控及嵌合體過濾, 最終得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)(Effective Tags) 225546條。每個樣品保留26849條Effective reads, 樣本的文庫覆蓋率高于98.99%, 在97%的相似性水平上對OTUs數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理后進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)分析, 隨著鎘濃度的增加, 處理組中Shannon指數(shù)介于4.14—4.88, Chao1介于1429.09—1591.95, Simpson指數(shù)介于0.04—0.06, Sobs指數(shù)介于1146—1347, ACE介于1483.61—1619.37。隨著鎘濃度的升高苦草根際細(xì)菌的Sobs、Shannon指數(shù)、ACE和Chao1指數(shù)呈先上升后下降的趨勢, Simpson指數(shù)無明顯變化。多樣性指數(shù)結(jié)果表明, 鎘污染沉積物在一定程度上影響了苦草根際細(xì)菌群落豐富度, 但沒有明顯降低微生物多樣性。

由圖3可知, 層級聚類分析表明, 微生物的相對豐度受沉積物鎘濃度影響, 分為兩個大類, 一類是在低濃度鎘條件下(Cd≤20 mg/kg), 節(jié)桿菌屬、厭氧黏桿菌屬豐度降低, 另一類是在高鎘濃度條件下(Cd≥20 mg/kg)改變了物種組成, 降低了間孢囊菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、黃桿菌屬和苔蘚桿菌屬的相對豐度。對屬水平豐度前30的細(xì)菌進(jìn)行分析, 鎘脅迫顯著富集了沉積物中潛在的有益細(xì)菌, 主要包括節(jié)桿菌屬、厭氧黏桿菌屬、芽孢桿菌屬和馬賽菌屬等。與對照相比, 節(jié)桿菌屬、厭氧黏桿菌屬、類地桿菌屬和芽孢桿菌屬明顯增加,間孢囊菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、芽單胞菌屬、黃桿菌屬和苔蘚桿菌屬的豐度降低。

圖3 不同鎘濃度處理下沉積物微生物物種分類熱圖(屬水平)Fig. 3 Heatmap of sediment microbial species under different cadmium concentrations treatments (genus level)

2.4 鎘污染沉積物與苦草、微生物相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析表明(圖4): 沉積物鎘濃度與苦草SOD、POD呈正相關(guān)關(guān)系, 與葉綠素含量、鮮重和株高呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 相關(guān)性系數(shù)分別為0.796(P>0.05)、0.588(P>0.05)和-825(P<0.05)、-0.837(P<0.05)和-0.915(P<0.05), 表明沉積物鎘污染會影響植物的正常生理功能; 沉積物鎘濃度與pH呈正相關(guān)關(guān)系, pH與磷酸酶呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 表明鎘濃度會通過影響pH來改變酶活性。

基于微生物屬水平與沉積物環(huán)境指標(biāo)、植物生理生化指標(biāo)Spearman相關(guān)性分析表明(圖5): 沉積物鎘濃度與間孢囊菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、苔蘚桿菌屬和黃桿菌屬呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 與厭氧黏桿菌屬和馬賽菌屬呈顯著正相關(guān)(P<0.05); 同時, 間孢囊菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、苔蘚桿菌屬和黃桿菌屬與苦草鮮重、葉綠素含量、株高呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 與抗氧化酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05); 厭氧黏桿菌屬和馬賽菌屬與抗氧化酶活性呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 與磷酸酶、苦草鮮重、葉綠素含量、株高呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05); 此外, 節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬與鎘濃度呈正相關(guān), 與植物生物量、葉綠素含量呈負(fù)相關(guān)。這些研究結(jié)果表明鎘污染沉積物會影響根際微生物群落結(jié)構(gòu), 根際微生物的活動會影響苦草的生長?？嗖莸纳L受沉積物鎘污染和根際微生物活動共同影響。

圖5 屬分類水平下沉積物微生物群落與環(huán)境因子、苦草生理生化相關(guān)性分析Fig. 5 Correlation analysis of sediment microbial community with environmental factors and Vallisneria natans physiology and biochemistry indexes at genus taxonomic level (* P≤0.05, ** P≤0.01)

3 討論

3.1 沉積物鎘污染對苦草生長及富集轉(zhuǎn)運(yùn)影響

鎘通過誘導(dǎo)一系列植物毒性癥狀來限制植物的生長和發(fā)育, 包括質(zhì)壁分離、營養(yǎng)失調(diào)、葉綠素降解、水分利用效率受損和過量產(chǎn)生活性氧[29]。在本實(shí)驗(yàn)中, 隨著沉積物中鎘濃度的增加, 苦草的鮮重和株高呈下降趨勢, 這與Wang等[30]研究結(jié)果一致。這表明高濃度的鎘可以抑制苦草的生長。在一定鎘濃度脅迫下, 苦草具有適應(yīng)環(huán)境、抵抗逆境的能力。在本研究中, 沉水植物苦草耐受沉積物鎘的濃度為1—20 mg/kg, 當(dāng)超過這一濃度時, 苦草的鮮重和株高顯著下降, 分別是對照組的62.18%和58.42%。

根系充當(dāng)連接沉積物和葉片生物量的樞紐[31]。結(jié)果表明, 苦草不同器官積累的鎘濃度呈根>葉片的模式, 表明鎘從根部向葉片器官的轉(zhuǎn)移減少, 這與He等[31]研究結(jié)果一致?？嗖蒹w內(nèi)鎘最大積累量超過100 mg/kg(DW), 且BSAF系數(shù)均超過1。此外,從轉(zhuǎn)運(yùn)能力來看TF為0.33, 苦草更容易將鎘富集在根部, 表明鎘主要在根系中富集, 從根部到葉片部位能力較弱。這可能與植物對重金屬的耐性機(jī)制有關(guān), 植物根部有特定的結(jié)構(gòu)或生理特性限制重金屬離子由根部向葉片轉(zhuǎn)移, 使得葉片中保持較低的重金屬含量, 或者通過凋葉將重金屬排出體外, 以減輕重金屬對葉片的毒害[32]。由于葉片積累的鎘濃度顯著低于根部, 根據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn), 重金屬向牧食者轉(zhuǎn)移的量較小, 其生物放大的風(fēng)險較低。綜合苦草對鎘污染沉積物的富集能力、轉(zhuǎn)運(yùn)能力和生物放大效應(yīng), 苦草可以作為修復(fù)含鎘污染沉積物的優(yōu)勢植物。在實(shí)際應(yīng)用中, 根部富集能力較強(qiáng)的苦草,建議在修復(fù)時需要定期連根去除, 另外由于種植時間越長, 根系越發(fā)達(dá), 用苦草修復(fù)底泥鎘的時候需要及時收割和清理。

3.2 苦草對沉積物鎘污染的耐受效應(yīng)

本研究從葉綠素含量、丙二醛及抗氧化酶活性方面來分析苦草對沉積物鎘污染的耐受能力。光合色素是植物進(jìn)行光合作用的物質(zhì)基礎(chǔ), 它的含量多少是決定綠色植物光合作用強(qiáng)弱的一個關(guān)鍵生理指標(biāo)[32]。在本研究中, 隨著沉積物中鎘濃度的增加, 苦草的葉綠素含量呈下降趨勢, 這與Yuan等[6]研究輪葉黑藻和加拿大伊樂藻結(jié)果一致。鎘作為植物生長發(fā)育的非必需元素, 具有很強(qiáng)的生物毒性。當(dāng)沉積物鎘濃度較高時(Cd≥20 mg/kg), 苦草葉綠素含量已經(jīng)受明顯的抑制, 直觀表現(xiàn)為葉片失綠、根部發(fā)黑, 這種現(xiàn)象在50 mg/kg時更明顯。苦草葉片葉綠素含量與鎘濃度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05), 與鮮重、株高呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01),表明鎘濃度會導(dǎo)致葉綠素濃度降低進(jìn)而抑制光合作用, 影響植物生長, 這可以部分解釋植物在形態(tài)特征上的表現(xiàn)[11,23]。

氧化損傷是植物受鎘脅迫傷害的主要機(jī)理之一, 植物細(xì)胞中ROS的含量通常會隨著鎘濃度增加而增加, 從而破壞正常的代謝平衡[33]。為了減輕鎘脅迫引發(fā)的氧化損傷, 植物通常會激活抗氧化防御系統(tǒng)改變細(xì)胞代謝以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[34], 抗氧化酶的誘導(dǎo)是減少氧化損傷的重要保護(hù)機(jī)制。SOD通過形成 H2O2和O2在消除超氧自由基(·)中發(fā)揮關(guān)鍵作用, POD可以將H2O2分解為H2O和O2, 降低氧化損傷[22]。在本研究中, 隨著鎘濃度的增加, 苦草葉片內(nèi)的SOD和POD 活性均呈現(xiàn)出先升高再降低的變化趨勢, 與陶理等[18]、Guo等[23]研究其他水生植物變化情況一致, 低濃度的鎘脅迫誘導(dǎo)了抗氧化酶活性的提高。在較低鎘污染環(huán)境里(Cd≤20 mg/kg),苦草葉片細(xì)胞中的POD和SOD活性升高, 增強(qiáng)了細(xì)胞內(nèi)O·的清除能力, 對膜系統(tǒng)起到了一定的保護(hù)作用。但這種保護(hù)作用是有限的, 當(dāng)鎘處理濃度大于20 mg/kg時, SOD和POD活性均逐漸下降, 表明鎘對苦草的毒害作用已經(jīng)超過了抗氧化系統(tǒng)自身調(diào)節(jié)能力, 清除ROS能力減弱, 導(dǎo)致植物膜脂過氧化加劇, 破壞膜結(jié)構(gòu), 影響蛋白質(zhì)合成等各種代謝活動, 使得植株的生長受到限制。而Pearson相關(guān)性結(jié)果顯示鎘濃度與抗氧化酶SOD和POD 活性之間呈正相關(guān)關(guān)系, 也說明鎘脅迫可以誘導(dǎo)抗氧化酶的產(chǎn)生。由圖4可知, 苦草葉片內(nèi)SOD與POD呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01), MDA 含量與POD 活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)。MDA 含量的增加表明植物遭受鎘脅迫后發(fā)生氧化損傷, 苦草體內(nèi)的超氧自由基、過氧化物增多, 刺激植物合成SOD和POD等抗氧化酶, 以清除體內(nèi)的過氧化物, 減少氧化損傷, 所以MDA 與SOD、POD 呈正相關(guān)關(guān)系?？嗖輰ρ趸瘧?yīng)激的這些防御機(jī)制增加了細(xì)胞能量消耗,從而減少了細(xì)胞能量分配, 這意味著細(xì)胞分裂和正常發(fā)育的可用能量更少[24], 故而植物的生長發(fā)育受到限制, 抗氧化酶SOD、POD活性和鮮重呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05), 也說明了這一觀點(diǎn)。

3.3 苦草根際細(xì)菌群落組成及其潛在功能

重金屬會對微生物群落產(chǎn)生影響, 破壞生物體內(nèi)的單/雙鏈和修飾堿基, 還會降低酶的活性[35], 導(dǎo)致微生物的多樣性和豐富度減低[14]。細(xì)菌群落的多樣性對于維持污染沉積物的穩(wěn)定性和功能具有重要的生態(tài)意義[27]。與對照組相比, 處理組的ACE和Chao1多樣性指數(shù)略有增加, 但細(xì)菌多樣性(Shannon和Simpson指數(shù))變化不明顯, 表明鎘毒性沒有明顯影響苦草根際細(xì)菌微生物群落多樣性, 但降低了物種豐富度。本研究中發(fā)現(xiàn)在不同鎘污染濃度的沉積物中pH發(fā)生明顯變化, Bundoora等[36]結(jié)果表明,pH的高低會對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著影響。pH的變化會影響微生物細(xì)胞的表面性質(zhì), 從而導(dǎo)致生理生化過程的改變, 影響特定細(xì)菌的生存和生長, 最終改變沉積物中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[37]。

沉積物中的微生物可通過直接和間接作用影響修復(fù)植物的生長和修復(fù)效率。本研究結(jié)果表明:苦草在不同鎘污染和對照條件下根際細(xì)菌由放線菌(Actinobacteria)、變形菌(Proteobacteria) 和厚壁菌(Firmicutes) 等37個門和間孢囊菌屬(Intrasporangium)、厭氧黏桿菌屬(Anaeromyxobacter) 和norank_f Heliobacteriaceae等542個屬組成。Yuan等[6]研究發(fā)現(xiàn)植物根際沉積物中存在有植物促生特性的細(xì)菌, 其在植物生長和植物耐受逆境脅迫等方面起到重要的作用。此外, 研究團(tuán)隊(duì)前期在苦草根際篩選到具有促進(jìn)植物生長的根際促生菌, 如芽孢桿菌、假單胞菌和腸桿菌屬, 它們通過固氮、溶磷、合成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocy clopropane-1-carb oxylate, ACC)脫氨酶活性、吲哚乙酸和鐵載體促進(jìn)植物生長。與之類似, 我們對苦草根際相對豐度前30的屬進(jìn)行分析, 結(jié)果表明: 間孢囊菌屬、鞘氨醇單胞菌屬、黃桿菌屬、苔蘚桿菌屬、節(jié)桿菌屬、馬賽菌屬、芽單胞菌屬和芽孢桿菌屬等優(yōu)勢種群或差異種群為已報告具有耐重金屬和促進(jìn)植物生長的根際促生細(xì)菌[14,28,38—42]。芽孢桿菌屬、節(jié)桿菌屬和黃桿菌屬已用于重金屬污染土壤植物(PGPR)聯(lián)合修復(fù)研究中。目前苦草生長過程中PGPR 的有效利用開展較少, 對苦草根際PGPR分離、純化并開展聯(lián)合修復(fù)是后續(xù)研究的重要內(nèi)容之一。

基于微生物屬水平與沉積物環(huán)境指標(biāo)、植物生理生化及形態(tài)學(xué)之間的Spearman相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn): 本研究中隨著鎘濃度的增加鞘氨醇單胞菌屬、苔蘚桿菌屬、黃桿菌屬、間孢囊菌屬屬豐度降低與鎘濃度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05), 與葉綠素、鮮重、株高呈顯著正相關(guān)(P<0.05), 表明鎘濃度降低該幾種菌屬的相對豐度, 進(jìn)而可能導(dǎo)致植物葉綠素含量、鮮重和株高降低, 從而影響植物的生長。鞘氨醇單胞菌屬作為一種典型的植物促生細(xì)菌, 促進(jìn)葉綠素的產(chǎn)生和植物的生長[20], 通過提高鎘的生物利用性來增強(qiáng)植物對鎘的吸收[14]; 苔蘚桿菌屬可利用各種糖, 多糖和脂肪酸, 具有在缺氧條件下生長和還原硝酸鹽的能力[43]; 間孢囊菌屬是一種具有抵抗重金屬和高還原能力的細(xì)菌[44]; 黃桿菌屬具有催化H2O2以保護(hù)自身和宿主植物免受重金屬氧化的功能[45], 是一種植物生長促進(jìn)菌, 通過溶磷酸鹽和吲哚乙酸來促進(jìn)植物生長, 增加植物的抗氧化酶活性[46]。而節(jié)桿菌屬、厭氧黏桿菌屬、芽孢桿菌屬和馬賽菌屬的相對豐度隨鎘濃度的增加而增加, 與鎘濃度呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)Cd≥20 mg/kg時, 沉積物中脲酶活性增加可能歸因于苦草根際沉積物中節(jié)桿菌屬豐度的增加, 胡利偉等[47]通過宏基因組測序數(shù)據(jù)表明節(jié)桿菌屬是主要的產(chǎn)脲酶細(xì)菌, 在土壤脲酶酶活的發(fā)揮中貢獻(xiàn)較大。同時節(jié)桿菌屬又是一種植物生長促進(jìn)菌, 可以抵抗重金屬毒性并產(chǎn)生胞外聚合物和吲哚乙酸來促進(jìn)植物生長[39,40], 從而增加植物對重金屬的吸收, 在減輕氧化應(yīng)激損害方面具有保護(hù)作用。厭氧黏桿菌是一種多功能的Gammaproteobacteria, 被用于重金屬和放射性核素的生物修復(fù)[48]。芽孢桿菌可增強(qiáng)水稻的植物修復(fù)并減輕鎘毒性, 通過增加抗氧化酶的活性來增強(qiáng)水稻對鎘的耐受性, 包括過氧化氫酶、POD和SOD, 并減少對植物根系的氧化損傷[38]。馬賽菌屬于草酸桿菌科, 是根際微生物的重要組成部分[49], 可以產(chǎn)生鐵載體, 螯合重金屬以增加其生物可利用性來促進(jìn)植物的根部吸收[41], 提高植物的抗氧化酶活性, 從而提高苦草的抗逆性。從以上報道的結(jié)果可以得知,具有植物促生性能的細(xì)菌可通過兩個方面促進(jìn)植物對于重金屬沉積物的修復(fù)。一方面, 直接誘導(dǎo)產(chǎn)生有機(jī)酸、鐵載體、植物生長激素、ACC脫氨酶、表面活性劑和磷酸鹽的增溶作用, 改善植物營養(yǎng)、促進(jìn)植物生長, 提高重金屬離子的生物可利用性[50], 進(jìn)而易于被植物提取, 從而提高植物對重金屬污染沉積物的修復(fù)效率。另一方面, 間接通過誘導(dǎo)植物抗性系統(tǒng), 增加抗氧化酶活性, 降低重金屬離子的遷移率和毒性等增強(qiáng)植物的重金屬抗性[51]。目前芽孢桿菌、鞘氨醇單胞菌、節(jié)桿菌和黃桿菌,已應(yīng)用于植物-根際促生細(xì)菌聯(lián)合修復(fù)鎘污染土壤,同時也有根際促生菌促進(jìn)沉水植物生長的研究[52],對后續(xù)修復(fù)鎘污染沉積物具有很好的借鑒意義。

4 結(jié)論

本文探究了鎘污染沉積物對苦草的生理生化指標(biāo)和微根際生物群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明:(1)當(dāng)Cd≥20 mg/kg處理時, 苦草植株開始出現(xiàn)傷害癥狀, 具體表現(xiàn)為鮮重和株高, 葉綠素含量和抗逆能力下降, SOD和POD活性先上升后下降, MDA含量上升; (2)根系作用是沉水植物吸收和富集沉積物鎘污染的關(guān)鍵途徑, 苦草將多數(shù)富集的鎘積累在植物根部, 綜合苦草對鎘污染的耐受和富集能力,并結(jié)合實(shí)際情況, 苦草可作為修復(fù)含鎘沉積物的理想植物。參考植物的轉(zhuǎn)運(yùn)能力, 建議在收獲苦草時需要定期連根去除; (3)測序結(jié)果表明苦草根際由放線菌門、厚壁菌門和變形菌門等37個門組成, 包含鞘氨醇單胞菌屬、黃桿菌屬、馬賽菌屬、芽孢桿菌屬和節(jié)桿菌屬等植物促生細(xì)菌(PGPR)種群, 這些細(xì)菌可能在促進(jìn)苦草生長、耐受和富集重金屬鎘起到重要作用。對苦草根際PGPR分離、純化并開展微生物-植物協(xié)同修復(fù)是后續(xù)研究的重要內(nèi)容之一。