陳劍平 馮廣朋 * 李新蒼 *

(1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 上海 201306; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室, 上海 200090)

中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis), 俗稱河蟹、大閘蟹, 是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖主要養(yǎng)殖對象之一。與其他無脊椎動物類似, 中華絨螯蟹依靠先天免疫系統(tǒng)抵御病原微生物的感染[1]。抗菌肽是無脊椎動物免疫系統(tǒng)的重要效應(yīng)因子, 在清除宿主體內(nèi)病原微生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2]。甲殼動物抗菌肽主要包括甲殼肽(Crustin)、抗脂多糖因子(Anti-lipopolysaccharide factor, ALF)、對蝦素(Penaeidin)及溶菌酶(Lysozyme)等家族[3]。

甲殼肽家族為富含半胱氨酸的陽離子抗菌肽,分子量大小在7—14 kD, 序列N端含有信號肽序列,C端含有乳清酸性蛋白(Whey acidic protein, WAP)結(jié)構(gòu)域[4]。WAP結(jié)構(gòu)域內(nèi)含有8個保守的半胱氨酸,可形成四對二硫鍵, 又稱為“4DSC”結(jié)構(gòu)域, 其在分子內(nèi)部形成1個疏水核心[5]。在不同甲殼肽信號肽序列和WAP結(jié)構(gòu)域之間的區(qū)域常存在序列和結(jié)構(gòu)差異, 根據(jù)該區(qū)域結(jié)構(gòu)模式不同, 將甲殼肽分為五種主要類型[6]。甲殼動物中常見Ⅰ—Ⅳ型, Ⅴ型甲殼肽則主要存在于膜翅目昆蟲中[7]。1個物種通常含有多個甲殼肽分子, 呈現(xiàn)多樣的生物學(xué)功能。例如, 擬穴青蟹 (Scylla paramamosain)中已報道8個甲殼肽基因, 其中5個Ⅰ型甲殼肽[8—10], 3個屬于Ⅱ型甲殼肽[11—13], 它們大多數(shù)具有微生物結(jié)合活性, 并具有抗細(xì)菌、真菌和病毒的功能。中華絨螯蟹中也有2個Ⅱ型甲殼肽[14,15]和2個Ⅳ型甲殼肽[16,17]被報道, 參與不同免疫反應(yīng)。此外, 對蝦中也發(fā)現(xiàn)了大量具有抗微生物功能的甲殼肽分子[18—20]。

卵巢是雌性中華絨螯蟹的生殖器官, 對中華絨螯蟹的繁育和養(yǎng)殖具有重要意義。本研究將通過生物信息學(xué)分析、基因表達(dá)分析、蛋白表達(dá)與純化、免疫學(xué)功能驗證, 從中華絨螯蟹卵巢組織中鑒定2個Ⅰ型甲殼肽分子, 分析其免疫相關(guān)功能, 明確這2個抗菌肽的功能差異及作用, 豐富甲殼動物生殖系統(tǒng)免疫理論。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

中華絨螯蟹中華絨螯蟹親蟹, 購于江蘇省高郵湖, 雌蟹(97.03±11.09) g, 雄蟹(125.03±10.38) g,于實驗室養(yǎng)殖缸中暫養(yǎng)1周[溫度(20±3)℃, pH 8.1±0.4], 適應(yīng)實驗環(huán)境。實驗前挑選附肢完整, 體表無損傷, 活力強的個體作為實驗對象。

菌株和載體實驗中所用菌株均為本實驗室保藏或購買, 9種保藏菌株包括3種革蘭氏陽性菌: 金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium), 5種革蘭氏陰性菌: 大腸桿菌(Escherichia coli)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi), 1種真菌: 白色念珠菌(Candida albicans)。大腸桿菌DH5α和DE3感受態(tài)細(xì)胞購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。所用pMD19-T載體購于TaKaRa公司(中國大連), pET-32a表達(dá)載體購自Novagen公司(德國)。

主要試劑與設(shè)備RNAiso Plus、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、LATaq酶、質(zhì)粒提取試劑盒、TB Green Premix ExTaq酶、T4連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶購于TaKaRa公司; 膠回收試劑盒購于北京全式金生物技術(shù)有限公司; DNase I為Promega(美國)公司產(chǎn)品; 氨芐青霉素(Amp)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)購于上海生工生物工程有限公司; Ni-NTA His Bind Resin購于Merck(美國); 胰蛋白胨、酵母提取物、兩種肽聚糖(PGN, 來自于金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌)、脂磷壁酸(LTA, 來自于枯草芽孢桿菌)、脂多糖(LPS, 來自于大腸桿菌0111:B4)、β-葡聚糖(來自于海帶)和3, 3′, 5, 5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購于Sigma(美國); 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器包括: 梯度PCR儀(Eppendorf, Mastercycler X50s)、熒光定量PCR儀(Thermo, ABI Quant-Studio 6 Flex)、多功能酶標(biāo)儀(TECAN, SPARK10)、超微量紫外可見光分光光度計(Thermo, NanoDrop One)、多功能成像系統(tǒng)(Bio-rad, Doc XRS+)及微孔板全自動洗板機(jī)(BioTek, 50TS)等。

1.2 實驗方法

樣品采集與總RNA提取將中華絨螯蟹置于冰中麻醉, 用含有預(yù)冷抗凝劑(0.14 mol/L氯化鈉、0.1 mol/L葡萄糖、30 mmol/L檸檬酸三鈉、26 mmol/L 檸檬酸、10 mmol/L EDTA; pH 4.6)的無菌注射器從螯足基部抽取血淋巴, 在4℃時850×g離心15min收集血細(xì)胞, 隨后加入細(xì)胞裂解液吹打均勻, 進(jìn)行總RNA提取。取血后解剖中華絨螯蟹, 采集心臟、肝胰腺、鰓、胃、腸、卵巢、精巢和肌肉組織, PBS(140 mmol/L氯化鈉, 10 mmol/L磷酸二氫鈉; pH 7.4) 洗滌2—3次后, 加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行組織勻漿, 離心后進(jìn)行總RNA提取?？俁NA提取步驟參考RNAiso Plus使用說明進(jìn)行。

cDNA合成將DNase Ⅰ添加到總RNA中以去除樣品中污染的DNA, 瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性, 超微量分光光度計檢測總RNA濃度和純度?？俁NA質(zhì)量符合要求后, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)的使用說明合成cDNA。

甲殼肽基因cDNA克隆通過對實驗室測得的中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析, 獲得2個甲殼肽樣分子, 隨后使用Primer Premier 5.0軟件在基因序列兩端分別設(shè)計擴(kuò)增引物(表1), 通過PCR擴(kuò)增、測序驗證基因序列。以中華絨螯蟹卵巢cDNA為模板, 通過PCR擴(kuò)增目的基因, 反應(yīng)體系參照LATaqTMVersion 2.0 plus dye說明書配制: LATaq酶25 μL, 滅菌水20 μL, 上下游引物各2 μL(10 μmol/L),模板cDNA(200 ng/μL)1 μL。PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3min; 94℃變性30s, 53℃退火30s, 72℃延伸40s, 共35個循環(huán); 最后72℃延伸10min。獲得的目的片段經(jīng)過膠回收試劑盒回收純化后, 連接至pMD19-T載體, 再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi), 送往上海生工測序。

表1 實驗所用引物序列Tab. 1 Sequence of primers used in this study

生物信息學(xué)分析利用軟件Expasy(http://web.expasy.org/translate/)預(yù)測EsCrus3和EsCrus4編碼的氨基酸序列; 軟件BLASTP(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi/)分析EsCrus3和EsCrus4與其他物種甲殼肽蛋白的相似性。多重序列比對由DNAMAN軟件和GeneDoc軟件生成。蛋白理論分子量(MW)和等電點(pI)基于在線軟件Expasy(http://web.expasy.org/compute_pi/)計算。在線軟件Signal IP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)用于預(yù)測蛋白信號肽[21]。MEGA 11軟件用于分析不同類型甲殼肽間的進(jìn)化關(guān)系。

甲殼肽基因組織分布分析以合成的中華絨螯蟹不同組織cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。20 μL反應(yīng)體系參照試劑盒(TB Green?Premix ExTaqTMⅡ)說明書配制: TB Green Ⅱ 10 μL、ROX參比染料0.4 μL、上下游引物各0.8 μL (10 μmol/L)、無菌水6 μL、cDNA模板2 μL; 甲殼肽基因定量引物與內(nèi)參引物見表1。qRT-PCR程序設(shè)置如下:95℃ 3min; 95℃ 10s, 60℃ 40s, 40個循環(huán); 60—95℃熔解曲線分析。所有實驗均使用單獨的模板并設(shè)置3次重復(fù)。利用公式2-?Ct分析EsCrus3和EsCrus4在不同組織的相對表達(dá)水平。

病原刺激后甲殼肽基因表達(dá)模式分析為分析EsCrus3和EsCrus4是否響應(yīng)病原菌刺激, 本研究首先通過注射病原菌的方式感染中華絨螯蟹, 隨后通過qRT-PCR分析它們的表達(dá)模式, 實驗期間停止喂食。實驗組分別注射200 μL的金黃色葡萄球菌 [2×108CFU(Colony-Forming Units)]或200 μL嗜水氣單胞菌(2×107CFU), 對照組注射相同體積的PBS。在細(xì)菌注射后0、2h、6h、12h、24h及48h,每組的每個時間點分別隨機(jī)挑選3只蟹, 取卵巢組織提取總RNA, 反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測, 通過公式2-ΔΔCt分析[22]EsCrus3和EsCrus4在不同細(xì)菌刺激后的表達(dá)模式。

甲殼肽原核重組表達(dá)根據(jù)EsCrus3和Es-Crus4序列, 設(shè)計含有特定酶切位點(BamH Ⅰ和Hind Ⅲ)的表達(dá)引物(表1), 隨后通過PCR擴(kuò)增目的片段, 目的片段酶切后與表達(dá)載體pET-32a連接; 將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌(DE3)感受態(tài)細(xì)胞, 獲取表達(dá)菌株。陽性菌株培養(yǎng)至對數(shù)期時加入0.5 mmol/L的IPTG, 28℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)12h, 菌液離心后收集菌體, 加入PBS重懸菌體并進(jìn)行超聲破碎。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析蛋白表達(dá)情況, 隨后利用Ni-NTA His Bind Resin純化蛋白, 蛋白溶度通過Bradford法測定。

微生物結(jié)合活性檢測微生物結(jié)合實驗用于評價EsCrus3和EsCrus4與不同類型微生物的結(jié)合活性, 實驗步驟參照Zhu等[23]報道的方法。重組蛋白(150 μg/mL)分別與實驗材料中的9種微生物(2×108CFU)于28℃振蕩孵育1h。離心后用TBS(50 mmol/L Tris-HCl和150 mmol/L氯化鈉; pH 7.5)洗滌沉淀3次, 并取最后1次洗滌液(Wash)制樣。隨后菌體中加入200 μL 7% SDS溫和振蕩10min,離心收集洗脫液(Elution)制樣。菌體沉淀(Pellet)經(jīng)TBS洗滌3次后制樣。重組蛋白EsCrus3和EsCrus4作為陽性對照, 通過Western Blot檢測蛋白與微生物結(jié)合情況。依據(jù)洗滌液、洗脫液或沉淀中是否存在目的蛋白, 判斷蛋白與微生物的結(jié)合活性。

微生物多糖結(jié)合實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay, ELISA)用于評價EsCrus3和EsCrus4與5種不同來源的微生物多糖的結(jié)合活性。ELISA操作過程參照文獻(xiàn)[24]中方法。取100 μL多糖懸液(20 μg/mL)至96孔板中進(jìn)行包被, 陰性對照孔中加入等體積TBS。包被結(jié)束后加入200 μL BSA(5 mg/mL)于37℃封閉2h, 隨后加入TBST(0.05% Tween 20)洗滌4次。取100 μL梯度稀釋后的0—1 μmol/L重組蛋白EsCrus3、Es-Crus4或Trx (標(biāo)簽蛋白, 陰性對照), 分別加入洗滌后的96孔板中, 室溫孵育3h, TBST洗滌4次。每孔中加入100 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的His標(biāo)簽抗體(1﹕5000稀釋), 于37℃孵育2h, TBST洗滌4次。加入100 μL現(xiàn)配的0.01% TMB發(fā)色液, 發(fā)色至顏色不再明顯變化, 加入50 μL H2SO4(2 mol/L)終止反應(yīng), 在450 nm波長處測定吸光度。所有實驗操作重復(fù)3次,每次實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

液體抑菌實驗通過液體抑菌實驗評價Es-Crus3和EsCrus4抑菌活性, 具體操作參照文獻(xiàn)[25]所述方法。分別向96孔板中加入50 μL TBS梯度稀釋(0—1 μmol/L)的重組蛋白EsCrus3、EsCrus4或Trx, 再分別加入50 μL PB培養(yǎng)基(1% 胰蛋白胨,0.5% 氯化鈉; pH 7.5)稀釋的實驗材料中所述的9種微生物(1×105CFU)。置于28℃孵育16h, 而后在600 nm波長處測定吸光度, 檢測抑菌活性。本實驗最小生長抑制濃度定義為與陰性對照相比獲得顯著生長抑制的最低蛋白質(zhì)濃度。所有實驗重復(fù)3次, 每次實驗設(shè)置3個復(fù)孔。

2 結(jié)果

2.1 兩個甲殼肽的序列特征

從中華絨螯蟹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得的2條甲殼肽樣基因序列, 分別命名為EsCrus3和EsCrus4。經(jīng)基因克隆、測序后, 確認(rèn)EsCrus3全長567 bp, 開放閱讀框(Open Reading Frame, ORF)為351 bp, 編碼116個氨基酸(Amino acid, aa), 包含N端信號肽21個aa, C端WAP結(jié)構(gòu)域50個aa(圖1A), 成熟肽的理論等電點為5.69, 理論分子量為10.63 kD;EsCrus4全長743 bp, ORF為288 bp, 編碼95個aa, 包含N端信號肽20個aa, C端WAP結(jié)構(gòu)域50個aa (圖1B), 成熟肽的理論等電點為8.46, 理論分子量為8.19 kD; 兩個編碼蛋白都含有12個保守的半胱氨酸殘基, 8個位于WAP結(jié)構(gòu)域內(nèi), 4個位于信號肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間, 形成1個富含半胱氨酸殘基的結(jié)構(gòu)域(Cysteinerich region, CRR), 根據(jù)當(dāng)前甲殼肽分子的分類標(biāo)準(zhǔn)[6],EsCrus3和EsCrus4都屬于典型的Ⅰ型甲殼肽。

圖1 EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的cDNA及其編碼的氨基酸序列Fig. 1 cDNA and translated amino acid sequences of EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

2.2 相似性與系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

BLASTP分析結(jié)果顯示,EsCrus3與紫螯青蟹(Scylla tranquebarica)StCrus(AFI56572)的一致性為68.89%, 與岸蟹(Carcinus maenas)CmCrus(CAH25399)的一致性為68.24%, 與鋸緣青蟹(Scylla serrata)Ss-Crus(ADW11096)的一致性為66.67%, 與三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCrus(ACM89167)的一致性為58.88%;EsCrus4與三疣梭子蟹PtCrus2(AFU 61578)的一致性為47.30%, 與擬穴青蟹SpCrus4(AUV 47161)和SpCrus3(AUV47160)的一致性分別為44.68%和43.01%。同源比較顯示,EsCrus3和Es-Crus4與早期報道的EsCrus1和EsCrus2一致性為37.40%, 除半胱氨酸等少量氨基酸非常保守外, 其余氨基酸保守性很低(圖2)。此外,EsCrus3和Es-Crus4的一致性也僅有30.77%。

圖2 中華絨螯蟹中的四個甲殼肽的序列比對Fig. 2 The alignment of the four Crustin in the mitten crab

根據(jù)BLASTP搜索結(jié)果和已報道的甲殼動物含WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白, 構(gòu)建了甲殼類WAP蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。膜翅目昆蟲甲殼肽在文獻(xiàn)中常被歸為單獨類型[7], 本進(jìn)化樹未將此類分子列入分析。在構(gòu)建的進(jìn)化樹中, 含有WAP結(jié)構(gòu)域的蛋白被分為4組:Ⅰ組(Ⅰ型甲殼肽)、Ⅱ組(Ⅱ型甲殼肽)、Ⅲ組(Ⅲ型甲殼肽或SWD)和Ⅳ組(Ⅳ型甲殼肽或DWD)(圖3)。其中, Ⅰ組甲殼肽包含2個獨立的分支,EsCrus3和EsCrus4分別屬于兩個不同的分支。考慮到這兩個分支的節(jié)點值均大于90, 表明這兩個分支都是具有分類意義的簇。雖然EsCrus3和EsCrus4均屬于Ⅰ型甲殼肽, 但兩者不在同一分類簇, 進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn), 提示EsCrus3和EsCrus4可能具有不同的生物學(xué)功能。

圖3 EsCrus3、EsCrus4及其他甲殼動物Crustin的系統(tǒng)分析Fig. 3 Phylogenetic analysis of EsCrus3, EsCrus4 and other representative crustacean crustin

2.3 組織分布與表達(dá)模式

采用qRT-PCR方法分析了EsCrus3和EsCrus4的組織分布特征, 實驗結(jié)果顯示兩者均在卵巢中高度表達(dá)(圖4)?？紤]到兩者都是以β-actin作為內(nèi)參基因分析相對表達(dá)水平, 通過比較可知, 這兩個基因在卵巢中的表達(dá)水平接近。除在卵巢中高度表達(dá)外,EsCrus3在心、精巢和肌肉中低水平表達(dá), 而EsCrus4也在心、鰓和腸組織中低水平表達(dá)。

圖4 EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的組織分布Fig. 4 Tissue distribution of EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

用金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌分別刺激中華絨螯蟹后, qRT-PCR分析EsCrus3和EsCrus4在卵巢中的表達(dá)模式。結(jié)果顯示, 兩個基因都能在特定時間段響應(yīng)這兩種不同細(xì)菌的免疫刺激。Es-Crus3在2種不同細(xì)菌刺激后2h顯著表達(dá)(P＜0.05),而后逐漸回落至正常水平(圖5A和5B);EsCrus4在金黃色葡萄球菌刺激后12h時顯著表達(dá)(P＜0.05; 圖5C),在嗜水氣單胞菌刺激后24h時顯著表達(dá)(P＜0.05;圖5D), 推測EsCrus3和EsCrus4在抗菌過程中發(fā)揮不同的作用。EsCrus3響應(yīng)病原刺激更迅速, 發(fā)揮抗菌作用更早, 而EsCrus4很可能在細(xì)菌感染后期參與免疫反應(yīng)。

2.4 重組甲殼肽蛋白的制備

為進(jìn)一步探究EsCrus3和EsCrus4的生物學(xué)功能, 本研究通過原核表達(dá)體系表達(dá)了EsCrus3和Es-Crus4成熟肽序列, 隨后經(jīng)鎳柱純化獲得目的蛋白。SDS-PAGE電泳分析顯示, 在純化的重組蛋白EsCrus3和EsCrus4泳道中都存在1個特異的電泳條帶, 位置介于30—35 kD(圖6)。鑒于pET-32a載體本身含有1個Trx標(biāo)簽(-16 kD), 2個蛋白條帶位置與預(yù)期融合蛋白的大小基本相符, 表明觀察到的蛋白條帶為預(yù)期的重組蛋白EsCrus3和EsCrus4。

圖6 重組蛋白EsCrus3 (A) 和EsCrus4 (B) 的 SDS-PAGE電泳圖Fig. 6 SDS-PAGE analysis of recombinant EsCrus3 (A) and EsCrus4 (B)

2.5 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4的微生物結(jié)合活性

根據(jù)文獻(xiàn)對微生物結(jié)合實驗中結(jié)合活性的定義[9], 可被SDS溶液洗脫但不能被TBS洗脫的蛋白,具有弱結(jié)合活性; 與菌體結(jié)合而不能被SDS洗脫的蛋白, 具有強結(jié)合活性。實驗結(jié)果顯示重組蛋白EsCrus3和EsCrus4主要存在于SDS洗脫液中, 且發(fā)色條帶深淺不一, 而TBS洗滌液(陰性對照) 和菌體沉淀樣品中除陽性對照外均無目的蛋白條帶(圖7),表明兩種重組蛋白對9種微生物均屬弱結(jié)合, 并且結(jié)合力大小也存在差異。實驗結(jié)果提示, 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4與9種不同的微生物均具有一定的結(jié)合活性。

圖7 EsCrus3 (A) 和 EsCrus4 (B) 對不同微生物的結(jié)合活性Fig. 7 Binding activities of recombinant EsCrus3 (A) and EsCrus4(B) to different microorganisms

2.6 重組蛋白的微生物多糖結(jié)合活性

ELISA實驗結(jié)果顯示,EsCrus3對PGN、LTA、LPS和β-葡聚糖都具有結(jié)合活性。其中,EsCrus3對PGN和LTA的結(jié)合活性較強(圖8A, 8B和8C), 對LPS和β-葡聚糖的結(jié)合活性較弱 (圖8D和8E);Es-Crus4僅對PGN具有結(jié)合活性 (圖8A和8B)。實驗結(jié)果表明EsCrus3對多糖的結(jié)合活性總體強于Es-Crus4。研究結(jié)果進(jìn)一步揭示了EsCrus3和EsCrus4與不同微生物具有結(jié)合活性, 很可能源于它們與不同來源微生物多糖的特異性結(jié)合。

圖8 EsCrus3和 EsCrus4 對不同微生物多糖的結(jié)合活性Fig. 8 Microbial polysaccharide-binding activity is shown by EsCrus3 or EsCrus4

2.7 重組蛋白液體抑菌實驗結(jié)果

液體抑菌實驗結(jié)果顯示, 重組蛋白EsCrus3和EsCrus4在蛋白濃度范圍為0—1 μmol/L條件下, 對9種待檢測的微生物均未表現(xiàn)出抑制活性, 表明Es-Crus3和EsCrus4不具有抑制微生物生長的能力。但該實驗結(jié)果并不排除該蛋白在更高濃度下呈現(xiàn)抑菌效果, 文獻(xiàn)報道顯示甲殼肽通常抑制微生物能力較弱[9,26]。

3 討論

文獻(xiàn)報道顯示, 甲殼肽主要表達(dá)于血細(xì)胞、鰓和胃等免疫相關(guān)組織[9,10,27,28]。本研究從中華絨螯蟹的生殖器官卵巢組織中鑒定了兩個甲殼肽同源分子。它們響應(yīng)金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌的免疫刺激, 并且對多種病原微生物及多糖具有不同程度的結(jié)合活性, 提示這兩種甲殼肽在中華絨螯蟹卵巢免疫防御中發(fā)揮重要作用。

根據(jù)Tassanakajon等[6]提出的分類標(biāo)準(zhǔn), 可以將甲殼肽分為5種主要類型, 不同類型甲殼肽的區(qū)分主要依據(jù)信號肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間序列差異。在Ⅰ型甲殼肽中, 信號肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間僅存在1個CRR結(jié)構(gòu)域; Ⅱ型甲殼肽在此區(qū)域有1個甘氨酸富集區(qū)(Glycine-rich region, GRR)和1個CRR結(jié)構(gòu)域;Ⅲ型甲殼肽在此區(qū)域則只有1個簡短的富含脯氨酸和精氨酸的結(jié)構(gòu)域[4]; Ⅳ型甲殼肽無此區(qū)域, 但該類分子含有兩個WAP結(jié)構(gòu)域[28]; Ⅴ型甲殼肽除CRR結(jié)構(gòu)域外, 還包含1個芳香族氨基酸富集區(qū)。中華絨螯蟹早期的研究已鑒定4個甲殼肽分子, 其中Es-Crus1和EsCrus2屬于Ⅱ型甲殼肽[14,15], 另外2個Ⅳ型甲殼肽被命名為Es-DWD和Es-DWD1[16,17]。本研究從中華絨螯蟹中鑒定了2個新型甲殼肽, 沿用一般命名規(guī)則, 將其分別命名為EsCrus3和EsCrus4,這兩個甲殼肽均具有WAP結(jié)構(gòu)域, 并且在信號肽和WAP結(jié)構(gòu)域之間含1個由4個半胱氨酸形成的CRR結(jié)構(gòu)域; 進(jìn)化分析顯示這兩個新型抗菌肽與其他Ⅰ型甲殼肽具有更近的進(jìn)化關(guān)系(圖3), 這些結(jié)果表明EsCrus3和EsCrus4屬于典型的Ⅰ型甲殼肽?？紤]到EsCrus3和EsCrus4相似性較低, 并且進(jìn)化分析顯示兩者分別位于兩個不同的分支上, 提示兩者很可能具有不同的生物學(xué)功能。

中華絨螯蟹EsCrus1和EsCrus2均高表達(dá)于血細(xì)胞中, 并且它們對革蘭氏陽性細(xì)菌具有顯著的殺滅能力[14,15]。中華絨螯蟹作為一種節(jié)肢動物, 其免疫系統(tǒng)與模式動物果蠅具有很高的相似性, 半開放的體液循環(huán)體系確保了血淋巴可以覆蓋其機(jī)體實質(zhì)組織器官之外的所有部位。EsCrus1和EsCrus2具有信號肽, 提示它們屬于分泌性抗菌肽, 在中華絨螯蟹體液免疫中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)2個在卵巢組織中高度表達(dá)的甲殼肽分子, 它們有著相近的表達(dá)水平, 但兩個分子所發(fā)揮的功能可能存在較大差異。金黃色葡萄球菌[29]和嗜水氣單胞菌[30]分別為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常見的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性病原菌, 在病原刺激后,EsCrus3響應(yīng)迅速, 在刺激后2h時顯著上調(diào)表達(dá), 而EsCrus4則在病原刺激后12—24h時才顯著上調(diào)表達(dá); 此外,EsCrus3結(jié)合微生物多糖的活性顯著高于EsCrus4, 推測EsCrus3的抗菌活性很可能要高于EsCrus4, 表明EsCrus3在病原微生物感染時發(fā)揮更加重要的作用。由此, 我們推測, 除了免疫組織細(xì)胞分泌的免疫組分提供宿主免疫保護(hù)外, 非典型免疫組織如卵巢, 也可分泌抗菌肽等免疫組分, 在宿主免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用, 表明中華絨螯蟹體內(nèi)的多種不同來源的甲殼肽很可能存在協(xié)同抗微生物感染作用, 維持機(jī)體健康。

早期研究顯示Ⅰ型甲殼肽對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出抗菌活性。例如, 從岸蟹血細(xì)胞中分離的第一個甲殼動物甲殼肽, 只對革蘭氏陽性菌具有抑菌活性[27]; 擬穴青蟹中首個甲殼肽 (SpCrus) 可以抑制革蘭氏陽性菌, 但不能抑制革蘭氏陰性菌[8]。后來的研究顯示, 部分Ⅰ型甲殼肽也具有微弱的抗革蘭氏陰性菌活性。例如, 蜘蛛蟹 (Hyas araneus) 的HaCru1和HaCru2除對革蘭氏陽性菌表現(xiàn)出活性外, 對革蘭氏陰性菌和酵母菌也具有較低抑制活性[31]?；谏鲜鰣蟮牢覀兺茰y,EsCrus3和EsCrus4作為典型的Ⅰ型甲殼肽, 很可能也具有類似的抑菌譜?？咕目梢酝ㄟ^多種機(jī)制抑制或殺滅病原微生物, 而與病原微生物特異性結(jié)合則是抗菌肽執(zhí)行其抑菌功能的前提條件[32,33], 與病原微生物表面多糖的互作是抗菌肽與病原微生物結(jié)合的重要形式[34], 多糖結(jié)合實驗可說明抗菌肽與微生物結(jié)合的分子機(jī)理。本研究發(fā)現(xiàn)重組蛋白EsCrus3和EsCrus4均具有結(jié)合革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌和真菌的能力, 推測這兩種抗菌肽可能具有廣譜抗菌活性。EsCrus3對多種微生物表面多糖具有特異性結(jié)合能力, 這很可能是其與多種微生物結(jié)合并具有廣譜抗菌潛力的內(nèi)在原因。相比之下,EsCrus4只結(jié)合來自革蘭氏陽性菌的PGN。考慮到EsCrus4能結(jié)合多種微生物, 推測EsCrus4除結(jié)合PGN外很可能還與微生物表面其他組分結(jié)合, 這需要更多實驗來闡明。此外, 我們還發(fā)現(xiàn)EsCrus3和EsCrus4對革蘭氏陽性菌來源的多糖結(jié)合活性更強, 這很可能是兩者對革蘭氏陽性菌抑制活性更強的內(nèi)在原因, 也解釋了大多數(shù)Ⅰ型甲殼肽可抑制革蘭氏陽性菌的內(nèi)在分子機(jī)制。

盡管EsCrus3和EsCrus4都具有結(jié)合微生物的能力, 但在本研究中兩者預(yù)期的抑菌活性卻未獲得驗證, 這可能是因為這兩個重組蛋白是通過原核表達(dá)獲得, 重組蛋白本身并未能獲得正確的三維結(jié)構(gòu),從而影響了抗菌肽的活性。此外, 據(jù)報道, 甲殼肽抗菌活性相對較弱[9,26], 本研究使用的最高蛋白濃度也僅為1 μmol/L, 很可能未達(dá)到抑菌活性的下限。因此, 要探明這兩種蛋白的抑菌性, 還需要借助其他實驗手段, 比如利用真核表達(dá)系統(tǒng)制備相應(yīng)的重組蛋白, 來探明其真實的抑菌活性。

總之, 本研究從中華絨螯蟹卵巢中鑒定了2個Ⅰ型甲殼肽基因, 它們均響應(yīng)細(xì)菌的免疫刺激, 并且它們的重組蛋白均具有廣譜的微生物結(jié)合活性。但相比之下EsCrus3響應(yīng)病原刺激更迅速、與病原多糖結(jié)合能力更強, 表明EsCrus3在卵巢的免疫防御體系中發(fā)揮更重要的作用。本研究進(jìn)一步豐富了無脊椎動物生殖系統(tǒng)免疫防御體系的理論,EsCrus3和EsCrus4序列和功能的差異為新型藥物的挖掘提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。