鐘雪慶，趙群飛

上海中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新中藥研究院手性藥物研究中心（上海 201203）

蟾酥是蟾蜍科動物中華大蟾蜍（Bufobufo gargarizansCantor）或黑眶蟾蜍（BufomelanostictusSchneider）耳后腺和皮膚腺體的干燥分泌物［1］，屬于我國傳統(tǒng)名貴中藥材。其性溫、味甘辛、有毒，有解毒止痛、開竅醒神的功效，主治癰疽疔瘡、瘰疬、咽喉腫痛、痧脹腹痛等［2］?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，蟾酥具有強心［3-4］、抗腫瘤［5-6］、抗炎鎮(zhèn)痛［7-8］等多種藥理活性。

蟾蜍內(nèi)酯類化合物是蟾酥的獨特功效組分［9］，其共同的結(jié)構(gòu)特征在于甾體母核C17 位置連有一個高度氧化的六元二烯內(nèi)酯環(huán)側(cè)鏈，屬于強心甾類化合物，具有強心、抗腫瘤、抗炎、局部麻醉等生理活性［10］。但蟾蜍內(nèi)酯類化合物往往毒性較大且水溶性差，從而限制了其在臨床上的應(yīng)用［11］。對蟾蜍內(nèi)酯類化合物進行結(jié)構(gòu)修飾，獲得低毒性、高水溶性且具有良好藥理活性的結(jié)構(gòu)衍生物是實現(xiàn)蟾酥功效組分可持續(xù)利用的重要手段，其中甾體骨架上的羥化修飾是提高其水溶性并對其進行進一步結(jié)構(gòu)改造的關(guān)鍵。甾體骨架惰性碳-氫鍵的立體選擇性氧化一直以來是化學(xué)合成的重大挑戰(zhàn)，因此采用生物催化實現(xiàn)蟾蜍內(nèi)酯類化合物的羥化修飾成為近年來的研究熱點。但目前該類化合物的生物催化依賴于篩選合適的微生物進行生物轉(zhuǎn)化［12-18］，還缺少能催化羥化反應(yīng)的酶的報道。微生物轉(zhuǎn)化往往特異性差、產(chǎn)物復(fù)雜，后續(xù)分離純化困難且難以進行優(yōu)化改造。因此，挖掘和表征能催化蟾蜍內(nèi)酯類化合物特異性羥化反應(yīng)的酶具有重要的意義。

本研究以已知的真菌甾體羥化酶為探針，通過同源序列比對，嘗試從已知具有甾體羥化功能的藤倉赤霉菌（Fusariumfujikuroi）［19］中挖掘能催化蟾蜍內(nèi)酯類化合物特異性羥化反應(yīng)的酶，以促進蟾酥功效組分蟾蜍內(nèi)酯類化合物的開發(fā)應(yīng)用。

1 材料

1.1 主要儀器 高溫滅菌鍋，普和希株式會社（型號：MLS-3751L-PC）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司（型號：GSP-9080MBE）；超微量紫外分光光度計，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司（型號：NanoDrop One 840-317400）；臺式常溫離心機，德國艾本德公司（型號：Eppendorf Centrifuge 5245）；高速冷凍離心機，德國艾本德公司（型號：Eppendorf Centrifuge 5910R）；DNA 電泳儀，北京六一生物科技有限公司（型號：JY300C）；蛋白電泳儀，美國BIO-RAD 公司（型號：165-8001）；電轉(zhuǎn)儀，美國BIO-RAD 公司（型號：PowerPac Basic 164-5050）；凝膠成像儀，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司（型號：GenoSens 1850）；大容量振蕩培養(yǎng)箱，上海西雷生物科技有限公司（型號：YR101）；高通量組織研磨儀，上海萬柏生物科技有限公司（型號：Wonbio-48r）；聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增儀，美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司（型號：ProFlexTMBase）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司（型號：ChemiScope6100）；反相液相色譜儀，日本島津企業(yè)管理（中國）有限公司（型號：SIL-20ACHT UFLC）；反相制備液相色譜儀，美國安捷倫科技（中國）有限公司（型號：Agilent 1260 Infinity Ⅱ PrepLC System）；科思美析Cholester 色譜柱，日本 Nacalai Tesque 公司（型號：05977-51）。

1.2 藥物與試劑 蟾毒靈、蟾毒它靈對照品，成都德思特生物技術(shù)有限公司（批號：DC0022、DC0079）；DNA 分子量標準Marker，上海生工生物技術(shù)有限公司（批號：B500351-0500）；TureColor 雙色預(yù)染蛋白 Marker，上海生工生物技術(shù)有限公司（批號：C610011-0001）；胰蛋白胨、酵母提取物，美國賽默飛世爾科技（英國）公司（批號：LP0042B、LP0021B）；博萊霉素（Zeocin）、無氨基酵母氮源（YNB），北京索萊寶科技有限公司（批號：Z8020、Y8040）；裂解液（用于PCR） ，艾科瑞生物科技有限公司（批號：AG12306）；非連接酶依賴型的多片段一步法克隆試劑盒，南京諾唯贊生物科技有限公司（批號：C113-01）；高純度耐熱DNA 聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司（批號：P111-01）；超保真DNA 聚合酶，南京諾唯贊生物科技有限公司（批號：P505-d1）；限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Spe Ⅰ、Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ，美國New England Biolab 公司（批號：R0136V、R3133V、R3142S、R0146S）；質(zhì)粒小提試劑盒，美國OMEGA Bio-Tek 公司（批號：D2500-02）；DNA 切膠回收試劑盒，美國OMEGA Bio-Tek 公司（批號：D6943-02）；高效液相色譜（HPLC）用乙腈，美國J.T.Baker 公司（批號：B9017-03）；小鼠抗多聚組氨酸標簽（His-Tag）抗體（一抗），愛博泰克（ABclonal）生物科技有限公司（批號：AE003）；辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗小鼠IgG （H+L）抗體（二抗），ABclonal 生物科技有限公司（批號：AS003）；超敏ECL 發(fā)光液試劑盒，上海勤翔科學(xué)儀器有限公司（批號：1810212）；常用國產(chǎn)化學(xué)試劑氯化鈉（NaCl）、氯化鉀（KCl），上海泰坦科技股份有限公司（批號：01226205、01111284）；常用生化試劑瓊脂粉、葡萄糖，上海生工生物技術(shù)有限公司（批號：A505255-0250、A610219-0500）。

1.3 菌株和質(zhì)粒 畢赤酵母菌株KM71H，上海澤葉生物科技公司（批號：ZY62227GC）；酵母表達載體（pPICZA）質(zhì)粒，金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.4 培養(yǎng)基

（1）溶菌肉湯（LB）培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，去離子水（ddH2O）定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂20 g，ddH2O定容至1 L，121 ℃滅菌20 min。

優(yōu)化肉湯（SOB）培養(yǎng)基：胰蛋白胨20 g，酵母提取物5 g，NaCl 0.5 g，KCl 0.186 g，ddH2O 定容至1 L，121 ℃，滅菌20 min。

（2）酵母浸出粉胨葡萄糖（YPD）培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基：酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨2.0 g，ddH2O 90 mL，20%葡萄糖溶液10 mL，115 ℃滅菌30 min。固體培養(yǎng)基：酵母提取物1.0 g，胰蛋白胨2.0 g，瓊脂2 g，20%葡萄糖溶液10 mL，ddH2O 90 mL，121 ℃滅菌20 min。20%葡萄糖溶液：100 g 葡萄糖用ddH2O定容至500 mL，115 ℃滅菌15 min。

（3）最小甘油培養(yǎng)基（MGYH）：1.34% （W/V） 酵母氮源，1% （V/V） 甘油，4×10-5% （W/V） 生物素，ddH2O 定容至1 L。

（4）最小甲醇組氨酸培養(yǎng)基（MMH）：1.34% （W/V）酵母氮源，0.5% （V/V） 甲醇，4×10-5%（W/V） 生物素，ddH2O定容至1 L。

1.5 引物 PCR 所需的核苷酸引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。AOX-duet-F1、AOX-duet-R1、AOXduet-F2、AOX-duet-R2 用于構(gòu)建含有兩套AOX1 啟動子/終止子表達盒的共表達載體pPICZA-duet ；FF294-F、FF294-R 用于從畢赤酵母菌重組菌株中克隆驗證甾體7β-羥化酶基因FF294是否整合到酵母染色體上；CPRlun-F、CPRlun-R 用于從畢赤酵母菌重組菌株中克隆驗證細胞色素P450 還原酶基因CPRlun是否整合到酵母染色體上。見表1。

表1 引物序列表

2 方法

2.1 畢赤酵母蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建

2.1.1 畢赤酵母蛋白共表達載體pPICZA-duet 的構(gòu)建

以酵母表達載體pPICZA 為模板，分別以AOX-duet-F1/R1 和AOX-duet-F2/R2 為引物，通過Phanta?Max Super-Fidelity DNA 聚合酶克隆出DNA片段1和DNA片段2。用限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ酶切載體pPICZA，通過使用切膠回收試劑盒回收PCR 擴增的片段及酶切片段。

將回收的DNA片段和酶切片段采用非連接酶依賴型的多片段一步法克隆試劑盒進行重組。取10 μL 重組產(chǎn)物加入到100 μL 的大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞中進行化學(xué)轉(zhuǎn)化，按常規(guī)質(zhì)粒提取方法提取質(zhì)粒。由上海生工生物技術(shù)有限公司對重組質(zhì)粒進行測序，確定序列正確后得到共表達載體pPICZA-duet。

2.1.2 重組表達載體pPICZA-duet-FF294-CPRlun的構(gòu)建 由金斯瑞生物科技股份有限公司合成經(jīng)畢赤酵母偏好性密碼子優(yōu)化的FF294基因以及細胞色素P450酶還原酶基因CPRlun（GenBank 編號：QEG13902.1）。將CPRlun基因插入至pPICZA-duet 的限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/Spe Ⅰ之間獲得重組質(zhì)粒pPICZA-duet-CPRlun，再將FF294基因插入至pPICZA-duet-CPRlun的限制性內(nèi)切酶Kpn Ⅰ/Xho Ⅰ之間，獲得同時攜帶CPRlun和FF294的重組質(zhì)粒pPICZA-duet-FF294-CPRlun。

2.2 甾體羥化酶FF294酵母工程菌的構(gòu)建 按常規(guī)方法制備畢赤酵母感受態(tài)細胞，取40 μL 重組質(zhì)粒pPICZA-duet-FF294-CPRlun，加至240 μL 新鮮畢赤酵母KM71H 感受態(tài)細胞中；電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)（2 kV、5 ms），電擊后加入1 mL 預(yù)冷的1 mol/L 的山梨醇；30 ℃、100 r/min孵育1.5～2 h；室溫，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，重懸于1 mol/L 的山梨醇，涂布于YPD 平板（含100 μg/mL的博來霉素），30 ℃靜置培養(yǎng)3～5 d，長出菌落。挑選8～10 個酵母工程菌單克隆于3 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中（含100 μg/mL 的博來霉素，置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將YPD 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接至5 mL 的MGYH中，置于30 ℃、260 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；MGYH 培養(yǎng)物4 ℃、2 000 r/min 離心5 min，收集菌體，5 mL MMH（含甲醇0.5%）重懸，置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每隔24 h加0.5%甲醇溶液。

（1）驗證目的基因是否整合到酵母細胞染色體。取20 μL上述培養(yǎng)了3 d的菌液于1.5 mL的EP管中，加入100 μL 的裂解液和1 μL 的蛋白酶 K，60 ℃條件下反應(yīng)5 min，隨后在98 ℃條件下反應(yīng)2 min，放在冰上備用。取1～4 μL 上清液為模板，以FF294-F/R 和CPRlun-F/R為引物進行PCR 擴增，PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，驗證目標基因FF294和CPRlun是否整合到酵母染色體上。

（2）通過蛋白免疫印跡法（Western blot）的方法驗證目標蛋白是否表達及篩選高表達陽性克隆。取1 mL上述誘導(dǎo)培養(yǎng)了3 d 的菌液離心收集菌體，液氮速凍，研磨儀破碎菌體（60 Hz、1 min ，2 次）后加入1 mL 的裂解液溶解制備樣品，10 000 r/min，離心5 min，取上清，進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）蛋白電泳。采用濕法轉(zhuǎn)膜300 mA恒流條件下轉(zhuǎn)膜2 h，取下含有蛋白條帶的硝酸纖維素膜，磷酸鹽緩沖液（PBST）清洗后用5%的脫脂奶粉封閉2 h；小鼠來源的抗His-Tag 的一抗孵育1 h；PBST 清洗后加入HRP 標記的二抗，室溫下孵育0.5 h；PBST buffer 清洗后，采用超敏ECL 發(fā)光液試劑盒顯色1～2 min，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測。

2.3FF294酵母工程菌對蟾蜍內(nèi)酯類化合物的轉(zhuǎn)化

將畢赤酵母工程菌KM71H-FF294接種于5 mL 的YPD 液體培養(yǎng)基中（含100 mg/L 的博來霉素）中，置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h得到種子培養(yǎng)液；將0.5 mL種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至5 mL的MGYH中，置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后收集菌體。用5 mL的MMH重懸菌體，加入25 μL溶于甲醇的蟾蜍內(nèi)酯類化合物（喂養(yǎng)終濃度為100 mg/L），置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中轉(zhuǎn)化3 d，每隔24 h補加0.5%甲醇。取500 μL 菌液用等體積乙酸乙酯萃取兩次，氮吹儀吹干后用500 μL甲醇復(fù)溶，進行HPLC-MS檢測。

液相分析條件：0～3 min，30% B；20～25 min，100%B；26 ～30 min，30% B（流動相A：水+0.1%甲酸溶液；流動相B：乙腈+0.1% 甲酸溶液）。色譜柱采用COSMOSIL Cholester-column （4.6 mm I.D.×250 mm）；柱溫40 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm。

2.4 蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定 接種畢赤酵母工程菌KM71H-FF294于10 mL的YPD液體培養(yǎng)基中（含100 mg/L的博來霉素），置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)接至1 L的MGYH中，置于30 ℃、260 r/min振蕩培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h 后收集菌體。用1 L 的MMH（不加甲醇）重懸菌體，加入蟾蜍二烯酸內(nèi)酯類化合物（溶于1%的甲醇溶液中，喂養(yǎng)終濃度100 mg/L），置于30 ℃、260 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中，轉(zhuǎn)化3 d，每隔24 h 補加0.5%甲醇溶液。用等量的乙酸乙酯萃取兩次，旋干后得到粗品，通過制備級反相HPLC對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行分離純化，純化后的化合物用40%～70%的乙腈溶解至飽和狀態(tài)，置于4 ℃冰箱揮發(fā)結(jié)晶，通過核磁共振（NMR）分析檢測和X 射線單晶衍射鑒定其結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)果

3.1 藤倉赤霉菌中甾體羥化酶FF294 的發(fā)現(xiàn) 藤倉赤霉菌能轉(zhuǎn)化甾體化合物形成多種羥化產(chǎn)物［19］，但其中起催化作用的甾體羥化酶還未被鑒定。我們以已知新月彎孢霉（C.lunatus）來源的C14α-甾體羥化酶基因P450lun（GenBank 基因編號：QEG13904.1）為探針，通過生物大分子序列比對（Blast）法，于藤倉赤霉菌的基因組（GenBank 編號：FMSL01000003.1）中挖掘到一個可能編碼甾體羥化酶的同源基因（命名為FF294，GenBank 編號：SCV33294.1）。FF294 與P450lun的Identities/ Positives為 44%/61%。

3.2 甾體羥化酶FF294 畢赤酵母異源表達工程菌株的構(gòu)建結(jié)果

3.2.1 畢赤酵母異源表達質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果 真菌來源的細胞色素P450 酶通常需要細胞色素P450 還原酶（CPR）為其提供電子以完成羥化反應(yīng)。因此，我們在常規(guī)畢赤酵母表達載體pPICZA 基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含兩個AOX1啟動子/AOX1終止子表達盒、適用于兩個基因共表達的畢赤酵母表達載體pPICZA-duet，質(zhì)粒圖譜如圖1A 所示。將FF294基因以及CPRlun基因插入pPICZA-duet，獲得重組質(zhì)粒pPICZA-duet-FF294-CPRlun，質(zhì)粒圖譜如圖1B所示。

圖1 畢赤酵母共表達載體pPICZA-duet（A）和重組質(zhì)粒pPICZA-duet-FF294-CPRlun（B）的質(zhì)粒圖譜

3.2.2 畢赤酵母高效異源表達工程菌株的構(gòu)建和篩選結(jié)果 將質(zhì)粒pPICZA-duet-FF294-CPRlun電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母 KM71H 中，得到重組菌株KM71H-FF294。利用引物FF294-F/R 和CPRlun-F/R 進行PCR 擴增實驗，確定了目的基因FF294和CPRlun成功地整合到酵母細胞染色體上（圖2A）。通過抗His-Tag 抗體進行Western blot 實驗，確定了甾體羥化酶FF294 和P450 還原酶CPRlun能夠在酵母細胞中高表達，選擇5 號陽性克隆進行后續(xù)實驗（圖2B）。

圖2 陽性畢赤酵母工程菌株的篩選

3.3FF294重組酵母工程菌轉(zhuǎn)化蟾蜍內(nèi)酯類化合物

為了鑒定藤倉赤霉菌來源甾體羥化酶FF294 的功能，我們以蟾蜍內(nèi)酯類化合物蟾毒它靈、蟾毒靈為底物（圖3A），研究畢赤酵母重組菌株KM71H-FF294的羥化活性。在終濃度為100 mg/L、生物轉(zhuǎn)化72 h 后，以HPLC-MS 法檢測代謝產(chǎn)物，結(jié)果顯示FF294 轉(zhuǎn)化蟾毒它靈沒有產(chǎn)生明顯的產(chǎn)物（圖3B），而轉(zhuǎn)化蟾毒靈時產(chǎn)生了預(yù)期分子量的羥化產(chǎn)物化合物1 （圖3C，圖4）。

圖3 FF294重組酵母工程菌轉(zhuǎn)化蟾蜍內(nèi)酯類化合物產(chǎn)物的高效液相色譜-質(zhì)譜檢測結(jié)果

圖4 蟾毒靈和FF294重組酵母工程菌轉(zhuǎn)化蟾毒靈產(chǎn)物的質(zhì)譜檢測結(jié)果

3.4 蟾毒靈轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定 為了進一步確定FF294 的功能，我們對蟾毒靈轉(zhuǎn)化產(chǎn)物化合物1 進行了分離及結(jié)構(gòu)鑒定。通過2.4 中的步驟得到轉(zhuǎn)化產(chǎn)物粗品。通過半制備級反相HPLC 對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進行分離純化、X-射線單晶衍射和核磁共振（NMR）檢測，確定了化合物1 的結(jié)構(gòu)為7β-羥基蟾毒靈。晶體結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)見圖5、表2；NMR 碳氫圖譜和數(shù)據(jù)見圖6、圖7。

圖5 化合物1的晶體結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)式

圖6 化合物1的核磁碳譜圖

圖7 化合物1的核磁氫譜圖

表2 分離到的化合物1的X-射線晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)

化合物1 的核磁數(shù)據(jù)：1H NMR （600 MHz，DMSOd6）：δ 7.95 （dd，J= 9.7，2.5 Hz，1H），7.59-7.39（m，1H），6.28（d，J= 9.6 Hz，1H），5.57（d，J= 4.6 Hz，1H），5.54 （s，1H），4.21 （d，J= 3.0 Hz，1H），3.85（s，1H），3.83-3.74 （m，1H），2.50-2.44 （m，1H），2.16-2.05 （m，2H），1.83-1.74 （m，2H），1.74-1.63 （m，3H），1.62-1.52 （m，2H），1.48-1.37 （m，3H），1.37-1.28 （m，6H），1.16-1.08 （m，1H），0.89 （s，3H），0.62（s，3H）；13C NMR （151 MHz，DMSO-d6）：δ 17.29，21.69，24.12，27.80，28.95，29.70，33.74，34.64，35.27，36.98，37.19，40.53，46.50，47.99，50.56，64.82，69.72，84.98，114.76，123.12，148.04，149.66，161.85。

4 討論

蟾蜍內(nèi)酯類化合物是名貴中藥材蟾酥的獨特功效成分，具有很好的藥理活性和應(yīng)用前景。近年來，由于蟾酥藥用資源需求量與日俱增，直接從動物中分離提取資源受限，而且該類化合物通常毒性較大且水溶性差，限制了其進一步的開發(fā)和應(yīng)用。采用化學(xué)合成的手段對甾體母核的不活潑碳-氫鍵進行高立體選擇性氧化修飾面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此，蟾蜍內(nèi)酯類化合物的生物轉(zhuǎn)化成為了研究熱點。但目前蟾蜍內(nèi)酯類化合物的羥化主要是通過微生物轉(zhuǎn)化來實現(xiàn)，雖有較多對蟾蜍內(nèi)酯類化合物進行微生物轉(zhuǎn)化羥化的案例［12-18］，但至今還沒有對此類化合物進行特異性羥化修飾的羥化酶被克隆鑒定。

本課題從真菌藤倉赤霉菌中發(fā)現(xiàn)的蟾毒靈7β-羥化酶FF294，據(jù)課題組所知，是目前文獻報道的首個蟾蜍內(nèi)酯羥化酶。該酶的發(fā)現(xiàn)和研究，將促進更多蟾蜍內(nèi)酯羥化酶的挖掘和表征，從而有助于更多含多重手性中心、高氧化態(tài)的蟾蜍內(nèi)酯類化合物的綠色、高效、精準合成，進而有利于推進蟾酥功效組分的可持續(xù)開發(fā)利用。