岳小真 常嬌嬌 常新月 李槿年

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院, 安徽省獸醫(yī)病理生物學(xué)與疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 合肥 230036)

Hepcidin(Hepatic bactericidal proteins)又稱鐵調(diào)素, 是一類富含半胱氨酸, 兼有廣譜抗菌、免疫調(diào)節(jié)和鐵代謝調(diào)節(jié)作用的抗菌肽[1]。自Shike等[2]從雜交條紋鱸(Morone chrysops)中分離到Hepcidin以來, 國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)魚源抗菌肽Hepcidin的抗菌活性進(jìn)行了廣泛研究。研究結(jié)果表明該抗菌肽對(duì)嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)和海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)等多種水產(chǎn)生物病原菌均具有較強(qiáng)的體外抑菌活性[3,4]。同時(shí)發(fā)現(xiàn), 注射或飼投該抗菌肽可通過調(diào)節(jié)宿主免疫功能而發(fā)揮體內(nèi)抗遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)或柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)作用[5,6]。因此, 魚源Hepcidin被認(rèn)為是最有前景的新型抗菌感染藥物之一。但是, 目前關(guān)于魚源Hepcidin的抗菌作用機(jī)制和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不完全清楚, 這限制了其開發(fā)應(yīng)用。

微小核糖核酸(miRNA)是由內(nèi)源性基因編碼的長(zhǎng)度在18—25 nt的單鏈非編碼小分子 RNA[7]。在脊椎動(dòng)物中, miRNA能夠通過與靶基因mRNA的3′端非翻譯區(qū)互補(bǔ)結(jié)合, 引起靶標(biāo)mRNA降解或翻譯抑制, 從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá), 并參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、免疫等諸多生物學(xué)過程[8]。已有研究報(bào)道, 魚類miRNA可以通過靶向免疫信號(hào)通路中的多個(gè)分子調(diào)控先天免疫應(yīng)答, 從而在宿主受病原菌感染及疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。如在斜帶石斑魚(Epinephelus coioides)中,miR-146a通過靶向負(fù)調(diào)控TRAF6表達(dá)促進(jìn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(RGNNV)的復(fù)制[9]。Huo等[10]研究表明, 鯽(Carassius auratus)鰓中miR-17、miR-26a、miR-144和miR-146a等關(guān)鍵miRNAs在嗜水氣單胞菌感染后的局部免疫反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。曹守林[11]研究發(fā)現(xiàn)加州鱸(Carassius auratus)免疫接種鰤?mèng)~諾卡氏菌雙載體核酸疫苗后, 脾臟中顯著下調(diào)的ola-miR-139靶向TRAF6激活NF-κB通路, 從而增強(qiáng)疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答水平。然而, 迄今為止魚源抗菌肽Hepcidin過表達(dá)能否誘導(dǎo)細(xì)胞miRNA表達(dá)譜變化, 以及細(xì)胞中關(guān)鍵miRNA在Hepcidin免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的作用尚未見報(bào)道。

我們?cè)谇捌谘芯恐幸炎C實(shí)草魚Hepcidin(CiHep)具有良好的體外抗擬態(tài)弧菌活性[12], 且體內(nèi)注射的CiHep基因重組真核表達(dá)質(zhì)?？赏ㄟ^調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能而保護(hù)65%草魚抗擬態(tài)弧菌感染(結(jié)果未發(fā)表),但其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。為此, 本研究借助高通量測(cè)序和生物信息學(xué)軟件分析CiHep過表達(dá)前后CIK細(xì)胞中miRNA差異表達(dá)譜, 挖掘富集在免疫信號(hào)通路中的關(guān)鍵差異表達(dá)miRNA及其靶基因, 以期為從miRNA角度深入研究抗菌肽CiHep的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

草魚腎細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存; 大腸埃希氏菌DH5α菌株(Escherichia coliDH5α)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司; 真核表達(dá)載體pmCherry-N1由上海獸醫(yī)研究所劉光清研究團(tuán)隊(duì)惠贈(zèng)。

1.2 CiHep基因的重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)草魚Hepcidin(CiHep)基因成熟肽序列(NO.JQ246442.1)設(shè)計(jì)1對(duì)帶有酶切位點(diǎn)的特異性引物(表1), 用于構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-N1-Cihep。以CIK細(xì)胞cDNA為模板, PCR擴(kuò)增CiHep基因。PCR反應(yīng)體系(50 μL)為: 2×TaqPCR MasterMix 25 μL,上、下游引物各1 μL, DNA模板2 μL, ddH2O 21 μL。PCR反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 95℃變性30s,65℃退火30s, 72℃延伸30s, 30個(gè)循環(huán); 72℃ 3min。將純化的PCR產(chǎn)物與空載體pmCherry-N1依次進(jìn)行XhoI與EcoR I雙酶切、酶連及轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。取轉(zhuǎn)化液均勻涂布于含100 μg/mL Kana的LB培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)16h。隨機(jī)挑取3個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后, 抽提重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR與雙酶切鑒定。

1.3 CiHep基因最佳過表達(dá)時(shí)間的篩選

為了以轉(zhuǎn)染后CiHep基因相對(duì)表達(dá)量及其蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值的CIK細(xì)胞作為測(cè)序樣品, 需要篩選CiHep基因的最佳過表達(dá)時(shí)間點(diǎn)。首先將生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度為2×106個(gè)/孔的CIK細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板, 用MEM完全培養(yǎng)液于28℃、5% CO2條件下培養(yǎng)至80%匯合度, 棄去孔內(nèi)培養(yǎng)液, 更換為不含血清與雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液, 使用Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將重組表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-N1-Cihep轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中, 轉(zhuǎn)染后每一檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(48h、72h和96h)做6個(gè)復(fù)孔(用于檢測(cè)基因轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)各3孔)。轉(zhuǎn)染體系為: 2.5 μg質(zhì)粒、3.75 μL轉(zhuǎn)染試劑和250 μL不含血清與雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)液。

分別于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(48h、72h和96h)收集細(xì)胞樣品, 用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA, 按照FastKing RT Kit(With gDNase)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)檢測(cè)用模板。根據(jù)CiHep基因序列設(shè)計(jì)用于熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)的特異性引物, 并選用β-actin作為內(nèi)參基因(表1)。qPCR反應(yīng)體系: 2×SuperReal PreMix Plus 10 μL, cDNA模板100 ng, 上下游引物各0.5 μL, RNase free ddH2O補(bǔ)足至20 μL。反應(yīng)條件: 95℃ 預(yù)變性15min、95℃10s, 60℃ 30s, 共計(jì)40個(gè)循環(huán), 每個(gè)樣品做3個(gè)技術(shù)重復(fù)。在反應(yīng)結(jié)束后, 使用2-??Ct法[14]計(jì)算各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)(轉(zhuǎn)染后48h、72h和96h)目的基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平, 并進(jìn)行單因素方差分析。

進(jìn)一步, 分別于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)(48h、72h和96h), 棄去細(xì)胞孔內(nèi)培養(yǎng)液, 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌3次, 用4%多聚甲醛室溫固定細(xì)胞15min,PBS洗滌3次, 再用DAPI染核10min, PBS洗滌3次,在熒光倒置顯微鏡下觀察熒光融合蛋白mCherry-CiHep的表達(dá)情況。

1.4 測(cè)序樣品采集與細(xì)胞總RNA提取

按1.3方法將重組表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-N1-Cihep轉(zhuǎn)染CIK細(xì)胞, 共轉(zhuǎn)染3個(gè)孔(轉(zhuǎn)染組), 同時(shí)做3孔PBS對(duì)照(PBS對(duì)照組)。轉(zhuǎn)染后72h, 收集各孔細(xì)胞,用TRIzol?Reagent提取細(xì)胞總RNA。然后, 利用NanoDrop ND-2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific)測(cè)定總RNA濃度與純度, 使用Agilent Bioanalyzer2100( Agilent Technologies)評(píng)估RNA完整性(RIN)。若A260/A280>1.8且RIN >7, 表明RNA質(zhì)量合格。

1.5 sRNA文庫(kù)構(gòu)建與miRNA測(cè)序

將質(zhì)檢合格的二組各3個(gè)RNA樣品等量混合為2個(gè)測(cè)序樣品(編號(hào)TRH與TRQ)送至北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行miRNA測(cè)序。即PAGE電泳切膠得到大小為18—30 nt目的片段, 通過單鏈DNA接頭連接, 加入消化酶去除3′接頭, 以帶UMI的RT引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄延伸, 合成cDNA; 高敏聚合酶擴(kuò)增富集cDNA, 再進(jìn)行文庫(kù)定量和pooling環(huán)化, 構(gòu)建sRNA文庫(kù)后, 利用Illumina HiSeq 2500 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序, 測(cè)序讀長(zhǎng)為測(cè)序讀長(zhǎng)為single-end(SE) 50 nt。

1.6 miRNA的鑒定與預(yù)測(cè)

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)為圖像文件經(jīng)過base calling, 得到以fastq格式存儲(chǔ)的raw reads。利用FastQC軟件[15]去除raw reads中帶有接頭與低質(zhì)量序列, 統(tǒng)計(jì)序列的總數(shù)、種類及長(zhǎng)度, 得到純凈序列clean reads用于生物信息學(xué)分析。

運(yùn)用Bowtie軟件[16]將長(zhǎng)度為18—30 nt的Clean Reads比對(duì)至草魚參考基因組(http://www.ncgr.ac.cn/grasscarp/), 通過與mRNA的外顯子和內(nèi)含子進(jìn)行比對(duì), 篩選來自mRNA降解片段的sRNA, 并按照已知成熟的miRNA (Known miRNA)＞rRNA＞tRNA＞snRNA＞snoRNA＞repeat＞gene＞新miRNA (Novel miRNA)順序?qū)γ總€(gè)sRNA進(jìn)行注釋, 獲得過表達(dá)CiHep前后CIK細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜。再將有效reads與miRBase 22.0數(shù)據(jù)庫(kù)中miRNA前體與成熟肽序列進(jìn)行比對(duì), 完全匹配的序列認(rèn)定為known miRNA。對(duì)于未注釋的序列, 則依據(jù)miRNA前體的發(fā)夾結(jié)構(gòu)、二級(jí)結(jié)構(gòu)和最低自由能等信息, 運(yùn)用miRDeep2軟件[17]預(yù)測(cè)novel miRNA。

1.7 差異表達(dá)miRNA篩選及其靶基因功能分析

計(jì)算測(cè)序樣品中miRNA的表達(dá)量, 使用TPM(每百萬次讀取的轉(zhuǎn)錄本)進(jìn)行歸一化處理。以|log2(Fold change)|≥0.585, 且FDR(錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率)≤0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn), 利用edgeR軟件[18]篩選抗菌肽過表達(dá)前后CIK細(xì)胞中顯著差異表達(dá)的miRNA (DEmiRNA)。

為挖掘miRNA的下游靶基因, 聯(lián)合利用TargetScan和miRanda軟件[19]對(duì)DEmiRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè), 取兩者的交集作為潛在靶基因。進(jìn)而用基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology, GO)和京都基因和基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)對(duì)潛在靶基因進(jìn)行功能注釋和通路富集分析。為了進(jìn)一步分析DEmiRNA可能在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的作用, 運(yùn)用在線分析軟件Cytoscape(http://www.cytoscape.org/)[20]繪制與免疫過程相關(guān)的miRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)互作圖。

1.8 差異表達(dá)miRNA的qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證篩選的差異表達(dá)miRNA的準(zhǔn)確性, 隨機(jī)取12個(gè)已知DEmiRNA(7個(gè)下調(diào)、5個(gè)上調(diào))進(jìn)行PolyA加尾法qPCR檢測(cè)。即先委托北京擎科生物科技有限公司設(shè)計(jì)與合成miRNA上游引物, 下游引物則為miRNA第一鏈cDNA合成(加尾法)試劑盒中提供的通用引物。進(jìn)而用該試劑盒將測(cè)序生物公司返回的RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA, 并以此為模板,按照1.3方法中體系與反應(yīng)條件進(jìn)行qPCR檢測(cè),U6作為內(nèi)參基因。反應(yīng)結(jié)束后采用2-??Ct法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有的qPCR檢測(cè)結(jié)果均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。利用SPSS 26.0軟件中的單因素方差(One-Way ANOVA)法分析miRNA和mRNA表達(dá)量在對(duì)照組與過表達(dá)組中的差異水平(P<0.05, 差異顯著;P<0.01, 差異極顯著;P<0.001, 差異極極顯著), 并采用Graphpad Prism 8作圖。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒的PCR與雙酶切鑒定

采用常規(guī)酶切酶連法構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-N1-Cihep, 抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切鑒定。結(jié)果如圖1所示, 以質(zhì)粒DNA為模板擴(kuò)增到目的基因CiHep(圖1a泳道, 99 bp); 雙酶切反應(yīng)后均獲得兩條DNA條帶, 其大小分別與空載體和目的基因大小基本一致(圖1b泳道3和4), 說明重組表達(dá)質(zhì)粒pmCherry-N1-Cihep構(gòu)建成功。

圖1 重組表達(dá)質(zhì)粒 pmCherry-N1-Cihep的PCR(a)與雙酶切鑒定(b)Fig. 1 PCR and enzyme digestion Identification of recombinant expression plasmid pmCherry-N1-Cihep by PCR (a) and double enzyme digestion (b)

2.2 CiHep基因的最佳過表達(dá)時(shí)間

通過檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間點(diǎn)CiHep基因轉(zhuǎn)錄情況(mRNA表達(dá)水平)及其熒光融合蛋白表達(dá)情況, 綜合分析其最佳過表達(dá)時(shí)間。結(jié)果如圖2所示,與未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞對(duì)照組相比, 轉(zhuǎn)染組CiHep基因mRNA表達(dá)水平在各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)均顯著上調(diào)(P<0.01),且轉(zhuǎn)染后72h的mRNA表達(dá)水平極顯著高于48h(P<0.01)和極極顯著高于96h(P<0.001)。熒光倒置顯微鏡觀察到各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)紅色熒光融合蛋白mCherry-CiHep在胞質(zhì)與胞核中均有表達(dá), 且以轉(zhuǎn)染后72h細(xì)胞發(fā)出的紅色熒光強(qiáng)度最高(圖3)。結(jié)果說明CiHep基因在CIK細(xì)胞中最佳過表達(dá)時(shí)間為轉(zhuǎn)染后72h, 應(yīng)選擇該時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣品用于miRNA測(cè)序。

圖2 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間CiHep基因在CIK細(xì)胞中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig. 2 Relative transcription levels of CiHep gene in CIK cells at different times after transfection

圖3 轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間熒光融合蛋白mCherry-CiHep在CIK細(xì)胞中的表達(dá)Fig. 3 Expression of fluorescent fusion protein mCherry-CiHep in CIK cells at different times after transfection

2.3 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

結(jié)果如表2所示, 抗菌肽CiHep過表達(dá)前后的2個(gè)sRNA文庫(kù)中分別有10414716條和15695371條miRNA原始序列。去除低質(zhì)量序列、接頭序列和短序列后, 分別篩選出10030808和14869867條Clean reads, 分別占總Read的96.31%和94.74%。Q30堿基百分比分別為96.72%和97.09%, 錯(cuò)誤率均為0.1%。對(duì)照組(TRQ)和過表達(dá)組(TRH)能夠定位到草魚基因組上的Unique序列分別有9921271條和14635340條, 匹配率分別為92.83%和91.96%。2個(gè)文庫(kù)中miRNA長(zhǎng)度分布在18—24 nt, 其中序列長(zhǎng)度為22 nt所占比例最大, 與典型的miRNA長(zhǎng)度分布相符(圖4)。以上結(jié)果表明, 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量良好, 可用于后續(xù)分析。

圖4 2個(gè)文庫(kù)中miRNA長(zhǎng)度分布Fig. 4 Length distribution of miRNA in two libraries

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab. 2 Sequencing data statistics

2.4 sRNA分類注釋及miRNA的鑒定與預(yù)測(cè)

sRNA分類注釋結(jié)果顯示, 2個(gè)文庫(kù)(TRQ和TRH)中miRNA所占比例最高, 分別為 98.91%和98.41%,其余依次是tRNA (0.49%和0.89%)、rRNA (0.36%和0.51%)和Repeat (0.22%和0.16%; 圖5)。將有效reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì), 從對(duì)照組(TRQ)與過表達(dá)組(TRH)分別鑒定到1850和2013種已知成熟的miRNA, 其中有10個(gè)已知miRNAs僅在對(duì)照組中出現(xiàn), 173個(gè)已知miRNAs只在過表達(dá)組中檢測(cè)到。對(duì)于比對(duì)上草魚基因組但未注釋上任何RNA類型的Clean reads則通過miRDeep2軟件分析, 在對(duì)照組與過表達(dá)組分別預(yù)測(cè)到1266和1347種新miRNA, 其中有1260個(gè)新miRNA為二組共有。

圖5 過表達(dá)前后2個(gè)文庫(kù)中sRNA的分類注釋Fig. 5 Classified annotations of sRNA in the two libraries before and after overexpression

2.5 CiHep過表達(dá)后CIK細(xì)胞中差異表達(dá)的miRNA

以|log2(Fold change)|≥0.585且FDR≤0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn), 對(duì)CiHep過表達(dá)前后CIK細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA進(jìn)行篩選。結(jié)果如圖6所示, 與對(duì)照組相比, 過表達(dá)組細(xì)胞中共出現(xiàn)460個(gè)DEmiRNA, 其中392個(gè)顯著上調(diào)、68個(gè)顯著下調(diào), 已知DEmiRNA 222個(gè)、新預(yù)測(cè)的DEmiRNA 238個(gè), 在已知miRNA中pma-miR-199b-5p為下調(diào)倍數(shù)最大(3.76倍)的DEmiRNA。

圖6 CIK細(xì)胞中差異表達(dá)miRNA火山圖Fig. 6 Volcano plot of differentially expressed miRNA in CIK cells

2.6 差異表達(dá)miRNA的靶基因及其功能分析

利用TargetScan和miRanda 兩款軟件對(duì)460個(gè)DEmiRNA進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè), 共得到5150個(gè)潛在靶基因, 其中有436個(gè)潛在靶基因得到GO注釋, 可富集到細(xì)胞、細(xì)胞部分和膜等16個(gè)細(xì)胞組件, 參與細(xì)胞進(jìn)程、生物學(xué)調(diào)節(jié)和單細(xì)胞生物進(jìn)程等22個(gè)生物學(xué)過程, 發(fā)揮結(jié)合、催化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等13種分子功能(圖7)。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示, 有157個(gè)潛在靶基因富集于54條KEGG通路, 其中屬于細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類疾病、新陳代謝及生物系統(tǒng)6類通路, 主要發(fā)現(xiàn)C型凝集素受體(C-type lectinreceptor, CLR)、PI3KAkt通路、NOD樣受體(NLRs)、內(nèi)吞作用(Endocytosis)、細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)(Regulation of actin cytoskeleton)、神經(jīng)活性配體受體相互作用(Neurolactive ligand recepto interaction)、細(xì)胞黏附分子(Cell adhesion moleclules)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)和絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)等免疫相關(guān)信號(hào)通路(圖8)。互作分析結(jié)果如圖9所示, 29條DEmiRNA(2條已知、27條新DEmiRNA)、23個(gè)潛在的靶基因以及13個(gè)免疫相關(guān)信號(hào)通路構(gòu)成了miRNA-mRNA-免疫互作網(wǎng)絡(luò)。互作網(wǎng)絡(luò)中1個(gè)miRNA可以同時(shí)靶向多個(gè)宿主細(xì)胞基因, 1個(gè)宿主細(xì)胞基因也能受到多個(gè)miRNA的調(diào)控,2條已知DEmiRNA富集在PI3K-Akt通路和NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)通路。

圖7 差異表達(dá)miRNA靶基因GO分析Fig. 7 GO analysis of target genes corresponding to differentially expressed miRNA

圖8 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG通路富集分析Fig. 8 Enrichment analysis of KEGG pathway of target genes corresponding to differentially expressed miRNA

圖9 miRNA-mRNA-免疫信號(hào)通路互作網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 9 miRNA-mRNA- immune signaling pathway interaction network map

2.7 qPCR驗(yàn)證結(jié)果

隨機(jī)選擇了12個(gè)已知DEmiRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖10所示, 與對(duì)照組相比, 過表達(dá)組中cfa-miR-99a顯著下調(diào)(P<0.05); dre-miR-34c-5p、pma-miR-199b-5p、abu-miR-24a、mze-miR-187、ccr-miR-24和abu-miR-192極顯著下調(diào)(P<0.01); dremiR-301a與ccr-miR-140-5p顯著上調(diào)(P<0.05); dremiR-19c-3p、dre-miR-221-5p和ccr-miR-124b極顯著上調(diào)(P<0.01)。各檢測(cè)miRNA的表達(dá)模式均與高通量測(cè)序結(jié)果完全一致, 表明本次測(cè)序結(jié)果有較高的準(zhǔn)確性和可信度。

圖10 差異表達(dá)miRNA的qPCR驗(yàn)證Fig. 10 Verification of differentially expressed miRNA by qPCR

3 討論

抗菌肽既是免疫效應(yīng)因子, 也是免疫調(diào)節(jié)因子。已有研究表明, 體內(nèi)抗菌肽的濃度通常很低(遠(yuǎn)小于其最低抑菌濃度), 并不表現(xiàn)出明顯的直接抑菌或殺菌作用, 而是通過調(diào)節(jié)機(jī)體的促炎和抗炎反應(yīng), 激活吞噬細(xì)胞, 增強(qiáng) T、B 淋巴細(xì)胞活性, 誘導(dǎo)趨化因子與細(xì)胞因子產(chǎn)生等來發(fā)揮間接抗菌作用的[21]。對(duì)昆蟲抗菌肽免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)機(jī)體受到外來病原體感染時(shí), 昆蟲抗菌肽可以啟動(dòng)天然免疫信號(hào)通路機(jī)制調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[22]。miRNA是魚類復(fù)雜免疫應(yīng)答調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵組成部分。近年來, 隨著miRNA高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)分析技術(shù)的快速發(fā)展, 對(duì)參與魚類免疫應(yīng)答的miRNA類型和特征也有了一些認(rèn)識(shí)[23]。但是, 魚源抗菌肽Hepcidin過表達(dá)能否誘導(dǎo)細(xì)胞miRNA表達(dá)譜變化, 以及其中關(guān)鍵miRNA在Hepcidin免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮的作用尚不清楚。為此, 本研究首先篩選CiHep最佳過表達(dá)時(shí)間, 當(dāng)CiHep基因相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)量達(dá)到最大值時(shí)收集細(xì)胞樣品, 進(jìn)而借助miRNA測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)軟件首次對(duì)CiHep過表達(dá)前后的CIK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,CiHep過表達(dá)可引起CIK細(xì)胞miRNA表達(dá)譜發(fā)生明顯變化, 共獲得460個(gè)DEmiRNA, 其中392個(gè)顯著上調(diào)、68個(gè)顯著下調(diào), 已知DEmiRNA 222個(gè)、預(yù)測(cè)的新DEmiRNA 238個(gè)以及免疫相關(guān)DEmiRNA 48個(gè)。進(jìn)一步隨機(jī)取12個(gè)已知DEmiRNA進(jìn)行qPCR驗(yàn)證, 發(fā)現(xiàn)其表達(dá)變化趨勢(shì)與測(cè)序結(jié)果一致。這些結(jié)果不僅可豐富草魚miRNA的種類與數(shù)量, 而且鑒定獲得的免疫相關(guān)DEmiRNA可為從miRNA角度深入研究CiHep的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制提供素材。

為了深入挖掘CiHep過表達(dá)后細(xì)胞中潛在的miRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 聯(lián)合利用TargetScan和miRanda軟件預(yù)測(cè)DEmiRNA對(duì)應(yīng)的靶基因,并對(duì)潛在靶基因進(jìn)行GO功能注釋和KEGG通路富集分析。GO功能注釋分析結(jié)果顯示, 潛在靶基因富集在生物過程條目中的生物學(xué)調(diào)節(jié)和分子功能條目中的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)活性均與免疫調(diào)控過程相關(guān)。KEGG通路富集分析結(jié)果表明,有157個(gè)潛在靶基因富集于6類54條KEGG通路, 其中29條DEmiRNA及其潛在的23個(gè)靶基因及13個(gè)免疫相關(guān)信號(hào)通路構(gòu)成miRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。韓朝輝等[24]報(bào)道m(xù)iR-199b-5p是一種腫瘤抑制因子, 可靶向透明質(zhì)酸蛋白聚糖連結(jié)蛋白1增強(qiáng)順鉑對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的殺傷力。曾妮[25]研究發(fā)現(xiàn)胞核內(nèi)miR-199b-5p能夠靶向細(xì)胞周期依賴性激酶9, 上調(diào)心肌纖維化相關(guān)基因的表達(dá), 促進(jìn)心肌纖維化過程。本研究中已知miRNA中下調(diào)倍數(shù)最大的pma-miR-199b-5p與2個(gè)差異表達(dá)的新miRNA(novel_miR_317和novel_miR_838)具有共同預(yù)測(cè)靶基因蛋白激酶B(又稱為AKT), 并在miRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中富集于PI3K-Akt信號(hào)通路。這些研究結(jié)果表明相同的miRNA可能通過直接或間接靶向多個(gè)靶基因調(diào)控多個(gè)不同信號(hào)通路。在哺乳動(dòng)物中已證實(shí)AKT是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶, 也是PI3K-Akt通路中關(guān)鍵信號(hào)分子, AKT通過磷酸肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase, PI3K)依賴方式活化后,磷酸化下游靶蛋白, 最終激活PI3K-Akt信號(hào)通路[26]。PI3K/Akt信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路, 能夠調(diào)控細(xì)胞代謝、凋亡、存活和增殖等, 尤其是促進(jìn)B細(xì)胞和T細(xì)胞的發(fā)育、激活和分化[27]。然而, pma-miR-199b-5p是否真正靶向草魚AKT基因, 草魚AKT蛋白是否能夠激活PI3K-Akt信號(hào)通路是后續(xù)需要深入研究的問題。

NOD樣受體(NOD-like receptors, NLRs)是一類胞質(zhì)模式識(shí)別受體, NLRs能識(shí)別進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的微生物相關(guān)分子模式(Microbe-associated molecular patterns, MAMPs)并激活非特異性免疫應(yīng)答, 在抗微生物感染和控制炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[28]。在哺乳動(dòng)物中鑒定出至少22個(gè)NLR家族成員, 并且miR-223通過靶向NLRP3基因抑制炎性小體中IL-1β 的產(chǎn)生[29]。近年來, 參與調(diào)控NLRs信號(hào)通路的一些魚類miRNA也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn), 如miR-144與miR-217可以靶向硬骨魚NOD1基因, 并在 LPS 刺激下抑制促炎因子表達(dá), 從而避免過度的炎癥反應(yīng)[30]。斑點(diǎn)叉尾鮰(Ietalurus punetaus)的NLRC5是ipu-miR-24b、ipu-miR-101a、ipu-miR-3618、ipu-miR-7547、ipu-miR-7556、ipu-miR-7559、ipu-miR-7564、ipumiR-7567和ipumiR-7574的靶基因[31]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CiHep后, 顯著上調(diào)的dre-miR-15a-5p的潛在靶基因?yàn)镚BP1(鳥苷酸結(jié)合蛋白1)基因、novel_miR_693與novel_miR_1221可能分別靶向CARD6(CARD域蛋白6)和DHX33(ATP依賴的RNA解旋酶)、novel_miR_185與novel_miR_234可能同時(shí)靶向DHX33和SGT1(SKP1G2等位基因抑制因子), 并且它們?cè)趍iRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中富集于NLRs信號(hào)通路, 提示其參與調(diào)控NLRs信號(hào)通路。

目前miRBase 22.0數(shù)據(jù)庫(kù)中已經(jīng)收錄了271個(gè)物種的miRNA前體38589個(gè), 編碼48885條成熟miRNA[32]。但是, 許多miRNA的功能仍不清楚, 已知miRNA靶基因的數(shù)量也非常有限, 因而進(jìn)一步發(fā)掘新miRNA及其靶基因顯得尤為重要。根據(jù)本次測(cè)序結(jié)果, 我們累計(jì)預(yù)測(cè)出過表達(dá)抗菌肽后可產(chǎn)生238個(gè)差異表達(dá)的新miRNA, 其中27個(gè)新DEmiRNA富集在免疫相關(guān)信號(hào)通路, 尤其是novel_miR_317與novel_miR_536可同時(shí)富集到TRP通道炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)通路與腸IgA產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)通路。這些預(yù)測(cè)的novel miRNA是否真正存在, 還需要進(jìn)一步克隆鑒定, 也是進(jìn)行后續(xù)相關(guān)功能研究的基礎(chǔ)。

綜上, 本研究在明確CiHep最佳過表達(dá)時(shí)間的基礎(chǔ)上, 解析了過表達(dá)前后CIK細(xì)胞miRNA差異表達(dá)譜特征, 構(gòu)建了潛在的miRNA-mRNA-免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 挖掘出pma-miR-199b-5p、dre-miR-15a-5p 、novel_miR_317和novel_miR_536在免疫調(diào)控中發(fā)揮潛在重要功能。研究結(jié)果從miRNA角度為深入探究CiHep的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了良好基礎(chǔ)。