張 清，李榮勝，2，黃思紅，沈 沁，尹藝曉，蔣式驪，慕永平，陳佳美，劉 平，劉 偉，2

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病研究所，肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 201203）；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院藥學(xué)部國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實(shí)驗(yàn)室（上海 201203）；3.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院寶山分院兒科（上海 201900）

黃芪湯始載于宋代典籍《太平惠民和劑局方》，由黃芪和甘草兩味藥材按6∶1 比例組成，又稱黃芪六一湯。黃芪甘溫，具有益氣健脾、托毒生肌之功；甘草甘平，有補(bǔ)中益氣、調(diào)和諸藥之效。兩藥相須為用，可平補(bǔ)氣血、安和五臟，對于中焦虛損的諸多病癥療效顯著［1-2］。該方的臨床應(yīng)用和基礎(chǔ)研究主要涉及慢性肝病（乙型肝炎、膽汁淤積、肝纖維化、肝硬化等）和2型糖尿病［2-3］。黃芪湯的藥理研究主要集中于慢性肝病，其能夠上調(diào)肝組織成骨蛋白和促激蛋白膜結(jié)合抑制因子同源物（BAMBI）表達(dá)［4］，下調(diào)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（CD）31 和血管性血友病因子（vWF）的表達(dá)，減輕肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化的程度，進(jìn)而發(fā)揮抗肝纖維化作用［5］。中藥復(fù)方化學(xué)成分復(fù)雜，在體內(nèi)可能發(fā)揮協(xié)同作用，但目前尚未見開展黃芪湯顆?；瘜W(xué)成分系統(tǒng)研究的報(bào)道，且尚未有黃芪湯顆粒灌胃小鼠后入血原型及代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道。故此，本研究借助超高效液相串聯(lián)四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLC-QExactive Orbitrap HRMS）分析技術(shù)，采用正、負(fù)離子模式掃描，根據(jù)化合物保留時(shí)間、相對分子質(zhì)量、二級碎片離子等信息，結(jié)合對照品比對、文獻(xiàn)報(bào)道等方式，快速、系統(tǒng)地開展黃芪湯的化學(xué)成分與入血成分研究，以期為黃芪湯藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究、復(fù)方質(zhì)量控制及臨床合理應(yīng)用等提供部分科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康雄性C57/BL6J 小鼠9 只，體質(zhì)量20～22 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司上海分公司提供。動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（滬）2022-0007。動物使用許可證號：SYXK（滬）2022-0018。動物飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物房，飼養(yǎng)室溫度為25 ℃，相對濕度為40%～70%，光照周期明、暗各12 h。本動物實(shí)驗(yàn)通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：PZSHUTCM210709019）。

1.1.2 藥物與試劑 黃芪皂苷Ⅲ、染料木苷、奎寧酸、阿魏酸，大連美侖生物技術(shù)有限公司（批號分別為A0122AS、J0218AS、MB6731、M1102AS）；異黃芪皂苷Ⅰ、異黃芪皂苷Ⅱ、黃芪皂苷Ⅱ、毛蕊異黃酮苷、甘草苷、黃芪紫檀烷、大豆皂苷Bb、綠原酸、原兒茶酸，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司（批號分別為BP1719、BP1630、BP0211、BP0306、BP0874、PRF20010802、PRF21030441、PRF7102045、PRF10061151）；環(huán)黃芪醇，上海源葉生物科技有限公司（批號：C14J9Q65733）；甘草酸、隱綠原酸，上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（批號分別為150206、15020603）；異甘草苷、甘草素、異甘草素、咖啡酸、芒柄花素、毛蕊異黃酮、黃芪甲苷I、芒柄花苷、柚皮素、夏佛塔苷、異夏佛塔苷、芹糖異甘草苷、芹糖甘草苷、異佛來心苷，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司（批號分別為ST04480120、ST07000120、ST09620120、8066、3524、9314、10618、9453、9165、ST07760120、ST04950120、ST18930105、ST04390120、STC9740105）。以上對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。甲醇、乙腈、甲酸為高效液相色譜（HPLC）級，美國Thermo Fisher Scientific 公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)制得；其他試劑均為分析純。

黃芪湯委托江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司制作成顆粒劑（批號：2208305），每袋4.0 g（每克顆粒劑相當(dāng)于2.92 g生藥）。

1.1.3 主要儀器 UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS分析儀及超高效液相色譜儀（Dionex Ultimate 3000型），美國Thermo Fisher Scientific 公司；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），美國Waters公司；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)，美國Millipore 公司；BP211D電子分析天平，德國Sartorius公司。

1.2 色譜質(zhì)譜檢測方法

1.2.1 色譜分析 采用Dionex Ultimate 3000 儀器，甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相梯度洗脫。洗脫程序：0～2 min，4%甲醇；2～6 min，4%～12%甲醇；6～38 min，12%～70%甲醇；38～38.5 min，70%甲醇；38.5～39 min，70%～95%甲醇；39～43 min，95%甲醇；43～45 min，4%甲醇。流速0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

1.2.2 質(zhì)譜分析 采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 分析儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。加熱離子源（H-ESI），輔助氣流量13 arb，輔助加熱器溫度300 ℃，離子傳輸管溫度320 ℃，自動增益控制（AGC）為1×106，射頻水平（S-lens）50。電噴霧電離負(fù)離子模式（ESI-）：鞘氣（N2）流量35 arb，噴霧電壓2.5 kV；電噴霧電離正離子模式（ESI+）：鞘氣（N2）流量35 arb，噴霧電壓3.5 kV。掃描方式采用同時(shí)正負(fù)離子一級全掃描/二級全掃描（Full MS/dd-MS2）模式，其中包括1 次一級全掃描（分辨率為70 000 FWHM）和1 次數(shù)據(jù)依賴的二級掃描（分辨率為17 500 FWHM）2 個事件，正、負(fù)離子掃描范圍均為m/z100～1 500，碰撞能梯度為10 V、20 V、40 V。

1.3 對照品溶液的制備 精密稱取各對照品約1.00 mg，加入甲醇配制成1.00 g/L 的單一對照品儲備液。精密量取儲備液適量，加入20%甲醇水溶液稀釋成濃度為1 mg/L的混合溶液。

1.4 供試品溶液的制備 取黃芪湯顆粒1 g（相當(dāng)于生藥2.92 g），精密稱定，加水50 mL，超聲1 h 使其溶解。取上述提取溶液適量，采用20%甲醇稀釋，獲得按生藥量計(jì)算為10 g/L 的稀釋溶液，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜濾過后即得供試品溶液。

1.5 血清樣本的制備 給藥前將小鼠禁食12 h，自由飲水。將小鼠隨機(jī)分為空白組（3 只）和黃芪湯顆粒組（6 只），空白組灌胃超純水，黃芪湯顆粒組按照生藥含量7.32 g/kg 灌胃黃芪湯顆粒提取液（按65 kg 體質(zhì)量成人等效劑量換算而得），分別在給藥后1 h 和3 h 時(shí)各處理3 只，摘眼球取血，置于4 ℃箱過夜；4 500 r/min、4 ℃離心15 min，獲取血清。

1.6 血清樣品處理 取200 μL血清樣品，加入1 000 μL甲醇沉淀蛋白，12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液960 μL 至1.5 mL EP 管，溫和37 ℃氮?dú)饬鞔蹈?；?0 μL 20%甲醇水溶液復(fù)溶，12 000 r/min、離心10 min，取上清液進(jìn)樣分析。

1.7 檢測與分析 按“1.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件分別對對照品混合溶液、黃芪湯顆粒供試品及小鼠血清樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和結(jié)果分析。依據(jù)高分辨質(zhì)譜提供的準(zhǔn)分子離子和加荷離子等信息提取到相對分子量和質(zhì)譜離子峰，經(jīng)Xcalibur 3.0 軟件在允許誤差范圍內(nèi)（±10×10-6）擬合計(jì)算出可能的元素組成，再結(jié)合對照品、參考文獻(xiàn)等提供的二級質(zhì)譜離子碎片信息比對，進(jìn)一步鑒定出黃芪湯顆粒所含的化學(xué)成分。

2 結(jié)果

2.1 黃芪湯顆粒中化學(xué)成分鑒定 基于“1.2”項(xiàng)下色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化后，對黃芪湯顆粒及小鼠血清樣品進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和定性分析。在正、負(fù)離子同時(shí)掃描模式下，從黃芪湯顆粒中共鑒定出167 種化學(xué)成分，包括89種黃酮類、65 種皂苷類、9 種有機(jī)酸類以及4 種其他類化合物，其中30 種化學(xué)成分經(jīng)對照品比對確證，包括奎尼酸、咖啡酸、原兒茶酸等。黃芪湯顆粒提取液正、負(fù)離子模式總離子流圖（TIC）見圖1，黃芪湯顆?；瘜W(xué)成分及小鼠口服給藥后血清中鑒定的原型成分結(jié)果見表1［6-10］（見本文二維碼中）。

2.1.1 黃酮類成分的質(zhì)譜裂解表征 黃酮類化合物是黃芪湯顆粒的主要成分，故進(jìn)一步研究黃芪湯顆粒所含的黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律。黃酮類化合物在電噴霧質(zhì)譜（E S I - M S）中，易脫去糖基、丟失中性碎片-O、-CO、-H2O、-CO2，易發(fā)生逆狄爾斯-阿德爾反應(yīng)（RDA）裂解［11］。

以化合物15（異甘草苷）和化合物40（芒柄花苷）的裂解途徑為例，闡明黃酮類化合物可能的裂解規(guī)律。在負(fù)離子掃描模式下，異甘草苷產(chǎn)生［M-H］-準(zhǔn)分子離子峰（m/z417.119 8），化學(xué)式為C21H22O9（誤差為3.140 ppm）。在其ESI-MS2質(zhì)譜圖中檢測到有m/z255.066 4［M-HC6H10O5］-和m/z297.077 0［M-H-C6O3］-兩個離子碎片。m/z255.066 4［M-H-C6H10O5］-再依次丟失-C9H10、-O基團(tuán)，產(chǎn)生m/z180.005 5［M-H-C9H10］-和m/z148.015 5［MH-O］-離子碎片；而m/z297.077 0［M-H-C6O3］-依次丟失-C7H4O3、-C7H4O 碎片，產(chǎn)生m/z119.044 8［M-HC7H4O3］-和m/z153.018 2［M-H-C7H4O］-離子碎片，其中m/z153.018 2 丟失-O，產(chǎn)生m/z135.007 5［M-H-O］-離子碎片。芒柄花苷ESI-MS 模式下在加HCOOH 情況下有較高的離子響應(yīng)信號，產(chǎn)生m/z475.123 5［M+HCOOHH］-準(zhǔn)分子離子峰，在丟失-CHOOH 情況下得到m/z429.115 8［M-H-HCOOH］-，經(jīng)軟件擬合化學(xué)元素組成為C23H23O11（誤差為3.498 ppm），在其ESI-MS2質(zhì)譜圖中檢測到有m/z348.878 7［M-H-C5H4O］-和m/z267.066 6［MH-C6H10O5］-兩個離子碎片。m/z348.878 7［M-HC5H4O］-離子碎片再丟失-C11H6O4基團(tuán)產(chǎn)生m/z148.187 1［M-H-C11H6O4］-離子碎片；m/z267.066 6［M-H-C6H10O5］-依次丟失-C9H4O3、-CH2，產(chǎn)生m/z252.042 8［M-H-CH2］-和m/z107.880 8［M-H-C9H4O3］-離子碎片。化合物15 和化合物40 裂解途徑符合黃酮類化合物的裂解規(guī)律，與對照品和數(shù)據(jù)庫裂解途徑一致，最終確定化合物為異甘草苷（C21H22O9）與芒柄花苷（C22H22O9）。相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見圖2。

圖2 異甘草苷與芒柄花苷的質(zhì)譜圖（A、B）和推測裂解規(guī)律圖（C、D）

2.1.2 皂苷類成分的質(zhì)譜裂解表征 皂苷類成分是存在于黃芪和甘草藥材中的另一類重要成分。黃芪皂苷和甘草酸均屬于三萜皂苷類，是苷類中結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的化合物。該類化合物由苷元連接糖苷類組成，在質(zhì)譜條件下易發(fā)生脫Glu、連續(xù)脫H2O、丟CO 及Aglcone等基團(tuán)。

以化合物116（甘草酸）和化合物139（黃芪甲苷）為例，闡明該類化合物可能的裂解路徑。甘草酸在負(fù)離子模式下檢測到m/z821.398 0［M-H］-準(zhǔn)分子離子信號，經(jīng)軟件擬合可能的元素組成為C42H62O16（誤差為3.686×10-6），ESI-MS2質(zhì)譜圖中檢測到有m/z733.913 8［M-H-C-CO2］-和m/z351.057 5［M-H-C29H42O5］-離子碎片。兩個離子碎片分別丟失-C7H10O9、-C6H18O11基團(tuán)，產(chǎn)生m/z113.023 0［M-H-C7H10O9］-和m/z300.369 3［M-HC6H18O11］-離子碎片，其中m/z300.369 3 丟失C19H30O11基團(tuán)產(chǎn)生m/z193.035 0［M-H-C19H30O11］-離子碎片。黃芪甲苷在負(fù)離子加-HCOOH 情況下有較高的響應(yīng)，經(jīng)軟件擬合元素組成可能為C42H69O16（誤差為3.602×10-6），在其ESI-MS2質(zhì)譜圖中檢測到m/z783.451 0［M-HCOOH］-離子碎片。該離子碎片依次丟失-C9H16O7、-C7H10O4、-C5H16O3、-C6H14基團(tuán)，產(chǎn)生m/z548.460 7 ［M-HC9H16O7］-、m/z548.460 7［M-H-C7H10O4］-、m/z548.460 7［M-H-C5H16O3］-以及m/z548.460 7 ［M-H-C6H14］-離子碎片?；衔?16 和化合物139 裂解途徑符合黃酮類化合物的裂解規(guī)律，與對照品裂解途徑一致，最終確定化合物為甘草酸（C42H62O16）與黃芪甲苷（C41H68O14）。相應(yīng)質(zhì)譜裂解途徑見圖3。

圖3 甘草酸與黃芪甲苷的質(zhì)譜圖（A、B）和推測裂解規(guī)律圖（C、D）

2.2 小鼠入血成分及代謝產(chǎn)物鑒定 基于“2.1”項(xiàng)下鑒定結(jié)果，針對黃芪湯顆粒的化學(xué)成分及其可能產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，對小鼠血漿樣本的檢測結(jié)果進(jìn)行提取分析，結(jié)合保留時(shí)間及二級碎片離子信息，發(fā)現(xiàn)小鼠灌胃黃芪湯顆粒后，血漿樣本中可檢出60 種原型成分和43種代謝產(chǎn)物。43 種代謝產(chǎn)物中黃酮類33 種，皂苷類10種；主要代謝途徑為糖基化（+C6H10O5）、氧化（+O）、去飽和（-H2）、脫水（-H2O）、甲基化（+CH3）、乙?；?C2H2O）、硫酸化（+SO3）以及葡萄糖醛酸化（+C7H12O7）等反應(yīng)。黃芪湯顆粒入血原型成分見表1（見本文二維碼中），代謝產(chǎn)物成分見表2（見本文二維碼中），灌胃給藥后小鼠血清樣品中鑒定出的代謝產(chǎn)物離子峰見圖4。

圖4 小鼠空白血清與含藥血清中提取的代謝產(chǎn)物離子流圖

2.2.1 黃酮類化合物代謝產(chǎn)物 本實(shí)驗(yàn)檢測到黃酮類原型成分有異甘草素、異甘草苷、甘草苷、甘草素、毛蕊異黃酮、柚皮素、芒柄花素。以黃酮類成分異甘草苷代謝產(chǎn)物M1、M3 以及異甘草素代謝產(chǎn)物M31、M21 的詳細(xì)代謝過程為例，分析該類化合物代謝產(chǎn)物可能的路徑。結(jié)果顯示，該類化合物在小鼠血清中易發(fā)生甲基化、硫酸化以及葡萄糖醛酸化等類型反應(yīng)。

M1在保留時(shí)間為11.06 min時(shí)，提取到m/z593.150 1［M-H］-的離子峰，經(jīng)軟件擬合其分子式為C27H30O15（誤差為3.884×10-6），是異甘草苷的一個代謝產(chǎn)物，較異甘草苷m/z417.118 0［M-H］-增加-C6H8O6，符合葡萄糖醛酸化產(chǎn)物。M3 在保留時(shí)間為12.64 min 時(shí)提取到m/z497.077 0［M-H］-離子峰，該峰較異甘草苷的理論相對分子質(zhì)量增加-SO3，經(jīng)軟件擬合其分子式為C21H22O12S（誤差為4.379×10-6），為異甘草苷甲基化產(chǎn)物。其他特征離子碎片m/z255.066 1、m/z148.160 1、m/z135.007 4與異甘草苷的離子碎片相似，且與文獻(xiàn)報(bào)道的情況一致，因此推斷M1 是異甘草苷葡萄糖醛酸化產(chǎn)物，M3 是異甘草苷甲基化產(chǎn)物。

M31 在保留時(shí)間為19.75 min 時(shí)，提取到m/z271.096 5［M+H］+離子峰，經(jīng)軟件擬合其分子式為C16H14O4（誤差為-0.426×10-6），與異甘草素的理論相對分子質(zhì)量相差-CH3，該離子碎片峰為異甘草素甲基化代謝產(chǎn)物。M32 在保留時(shí)間為19.84 min 時(shí)，提取到m/z337.039 5［M-H］-離子峰，經(jīng)軟件擬合其分子式為C15H14O7S（誤差為-2.054×10-6）與異甘草素的理論相對分子質(zhì)量相比增加+SO3，該離子碎片峰為異甘草素硫酸化代謝產(chǎn)物。其他特征離子碎片m/z255.066 0、m/z148.010 1、m/z135.007 7 與異甘草素的離子碎片相似。因此，推斷M31 是異甘草素甲基化代謝產(chǎn)物，M32 是異甘草素硫酸化代謝產(chǎn)物。

同理，其他黃酮類化合物在準(zhǔn)分子離子碎片上同樣發(fā)生葡萄糖醛酸化、硫酸化，部分代謝產(chǎn)物在二級裂解碎片上發(fā)生水合、氧化或者去飽和后發(fā)生甲基化。推測的異甘草苷（A）和異甘草素（B）代謝產(chǎn)物途徑見圖5。

圖5 異甘草苷（A）、異甘草素（B）以及甘草酸（C）、黃芪甲苷（D）代謝途徑

2.2.2 皂苷類化合物代謝產(chǎn)物 本研究中皂苷類原型成分有甘草酸和黃芪甲苷，以皂苷類成分甘草酸代謝產(chǎn)物M38～M40 和黃芪甲苷代謝產(chǎn)物M11、M33、M35、M36、M42、M43 的詳細(xì)代謝過程為例，分析該類化合物代謝產(chǎn)物可能的路徑。結(jié)果顯示，該類化合物在體內(nèi)易發(fā)生水合后葡萄糖醛酸化或硫酸化，部分代謝產(chǎn)物在準(zhǔn)分子離子碎片脫掉糖苷后發(fā)生水合、氧化后易硫酸化或乙?；?。

M38、M39、M40 分別在保留時(shí)間為29.55 min、29.82 min和30.27 min時(shí)，提取到m/z471.311 1［M-H］-3個離子信號，經(jīng)軟件擬合其分子式為C29H44O5（誤差為1.208×10-6、2.502×10-6和1.653×10-6），與甘草酸的理論相對分子質(zhì)量相比，可發(fā)現(xiàn)是甘草酸水解兩分子葡萄糖醛酸并氧化后的代謝產(chǎn)物。M41 在保留時(shí)間為32.27 min 時(shí)，提取到m/z455.352 0［M-H］-離子信號，經(jīng)軟件擬合其分子式為C30H46O3（誤差為0.238×10-6），與甘草酸的理論相對分子量相比是甘草酸水解兩分子葡萄糖醛酸丟失-O的代謝產(chǎn)物，經(jīng)與對照品和文獻(xiàn)比對一致［12］，上述產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物符合甘草酸的代謝路徑。

M11在保留時(shí)間為15.61 min時(shí)提取到m/z717.351 4［M+H］+離子碎片，其擬合分子式為C36H62O12S（誤差為-0.249×10-6），與黃芪甲苷的理論分子質(zhì)量相比，為丟失-C6H10O5后水合、硫酸化的代謝產(chǎn)物。M33、M35、M36分別在保留時(shí)間20.27 min、21.59 min、22.23 min 時(shí)提取到m/z747.362 0［M-H］-的3 個離子碎片峰，經(jīng)軟件擬合其化學(xué)式為C36H60O14S（誤差為-6.053×10-6、-3.765×10-6和-7.270×10-6），與黃芪甲苷的理論分子量相比，為丟失-C5H8O4后經(jīng)氧化、硫酸化的代謝產(chǎn)物。M42 在保留時(shí)間為32.66 min 時(shí)提取到m/z681.330 3［M-H］-離子碎片峰，經(jīng)軟件擬合分子式為C35H54O11S（誤差為-9.481 ×10-6），與黃芪甲苷的理論分子質(zhì)量相比，為丟失-C6H10O6后經(jīng)還原、硫酸化的代謝產(chǎn)物。M43 在相對保留時(shí)間為40.15 min 時(shí)提取m/z677.425 9［M-H］-離子碎片峰，經(jīng)軟件擬合其化學(xué)式為C38H62O11（誤差為4.112×10-6）；此與黃芪甲苷的相對理論分子質(zhì)量相比，為丟失-C5H8O5后經(jīng)水合、乙?；拇x產(chǎn)物，與對照品和文獻(xiàn)比對一致［13］。上述產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物符合黃芪甲苷的代謝路徑。甘草酸（C）和黃芪甲苷（D）代謝產(chǎn)物途徑見圖5。

3 討論

化學(xué)成分極為復(fù)雜是中藥復(fù)方的主要特征之一，理化性能分析、HPLC、氣相色譜（GC）等方法常用于復(fù)方中含量較高成分的分析。對于口服復(fù)方后入血成分及其代謝產(chǎn)物，由于受到機(jī)體自身因素（如代謝酶的參與、內(nèi)源性成分的干擾、成分含量較低等）影響，導(dǎo)致其分析十分困難。近年來，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥復(fù)方化學(xué)成分、代謝產(chǎn)物鑒定等方面的應(yīng)用極大推進(jìn)了中藥復(fù)方化學(xué)成分及體內(nèi)暴露成分的解析，進(jìn)一步促進(jìn)了中藥復(fù)方藥效物質(zhì)相關(guān)研究的進(jìn)展［14］。

本研究采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 技術(shù)分析黃芪湯所含的化學(xué)成分，并完成小鼠灌胃后原型成分和入血成分、代謝產(chǎn)物的快速鑒定。從黃芪湯顆粒中共鑒定出167 種化學(xué)成分，包括89 種黃酮類、65種皂苷類、9 種有機(jī)酸類以及4 種其他類化合物；小鼠在灌胃后的血清中檢測到60 種原型成分和43 種代謝產(chǎn)物成分。目前針對黃芪湯的研究主要集中于對慢性肝病、糖尿病等疾病干預(yù)的藥效作用。已有研究［15-18］闡明了黃芪湯、黃芪總苷、黃芪甲苷、甘草酸對肝纖維化的部分作用機(jī)制，然而黃芪湯化學(xué)成分十分復(fù)雜，其中可能存在其他的成分也具有抗纖維化的作用。因此，本實(shí)驗(yàn)采用UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS 技術(shù)分析鑒定黃芪湯顆粒的化學(xué)成分及主要入血成分，發(fā)現(xiàn)黃芪和甘草中均有種類豐富的皂苷類與黃酮類成分，結(jié)合對照品、MassBank 等數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)中提供信息的比對，可以對化合物進(jìn)行鑒定。同類型化合物含有相似的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在化合物質(zhì)譜裂解過程中會產(chǎn)生相似的裂解碎片，利用該性質(zhì)可進(jìn)一步提高鑒定化合物的準(zhǔn)確性和合理性。值得關(guān)注的是以峰面積作為參照，甘草苷、甘草素、黃芪甲苷、甘草酸、毛蕊異黃酮、芒柄花素、芒柄花苷等成分在黃芪湯和小鼠血清中都有較好的響應(yīng)，這些成分有望成為黃芪湯質(zhì)量控制的指標(biāo)。本次研究還發(fā)現(xiàn)黃芪湯體內(nèi)代謝產(chǎn)物多以Ⅱ相代謝物為主，主要包括甲基化、葡萄糖醛酸化及硫酸化產(chǎn)物，這可能與天然產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)有關(guān)。后續(xù)課題組將結(jié)合本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)一步探討相關(guān)化合物在體內(nèi)的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系。

值得一提的是，本研究中復(fù)方化學(xué)成分與入血成分僅為定性分析，后續(xù)仍需要進(jìn)行定量分析與全面的體內(nèi)代謝過程研究，同時(shí)結(jié)合體內(nèi)外藥效評價(jià)模型，開展更為深入的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制研究，以闡明黃芪湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而為該方的科學(xué)合理應(yīng)用及相關(guān)的新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。