王筱懿，仇 坤，陳 明，彭桂明，賴樹生，蔣騰川，尉小慧，王崢濤

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室（上海 201203）；2.廣西梧州中恒集團股份有限公司（廣西 梧州 543000）；3.廣西中恒創(chuàng)新醫(yī)藥研究有限公司（廣西 南寧 530000）

腸道是人體體腔內(nèi)與外界環(huán)境接觸面最大的器官，容易受到腸道病原體的入侵和破壞，而腸道表面的黏液層是腸道吸收的重要屏障，被稱為腸黏液屏障［1］。腸黏液屏障由黏蛋白、水、無機鹽、免疫分子和促進致病菌清除的抗菌肽等組成［2］。腸黏液的主要結(jié)構(gòu)成分是黏蛋白，這些蛋白由高度糖基化的蛋白主鏈組成，黏液蛋白單元之間的二硫化物橋接形成黏液的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)［3］，使黏液能夠調(diào)節(jié)一些微粒和小分子的擴散。黏液層可捕獲病原體和外來顆粒，并通過不斷分泌黏液使腸道表面保持濕潤和不斷更新，從而減少捕獲的病原體和外來顆粒在腸黏膜表面的停留時間，進而有利于維持腸道環(huán)境穩(wěn)定［4-5］。黏蛋白和水形成的凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)還可為腸上皮細胞分泌的免疫分子提供擴散和穩(wěn)定的場所，以更好地發(fā)揮其抗菌功能［6］。同時，小腸可通過運動將黏液及其中滲透的細菌等物質(zhì)推向遠端［7］。然而，腸黏液的這種屏障功能在起到保護作用的同時，也會阻止藥物在黏膜表面的持續(xù)和靶向輸送［8］。因此，了解黏液的屏障特性、研究藥物在腸黏液層的滲透過程是探討藥物口服吸收機制的必要環(huán)節(jié)。

三七是五加科人參屬植物三七Panaxnotoginseng（Burk.） F.H.Chen 的干燥根及根莖，具有活血化瘀、消腫定痛等功效，臨床應(yīng)用廣泛［9］。其主要活性成分為三七總皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）?！吨腥A人民共和國藥典（2020年版）：一部》［10］規(guī)定用于口服的三七總皂苷提取物中三七皂苷R1（C47H80O18）不得少于5.0%，人參皂苷Rg1（C42H72O14）不得少于25.0%，人參皂苷Rb1（C54H92O23）不得少于30.0%。三七皂苷R1 是三七的代表性成分，而人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1 是三七總皂苷中含量最高的兩個成分，因此選取這3種皂苷成分作為研究對象。

目前臨床常用的三七總皂苷制劑以口服制劑和注射制劑為主［11］，相關(guān)的細胞轉(zhuǎn)運、腸吸收、口服生物利用度等方面的研究較多，但進入體內(nèi)口服吸收的第一道屏障——腸黏液的滲透過程卻鮮有研究報道。體外模型通常具有替代、簡化、精準(zhǔn)等特點［12］，本課題采用前期建立的3 種體外腸黏液滲透模型——純化黏蛋白滲透模型（purified mucin infiltration model，PIM）、人工腸黏液滲透模型（artificial intestinal mucus infiltration model，AIM）及大鼠腸黏液滲透模型（rat intestinal mucus infiltration model，RIM），研究三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的腸黏液滲透作用，進而為三七皂苷的口服吸收機制研究以及口服新制劑的設(shè)計提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 及人參皂苷Rb1 ，購自成都德思特生物技術(shù)有限公司（批號分別為DSTDS005003、DSTDR000902、DSTDR000603）；磷酸，上海拜力生物科技有限公司（批號：20800100）；豬腸胃黏蛋白，上海源葉生物科技有限公司（批號：A11GS157442）；卵磷脂（E-80，濃度≥80%），上海麥克林有限公司（批號：C11134241）；卵磷脂酰膽堿（PC）、卵磷脂乙醇胺（PE）、卵磷脂絲氨酸（PS）、磷脂酰肌醇（PI）、膽固醇（Chol），上海源葉生物科技有限公司（批號分別為579010-150055-13、J21HS185636、J23HS185824、TO7D6-F6559、L29N8F49258）；侵襲實驗（Transwell）小室，美國Corning 公司（批號：33721054）；三氯甲烷、乙腈，國藥集團藥業(yè)股份有限公司（批號分別為20210514、20221209）。

1.2 主要儀器 電子分析天平，瑞士Mettler Toledo 公司（型號：BP211D ）；離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司（型號：SF-TGL-16M ）；超聲清洗儀，昆山市超聲儀器有限公司（型號：KQ-250DB）；磁力攪拌器，德國AKI有限公司（型號：RT10）；高效液相色譜（HPLC）儀，美國安捷倫公司（型號：Agilent 1260 Series）。

2 方法

2.1 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 HPLC分析方法的建立

2.1.1 對照品溶液制備 稱取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 各10 mg，分別加入甲醇10 mL，得到1 g·L-1的單標(biāo)品溶液，制得對照品溶液。

2.1.2 樣品溶液制備 在PIM、AIM、RIM 中，取不同濃度不同時間點的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的接收室溶液各100 μL，10 000 r·min-1離心5 min，0.45 μm濾膜過濾后制得樣品溶液。

2.1.3 色譜條件

（1）三七皂苷R1測定色譜條件。色譜柱：Diamonsil Plus（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：A 為乙腈，B為0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫：0～15 min，17%～27% A；15～18 min，27%～90% A。檢測波長：203 nm；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：10 μL。

（2）人參皂苷Rg1 測定色譜條件。流動相：A 為乙腈，B 為0.1%磷酸水溶液，A∶B=22%∶78%，15 min 等度洗脫；其他同三七皂苷R1測定條件。

（3）人參皂苷Rb1 測定色譜條件。流動相：A 為乙腈，B 為0.1%磷酸水溶液，A∶B=31%∶69%，15 min 等度洗脫；檢測波長：205 nm；其他同三七皂苷R1 測定條件。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1對照品溶液，依次稀釋制成濃度分別為10、40、62.5、125、250、700及1 000 mg·L-1的混合對照品溶液。取10 μL在“2.1.3”項色譜條件下進行HPLC檢測分析，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rg1的線性回歸方程和線性范圍。

2.1.5 方法學(xué)考察

（1）精密度試驗。取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1 對照品溶液，在“2.1.3”項色譜條件下進行HPLC 檢測分析，每次進樣10 μL，連續(xù)進樣6 次，記錄峰面積，計算RSD值。

（2）穩(wěn)定性試驗。取同一樣品溶液在不同時間（0、4、8、12、24、48 h）分別進樣10 μL，進行HPLC 檢測分析，記錄峰面積，計算RSD值。

（3）重復(fù)性試驗。精密吸取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的樣品溶液進行HPLC 檢測分析，平行6次試驗，記錄峰面積，計算RSD值。

（4）加樣回收試驗。精密吸取已知濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1樣品溶液100 μL，分別加入含量為80%、100%、120%的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的對照品溶液，按照樣品溶液處理方法處理后用甲醇定容，在“2.1.3”項色譜條件下進樣分析，計算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的加樣回收率。

2.2 體外腸黏液滲透模型的建立與皂苷類成分表觀滲透系數(shù)（Papp）測定 利用Transwell 小室的擴散原理，以Transwell 小室為主要工具，建立PIM、AIM 和RIM。如圖1 所示，將Transwell 小室分別分為4 個部分：接收室（A）、半透膜（B）、黏液層（C）、供體室（D）。其中3 種模型的主要不同在于黏液層，分別為純化的黏蛋白溶液、人工腸黏液及大鼠原生黏液層。見圖1。

圖1 侵襲實驗滲透系統(tǒng)的示意圖

將Transwell 滲透體系插入一定體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，然后將三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 配制成一定濃度的藥液后，加入供體室，置于黏液層上，在不同時間點收集接收室中的樣品溶液，HPLC進樣檢測并計算Papp。

Papp 的大小反映藥物透過模型的能力以及速度，其計算公式如下：Papp= （dQ/dt）×1/A×1/C0。其中，dQ/dt為接收室在單位時間內(nèi)的累積轉(zhuǎn)運量，A為Transwell的膜表面積，C0為藥物加入供體室的起始濃度。

2.2.1 PIM 的建立及3 種皂苷成分Papp 測定［13］稱取適量的黏蛋白，用pH 7.2 的PBS 溶液配制濃度為20 g·L-1的純化黏蛋白溶液。取空白Transwell小室，加入濃度為20 g·L-1的黏蛋白溶液，使其厚度為3.82 mm，36 ℃孵育5 min制得PIM。

稱取適量的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 至2 mL 容量瓶，用pH 7.2 的PBS 溶液配制成濃度分別為20、10、5 g·L-1的溶液。在PIM 中，分別加入上述不同濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 溶液各100 μL，將模型插入1.5 mL、pH 7.2 的PBS 溶液中，于0.5 h、1 h 取接收室溶液100 μL，再補足相應(yīng)的100 μL 的PBS 溶液至接收室，10 000 r·min-1離心5 min，采用HPLC檢測三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1含量。

2.2.2 AIM的建立及3種皂苷成分Papp測定［14］

（1）脂質(zhì)體1。稱取0.5 g 的E-80 并溶解在10 mL 氯仿和乙醚混合物（體積分?jǐn)?shù)2∶1）中，加入圓底燒瓶中，36 ℃減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，加入25 mL 的PBS 溶液（pH 7.4），緩慢搖晃燒瓶獲得2%（W/V）脂質(zhì)體分散體，通過孔徑為0.25 μm濾膜得到脂質(zhì)體1。

（2）脂質(zhì)體2。稱取 PC（W/W為26.5%）、PE（W/W為26.5%）、PS（W/W為7%）、PI（W/W為7%）、Chol（W/W為33%）共計0.5 g，加入圓底燒瓶中，36 ℃減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，加入25 mL 的PBS 溶液（pH 7.4），緩慢搖晃燒杯獲得2%（W/V）脂質(zhì)體分散體，通過孔徑為0.80 μm濾膜得到脂質(zhì)體2。

取200 μL 脂質(zhì)體1 置于Transwell 小室半透膜上，并以2 300 r·min-1離心5 min，50 ℃加熱45 min，重復(fù)2次。然后繼續(xù)取100 μL 脂質(zhì)體2 加入至脂質(zhì)體1 ，以2 300 r·min-1離心5 min，50 ℃加熱45 min，重復(fù)2 次。然后取上述Transwell 小室于-80 ℃條件下冷凍保存至少60 min，在實驗前于50 ℃條件下解凍60 min。

在上述模型中分別加入不同濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1溶液，取樣時間改為2 h、4 h，其余操作同“2.2.1”項下方法。

2.2.3 RIM 的建立及3 種皂苷成分Papp 測定［15］取新鮮大鼠腸黏液，-80 ℃條件下凍存，使用前室溫復(fù)融，在空白Transwell 小室中加入大鼠小腸黏液0.4 g，36 ℃孵育5 min制得RIM。

在上述模型中加入不同濃度的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 溶液，取樣時間改為0 h、1 h，其余操作同“2.2.1”項下方法。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 將數(shù)據(jù)導(dǎo)入GraphPad 7.0 軟件，采用SPSS 25.0 軟件進行數(shù)據(jù)的描述和分析。計量資料以xˉ±s表示，兩組之間采用獨立樣本t檢驗進行差異顯著性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 3 種皂苷成分HPLC線性范圍及方法學(xué)考察結(jié)果

3.1.1 線性范圍考察 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的線性回歸方程依次為y=2.248 4x-0.592 5（r2=0.999 5），y=3.719 4x-1.737（r2=0.999 5），y=2.269 3x-31.16（r2=0.999 0），表明三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 在10～1 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。見圖2。

3.1.2 精密度試驗 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的RSD值分別為0.47%、0.12%、0.18%（n=6），表明儀器的精密度良好。

3.1.3 穩(wěn)定性試驗 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的RSD值分別為2.1%、2.9%、1.9%，表明供試品溶液的穩(wěn)定性良好。

3.1.4 重復(fù)性試驗 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1的平均含量分別為369.68、41.54、25.90 mg·g-1，RSD值分別為1.3%、2.0%、1.0%（n=6），表明方法的重復(fù)性良好。

3.1.5 加樣回收試驗 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的平均加樣回收率分別為99.72%、101.26%、99.14%，RSD值均<2%，表明方法的準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的加樣回收率

3.2 3 種皂苷成分在PIM 中的Papp 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 在PIM 中的Papp 實驗測定結(jié)果顯示，在PIM 中，隨著濃度的升高，3種皂苷成分的滲透性都有不同程度的增加；三七皂苷R1 在不同濃度下的Papp都有顯著增加，與人參皂苷Rb1組、人參皂苷Rg1 組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；人參皂苷Rb1 組與人參皂苷Rg1 組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在純化黏蛋白滲透模型（PIM）中的表觀滲透系數(shù)比較（±s）

表2 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在純化黏蛋白滲透模型（PIM）中的表觀滲透系數(shù)比較（±s）

注：與三七皂苷R1比較，*P<0.05。

成分表觀滲透系數(shù)/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 18.07±0.40 4.81±0.23*5.47±0.10*20 g·L-1 30.82±0.07 7.36±0.02*7.90±0.02*三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1 10 g·L-1 21.88±0.70 6.67±0.04*6.82±0.08*

3.3 3 種皂苷成分在AIM 中的Papp 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 在AIM 中的Papp 實驗測定結(jié)果顯示，在AIM 中，隨著濃度的升高，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的滲透性都有不同程度的增加，在20 g·L-1濃度下的Papp 為三七皂苷R1>人參皂苷Rb1>人參皂苷Rg1（P<0.05）。見表3。

表3 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在人工腸黏液滲透模型（AIM）中的表觀滲透系數(shù)比較（±s）

表3 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在人工腸黏液滲透模型（AIM）中的表觀滲透系數(shù)比較（±s）

注：與三七皂苷R1比較，*P<0.05；與人參皂苷Rg1比較，#P<0.05。

成分表觀滲透系數(shù)/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 4.53±0.35 2.34±0.01 2.52±0.10 20 g·L-1 11.56±0.07 5.37±0.01*7.84±0.04*#三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1 10 g·L-1 6.07±0.15 3.00±0.06 4.15±0.05

3.4 3 種皂苷成分在RIM 中的Papp 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 在RIM 中的Papp 實驗測定結(jié)果顯示，在RIM 中，隨著濃度的升高，三七皂苷R1 和人參皂苷Rg1的滲透性增加幅度較大，而人參皂苷Rb1增加幅度較小；在5 g·L-1濃度下，人參皂苷Rg1 的滲透性較人參皂苷Rb1 顯著升高（P<0.05）；在10 g·L-1濃度下，三七皂苷R1 和人參皂苷Rg1 比人參皂苷Rb1 的滲透性顯著升高（P<0.05）；在20 g·L-1濃度下的Papp 為人參皂苷Rg1>三七皂苷R1>人參皂苷Rb1（P<0.05），與PIM、AIM模型滲透趨勢不同。見表4。

表4 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在大鼠腸黏液滲透模型（RIM）的表觀滲透系數(shù)（±s）

表4 三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1在大鼠腸黏液滲透模型（RIM）的表觀滲透系數(shù)（±s）

注：與三七皂苷R1比較，*P<0.05；與人參皂苷Rg1比較，#P< 0.05。

成分三七皂苷R1人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1表觀滲透系數(shù)（Papp）/（cm·s-1·10-5）5 g·L-1 4.28±0.45 8.73±0.07 2.45±0.01#20 g·L-1 13.53±0.33 20.31±0.64*4.82±0.13*#10 g·L-1 7.25±0.71 12.59±0.03 3.46±0.17*#

4 討論

隨著濃度的增加，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1 在3 種腸黏液滲透模型中的滲透性均有所增加。在不同濃度下，3 種皂苷成分在3 種模型中的滲透規(guī)律略有不同，在脂類成分較少的PIM 和AIM 中，水溶性成分滲透較強，如三七皂苷R1；而在RIM 中，脂溶性成分滲透作用較強，如人參皂苷Rg1。

4.1 在PIM 中 在不同濃度下，三七皂苷R1 的滲透性明顯優(yōu)于人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1。模型中藥物滲透的主要驅(qū)動力為被動擴散，藥物水溶性是影響藥物被動擴散的原因之一［16］。一方面，三七皂苷R1 的水溶性依次高于人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1［17］；另一方面，純化黏蛋白溶液缺失了磷脂層結(jié)構(gòu)［18］，模型本身脂溶性相對減少，使得PIM 中水溶性較高的三七皂苷R1具有較強的滲透性。

4.2 在AIM 中 AIM 藥物濃度為5 g·L-1和10 g·L-1時趨勢不顯著，當(dāng)濃度升高為20 g·L-1時，隨著藥物濃度的上升滲透性也隨之增加，三七皂苷R1 的滲透性最佳，人參皂苷Rb1 其次，人參皂苷Rg1 滲透性較差。但相較于3 種皂苷在PIM 中的滲透性，人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1更接近于三七皂苷R1的滲透性。這可能是因為AIM 中含有細胞膜相似的脂質(zhì)組成成分及結(jié)構(gòu)，具備較好的生物相容性［19］，所以相對于PIM 有利于提高親脂性皂苷的滲透性［20］。

4.3 在RIM 中 隨著藥物濃度的上升，3 種皂苷成分的滲透性也逐步增加，表明提高濃度對藥物滲透效率具有一定的促進作用。在濃度為20 g·L-1時，3 種皂苷成分的Papp 為人參皂苷Rg1>三七皂苷R1>人參皂苷Rb1（P<0.05）。RIM 為原生大鼠腸黏液滲透模型，能體現(xiàn)真實的腸道環(huán)境。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 均屬于原人參三醇型皂苷，更易被腸道吸收［21］，且人參皂苷Rg1 的親脂性大于三七皂苷R1，所以人參皂苷Rg1 在RIM中的滲透性最強。三七皂苷R1較人參皂苷Rb1滲透性高的原因可能在于其分子量比人參皂苷Rb1 的分子量小，更易透過大鼠腸黏液。

4.4 其他 建立的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 的HPLC 含量測定分析方法，其精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率良好，可用于體外腸黏液滲透模型的3種三七皂苷單體成分的含量測定。

三七皂苷R1、人參皂苷Rg1 和人參皂苷Rb1 在PIM、AIM、RIM 中穩(wěn)定性良好，均可單獨用于藥物的滲透性評價。

藥物的腸道滲透性決定藥物被人體吸收的速率和程度，并進一步?jīng)Q定了藥物口服生物利用度的高低［22］。目前大多數(shù)文獻主要通過針對三七總皂苷或其單體的口服生物利用度進行研究，探討整個腸黏膜屏障對藥物吸收的影響［23-24］，但缺少對吸收過程中腸道黏液影響的研究。本實驗通過多種體外腸黏液滲透模型研究3 種三七皂苷單體成分在腸道部位的滲透作用，并對3種成分在腸黏液中的滲透規(guī)律進行探討。該研究結(jié)果可與三七皂苷單體成分的口服藥代動力學(xué)結(jié)果進行互證，為三七皂苷類成分的口服吸收機制研究提供實驗依據(jù)，進而為三七總皂苷口服新制劑的設(shè)計及進一步的臨床應(yīng)用、開發(fā)提供思路。同時，也為其他口服藥物進行腸黏液滲透性研究時如何選擇適合的模型提供參考。