王智威 邸松蕊 黃鵬力 謝辰雨 王一帆 張建軍 朱映黎

機(jī)體狀態(tài)是中藥藥性生物效應(yīng)表達(dá)的載體,機(jī)體狀態(tài)不同,中藥藥性作用于機(jī)體的生物學(xué)效應(yīng)亦不同[1]。神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫(neural-endocrine-immune system ,NEI)網(wǎng)絡(luò)將神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫三大系統(tǒng)相互間的作用作為整體進(jìn)行研究,以神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細(xì)胞因子等全面系統(tǒng)調(diào)控人體功能。研究表明,機(jī)體狀態(tài)不同,NEI相關(guān)指標(biāo)亦有不同[2-8]。由此表明,NEI網(wǎng)絡(luò)對(duì)中藥基于不同機(jī)體狀態(tài)的生物學(xué)效應(yīng)表達(dá)發(fā)揮著重要作用。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activiated protein kinase,AMPK)被稱為細(xì)胞的“能量感受器”[9],通過(guò)調(diào)節(jié)下游基因靶點(diǎn)[10]脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)[11-12];通過(guò)調(diào)控下游靶點(diǎn)[13]6-磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-biphosphatase 3,PFKFB3)產(chǎn)生細(xì)胞因子調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能[14-16];調(diào)節(jié)下游靶點(diǎn)固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c (sterol regulatory element binding protein-1c,SREBP-1c)[10],而SREBP-1c又能夠進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl coenzyme A desaturase 1,SCD1)基因表達(dá)[17],影響內(nèi)分泌系統(tǒng)功能[18];除此之外,還可以調(diào)節(jié)上游靶點(diǎn)[19]胰島素受體底物2(insulin receptor substrate,IRS2)影響物質(zhì)代謝,在神經(jīng)、內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮一定調(diào)控作用[20-22]。因此,AMPK信號(hào)通路可通過(guò)作用于IRS2、FASN、PFKFB3、SCD1基因靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體NEI網(wǎng)絡(luò),是連接NEI網(wǎng)絡(luò)的主要信號(hào)通路之一。

附子為毛茛科烏頭屬中藥,辛、甘,大熱,可回陽(yáng)救逆,補(bǔ)火助陽(yáng),散寒止痛,為“回陽(yáng)救逆第一要藥”,臨床常用于治療風(fēng)寒濕痹疼痛[23]。研究表明,辛熱中藥附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)會(huì)引起NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)生物效應(yīng)不同的改變,但基于AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)機(jī)制研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本研究以NEI網(wǎng)絡(luò)為切入點(diǎn),對(duì)辛熱中藥附子通過(guò)AMPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2基因作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)小鼠的生物學(xué)效應(yīng)表達(dá)機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性KM小鼠84只,體質(zhì)量(20±2)g,購(gòu)自維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2021-0011],飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物房室溫為22～26℃,相對(duì)濕度60%～70%,光照周期12小時(shí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物、試劑與儀器

受試藥由中藥飲片煎煮濃縮制備:附子(四川同創(chuàng)康能藥業(yè)有限公司,批號(hào):200701),取500 g附子,10倍量水浸泡1小時(shí),分兩次煎煮,每次1.5小時(shí),濃縮后放于4℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

氫化可的松琥珀酸鈉(常州四藥制藥有限公司,批號(hào):20210811D1);醋酸地塞米松片(上海上藥信誼藥廠有限公司,批號(hào):501210402)。環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)試劑盒(批號(hào):L211201973)、環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cyclic guanosine monophosphatec,cGMP)試劑盒(批號(hào):L211228447),以上試劑盒由北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司提供。去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)試劑盒(批號(hào):E20220720-20570A)、多巴胺(dopamine,DA)試劑盒(批號(hào):E20220720-20273A)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)試劑盒(批號(hào):E20220720-24791A)、三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine,T3)試劑盒(批號(hào):E20220720-20591A)、甲狀腺素(thyroxine,T4)試劑盒(批號(hào):E20220720-20401A)、補(bǔ)體C3(complement 3,C3)試劑盒(批號(hào):E20220720-20210A)、補(bǔ)體C4試劑盒(批號(hào):E20220720-20211A)、免疫球蛋白G(immunoglobin G,IgG)試劑盒(批號(hào):E20220720-20509A)、免疫球蛋白M(immunoglobin M,IgM)試劑盒(批號(hào):E20220720-20513A),以上檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。RNA提取液(貨號(hào):G3013),購(gòu)自Servicebio。

電子天平(型號(hào):PL-203),梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;酶標(biāo)分析儀(型號(hào):DR-200BS),無(wú)錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司;臺(tái)式離心機(jī)(型號(hào):TGL-16c),上海安亭科學(xué)儀器廠;冷凍離心機(jī)(型號(hào):neofuge15R),HealForce;全自動(dòng)生化分析儀(型號(hào):Chemray-240),深圳雷杜生命科技;研磨儀(貨號(hào):KZ-Ⅲ-FP),Servicebio;臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī)(貨號(hào):D3024R),DragonLab;熒光定量PCR儀(貨號(hào):CFX),Bio-rad。

1.3 分組與給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后,84只小鼠按體質(zhì)量進(jìn)行編號(hào),再按照隨機(jī)數(shù)字表法分為7組,每組12只,分別為:空白組、虛熱模型組、虛寒模型組、虛熱附子低劑量組、虛熱附子高劑量組、虛寒附子低劑量組、虛寒附子高劑量組。每日上午(7:00)進(jìn)行灌胃,虛熱、虛寒附子低劑量組給予附子生藥量10 g/kg,虛熱、虛寒附子高劑量組給予附子生藥量20 g/kg,灌胃劑量為1.2 mL/100 g;空白組、虛熱模型組和虛寒模型組于灌胃等劑量蒸餾水,連續(xù)給藥14天。

1.4 造模方法

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 天后,每日下午(16:00)空白組給予等量蒸餾水,虛熱組小鼠灌胃醋酸地塞米松(0.35 mg/kg)、虛寒組小鼠灌胃氫化可的松琥珀酸鈉(35 mg/kg),制備虛熱、虛寒模型,根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整灌胃劑量,連續(xù)造模14天;模型表現(xiàn)同文獻(xiàn)一致[24-26],表示造模成功。

1.5 取材方法

實(shí)驗(yàn)第15天,采用摘眼球取血,室溫靜置2小時(shí),在4℃條件下以3000 r/min離心15分鐘后取上層血清,留存用于血清指標(biāo)的檢測(cè)。冰上取小鼠腎臟稱重后快速放于液氮中,后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存,用于指標(biāo)檢測(cè)。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 一般觀察 實(shí)驗(yàn)期間記錄各組小鼠造模給藥后毛發(fā)、精神活動(dòng)狀態(tài)以及每3天小鼠體質(zhì)量的變化。

1.6.2 檢測(cè)血清cAMP、cGMP指標(biāo) 采用酶聯(lián)免疫吸附法,按照ELISA 試劑盒步驟操作進(jìn)行,完成后置于酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算,檢測(cè)cAMP、cGMP水平。

1.6.3 血清中神經(jīng)遞質(zhì)NE、DA、5-HT檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中去甲腎上腺素NE、DA、5-HT含量水平,完成后置于酶標(biāo)儀測(cè)定吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算出。

1.6.4 血清T3、T4檢測(cè) 根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中內(nèi)分泌物質(zhì)T3、T4含量水平。

1.6.5 血清C3、C4、IgG、IgM檢測(cè) 采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中C3、C4、IgG、IgM含量水平,具體操作步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.6.6 檢測(cè)心臟組織FASN、SCD1、IRS2、PFKFB3的mRNA表達(dá) 利用反轉(zhuǎn)錄—熒光定量PCR法(reverse transcript quantitative PCR,RT-qPCR)測(cè)定四種基因mRNA表達(dá)。具體引物序列見(jiàn)表1。反應(yīng)體系包含1.0 μL cDNA、10 μmol/L引物0.3 μL,Premix Taq 5 μL,EvaGreen 0.5 μL,加ddH2O補(bǔ)充至10 μL,95℃ 5分鐘預(yù)變性后,95℃10秒→60℃30秒,40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt分析相對(duì)基因表達(dá)差異。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠一般狀況及體質(zhì)量的影響

與空白組比較,虛熱模型組小鼠出現(xiàn)毛發(fā)偏黃、大便秘結(jié)、小便黃、暴躁易怒等現(xiàn)象,虛寒模型組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、被毛無(wú)光澤、活動(dòng)減少、抱團(tuán)等現(xiàn)象。與虛熱模型組比較,附子組小鼠癥狀加重;與虛寒模型組比較,附子組小鼠精神狀態(tài)有很大程度改善。

與空白組比較,虛熱模型組和虛寒模型組小鼠體質(zhì)量在第7天均開(kāi)始顯著降低(P<0.01,P<0.05);與虛熱模型組比較,虛熱附子低劑量組小鼠體質(zhì)量在第14天顯著升高(P<0.05),而虛熱附子高劑量組小鼠體質(zhì)量未有改善,變化趨勢(shì)與虛熱模型組相似;與虛寒模型組比較,虛寒附子高劑量組體質(zhì)量在第14天顯著升高(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠的影響小鼠體質(zhì)量的影響

2.2 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠血清環(huán)核苷酸水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組cAMP、cAMP/cGMP含量顯著升高(P<0.05,P<0.01),虛寒模型組cAMP、cAMP/cGMP含量顯著降低(P<0.01),而cGMP含量顯著升高(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組對(duì)cAMP、cGMP、cAMP/cGMP有一定的調(diào)整作用,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛熱附子高劑量組cGMP含量顯著降低(P<0.01),而cAMP、cAMP/cGMP含量顯著升高(P<0.01)。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠血清環(huán)核苷酸水平的影響

2.3 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與空白組比較,虛熱模型組NE、DA含量顯著升高(P<0.01),5-HT含量顯著降低(P<0.01),而虛寒模型組NE、DA、5-HT含量均顯著降低(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組對(duì)NE、DA、5-HT有一定的調(diào)整作用,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛熱附子高劑量組NE、DA、5-HT含量顯著升高(P<0.01),附子低劑量組NE、DA、5-HT含量有升高趨勢(shì),但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠神經(jīng)遞質(zhì)的影響

2.4 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠內(nèi)分泌水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組T3、T4含量顯著升高(P<0.01),而虛寒模型組T3、T4含量顯著降低(P<0.01)。

與虛熱模型組比較,虛熱附子低、高劑量組T3含量顯著降低(P<0.01),虛熱附子低、高劑量組T4含量有降低趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛寒附子低、高劑量T3含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子高劑量組T4含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子低劑量組T4含量有升高趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠內(nèi)分泌的影響

2.5 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體小鼠免疫水平的影響

與空白組比較,虛熱模型組C3、C4、IgG、IgM含量顯著升高(P<0.01),虛寒模型組C3、C4、IgG、IgM含量顯著降低(P<0.01);與虛熱模型組比較,虛熱附子低劑量組C3含量顯著降低(P<0.05),虛熱附子低、高劑量組C4、IgG、IgM有降低趨勢(shì),差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與虛寒模型組比較,虛寒附子低劑量組IgG、IgM含量顯著升高(P<0.01),虛寒附子高劑量組C3、C4、IgG、IgM含量均顯著升高(P<0.01),虛寒附子低劑量組C3、C4含量有降低趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠免疫因子的影響

2.6 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體小鼠FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2基因mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較,虛熱模型組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01,P<0.01,P<0.05,P<0.05),虛寒模型組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.05);

與虛寒、虛熱模型組比較,虛寒附子高劑量組FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01,P<0.05,P<0.01,P<0.01),虛熱附子高劑量組IRS2的mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.01),而FASN、PFKFB3、SCD1的mRNA表達(dá)有降低趨勢(shì),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 附子對(duì)虛熱、虛寒機(jī)體狀態(tài)小鼠Fasn、PFKFB3、SCD1、IRS2基因mRNA表達(dá)的影響

3 討論

機(jī)體狀態(tài)是中藥藥性生物學(xué)效應(yīng)表達(dá)的載體,對(duì)藥物體內(nèi)代謝生態(tài)環(huán)境具有重要作用,寒熱機(jī)體狀態(tài)不同亦會(huì)使同一中藥的生物效應(yīng)表達(dá)也不同[1]。NEI網(wǎng)絡(luò)對(duì)于中藥基于不同機(jī)體狀態(tài)的生物學(xué)效應(yīng)表達(dá)發(fā)揮著重要作用。研究表明,AMPK信號(hào)通路是連接NEI網(wǎng)絡(luò)的主要信號(hào)通路之一。因此,本文對(duì)辛熱藥附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)后NEI網(wǎng)絡(luò)生物效應(yīng)不同進(jìn)行了探察,并通過(guò)AMPK信號(hào)通路FASN/PFKFB3/SCD1/IRS2基因靶點(diǎn)對(duì)其不同生物學(xué)效應(yīng)表達(dá)機(jī)制進(jìn)行了深入研究。

現(xiàn)代研究表明,機(jī)體寒熱狀態(tài)的產(chǎn)生與神經(jīng)[2-4]、內(nèi)分泌[5-6]、免疫[7-8]、環(huán)核苷酸水平[27]狀態(tài)的異常息息相關(guān)。環(huán)核苷酸系統(tǒng)cAMP和cGMP作為細(xì)胞間信息傳導(dǎo)的第二信使,與物質(zhì)代謝中密切相關(guān),在維持機(jī)體神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)的平衡中起重要作用[28]。寒熱不同機(jī)體狀態(tài)中環(huán)核苷酸的表達(dá)有明顯的差異,虛熱時(shí),cAMP,cAMP/cGMP升高,虛寒時(shí),cAMP、cAMP/cGMP降低[29],為中醫(yī)微觀辨證之一[30]。結(jié)果顯示,地塞米松組小鼠癥狀基本符合陰虛(虛熱)表觀診斷指標(biāo);氫化可的松組小鼠癥狀基本符合陽(yáng)虛(虛寒)表觀診斷指標(biāo)。辛熱中藥附子干預(yù)虛寒、虛熱小鼠后,虛寒小鼠cAMP,cAMP/cGMP含量升高,體質(zhì)量能夠增長(zhǎng)至正常水平,狀態(tài)恢復(fù);而虛熱小鼠cAMP,cAMP/cGMP仍處于高水平體質(zhì)量則出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng),精神狀態(tài)未得到改善。因此表明,附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)時(shí),環(huán)核苷酸差異性表達(dá),且對(duì)于體重與精神狀態(tài)的改變呈相反趨勢(shì)。

同時(shí),機(jī)體狀態(tài)不同,NEI網(wǎng)絡(luò)相關(guān)指標(biāo)亦有不同。研究表明,虛熱狀態(tài)下,交感神經(jīng)興奮,NE和DA含量增加、5-HT含量減少[2];而虛寒狀態(tài)下,中樞神經(jīng)系統(tǒng)被抑制, NE和DA含量減少,5-HT含量增加或減少,其減少原因可能與5-HT系統(tǒng)受到損壞有關(guān)[3-4]。而神經(jīng)遞質(zhì)水平的異常,則會(huì)進(jìn)一步影響到內(nèi)分泌與免疫系統(tǒng)。研究表明,虛熱狀態(tài)下,內(nèi)分泌功能亢進(jìn),T3和T4含量增加[5],虛寒狀態(tài)下,T3和T4含量則會(huì)減少[6]。另外,研究發(fā)現(xiàn)虛熱狀態(tài)下,IgG、IgM、補(bǔ)體C3均升高,免疫功能呈現(xiàn)為相對(duì)亢進(jìn)狀態(tài),其機(jī)制可能為陰不制陽(yáng),陽(yáng)氣相對(duì)亢進(jìn),正氣處于“虛”的相對(duì)亢奮狀態(tài)[7];虛寒狀態(tài)時(shí)機(jī)體免疫力低下,降低IgG、IgM、補(bǔ)體C3的合成[8]。本實(shí)驗(yàn)中虛熱模型組小鼠神經(jīng)遞質(zhì)(NE、DA)、內(nèi)分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)的含量均升高,神經(jīng)遞質(zhì)5-HT含量降低;表明虛熱狀態(tài)下小鼠的NEI網(wǎng)絡(luò)異常表現(xiàn)為:中樞神經(jīng)系統(tǒng)亢奮,內(nèi)分泌激素分泌增加,免疫功能亢奮[7]。虛寒模型組小鼠神經(jīng)遞質(zhì)(NE、DA、5-HT)、內(nèi)分泌激素(T3、T4)、免疫因子(C3、C4、IgG、IgM)含量均降低;表明虛寒狀態(tài)下小鼠NEI網(wǎng)絡(luò)異常表現(xiàn)為:中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制,內(nèi)分泌激素分泌減少,免疫功能低下。

附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)小鼠后,低劑量附子能使虛寒小鼠的T3、IgG、IgM水平得到恢復(fù),高劑量附子能使糾正虛寒證小鼠神經(jīng)遞質(zhì)水平低下、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫功能的紊亂;而虛熱證小鼠經(jīng)附子干預(yù)后,小鼠神經(jīng)遞質(zhì)、內(nèi)分泌因子和免疫因子仍處于異常水平,表明附子在寒熱不同機(jī)體狀態(tài)下對(duì)NEI網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)具有不同的生物學(xué)效應(yīng)。

AMPK信號(hào)通路作為連接NEI網(wǎng)絡(luò)的主要信號(hào)通路之一,能夠通過(guò)FASN、PFKFB3、SCD1、IRS2基因進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究表明FASN能夠影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)[11],以及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)方面[12],且在甲狀腺功能亢進(jìn)(虛熱)狀態(tài)下被誘導(dǎo)上調(diào)[31]。PFKFB3能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的糖酵解通量增加,增強(qiáng)M1型巨噬細(xì)胞的促炎功能,抗原呈遞MHC復(fù)合物高表達(dá),在機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14-16]。另外,SCD1的表達(dá)不僅影響內(nèi)分泌甲狀腺[18],且參與炎癥反應(yīng)[32-33]。也就是說(shuō),AMPK信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)FASN、PFKFB3、SCD1基因靶點(diǎn)參與調(diào)控NEI網(wǎng)絡(luò)的生理功能,本研究結(jié)果顯示,附子能夠顯著抑制虛寒小鼠FASN、PFKFB3、SCD1的mRNA表達(dá),而對(duì)虛熱狀態(tài)小鼠FASN、PFKFB3、SCD1基因表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。表明,附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)下通過(guò)調(diào)控AMPK信號(hào)通路上FASN、PFKFB3、SCD1基因表達(dá)進(jìn)而影響NEI網(wǎng)絡(luò)的生物學(xué)效應(yīng)的不同。

另外,AMPK信號(hào)通路上另一基因靶點(diǎn)IRS2是胰島素發(fā)揮作用的重要基因[34],參與了NEI網(wǎng)絡(luò)內(nèi)分泌甲狀腺的正常生理過(guò)程[20]。除此之外,IRS2還能夠介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)胰島素信號(hào)級(jí)聯(lián)效應(yīng)[21],文獻(xiàn)表明,上調(diào)IRS2能夠?qū)е戮奘杉?xì)胞分泌引起胰島素抵抗的因子,參與神經(jīng)與免疫相互作用的信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,同時(shí)影響細(xì)胞炎癥反應(yīng),在免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用[22]。本研究結(jié)果表明,無(wú)論是虛寒狀態(tài)還是虛熱狀態(tài)下,附子均能顯著抑制IRS2的mRNA表達(dá),這就提示IRS2可能是附子作用于寒熱不同機(jī)體狀態(tài)下發(fā)揮“效—毒”雙向生物效應(yīng)的機(jī)制之一,值得后續(xù)進(jìn)行深入研究。

綜上,依據(jù)“藥性構(gòu)成三要素”假說(shuō),中藥藥性是藥物成分作用于特定的機(jī)體狀態(tài),所發(fā)生的復(fù)雜的、多層次的生物學(xué)正負(fù)效應(yīng)的綜合表達(dá)。本研究基于辛熱藥性的中藥附子作用于不同機(jī)體狀態(tài)機(jī)體后其神經(jīng)—內(nèi)分泌—免疫網(wǎng)絡(luò)生物效應(yīng)表達(dá)的機(jī)制開(kāi)展了研究,發(fā)現(xiàn)AMPK信號(hào)通路上FASN、PFKFB3、SCD1基因位點(diǎn)可能是其“辨證用藥”的關(guān)鍵靶點(diǎn),而IRS2基因可能是附子產(chǎn)生“效—毒”雙向作用的機(jī)制,還需進(jìn)一步研究。