孫藝娟 賈杰 鄧戀 漆冬梅 陳祥楠 黎昆偉 王培宗

1廣東省婦幼保健院麻醉科（廣州 511400）；2中山大學(xué)腫瘤防治中心麻醉科（廣州 510060）

先兆子癇（PE）是一種妊娠期高血壓疾病。它影響全世界2%～8%的妊娠，并導(dǎo)致孕產(chǎn)婦在圍產(chǎn)期發(fā)病率和病死率的增加［1］。研究表明，缺氧會(huì)促使胎盤釋放各種炎癥因子進(jìn)入母體循環(huán)，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞遷移和侵襲減少，引起PE 的發(fā)生［2-3］。丙泊酚具有麻醉作用外，還有一定的抗炎和抗氧化作用［4-5］，并抑制惡性腫瘤細(xì)胞的生物活性［6］。而丙泊酚是否對缺氧條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)活性產(chǎn)生影響，其調(diào)節(jié)機(jī)制如何，值得我們進(jìn)一步研究。

Targetscan 預(yù)測軟件分析表明，miR-182-5p 和HIF-1α 具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，但是丙泊酚是否可以通過miR-182-5p 調(diào)節(jié)HIF-1α 參與PE 的調(diào)控，目前尚未有報(bào)道。本研究通過缺氧刺激HTR-8/SVneo細(xì)胞構(gòu)建缺氧細(xì)胞模型，并通過丙泊酚干預(yù)，從miR-182 分子入手，對下游信號調(diào)節(jié)的效應(yīng)做進(jìn)一步研究，并著重對滋養(yǎng)層細(xì)胞的分化、侵襲進(jìn)行觀察，以期能為PE 圍術(shù)期治療和預(yù)后提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料人HTR8/SVneo 細(xì)胞購自廣州賽庫生物；總RNA 提取試劑購自北京Solarbio 生物；胎牛血清購自美國Hyclone 公司，DMEM 培養(yǎng)基和Matrigel 購自美國Sigma 公司；SYBR qPCR Master Mix 購自南京諾唯贊；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen 公司；mimics NC 和miR?182?5p inhibitor 引物由廣州國自科技設(shè)計(jì)；ECL 化學(xué)發(fā)光底物和BCA 試劑盒購自北京白鯊易生物；CCK-8試劑購自武漢塞維爾；HIF-1α、VEGF、MMP9 、GAPDH 一抗、二抗購自武漢proteintech；丙泊酚購自MCE 生物。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組將細(xì)胞培養(yǎng)在10%胎牛血清、100 單位/mL 青霉素和100 mg/mL鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，并在37 ℃、5% CO2、加濕條件下孵育。利用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑將mimics NC、miR?182?5p inhibitor 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞，24 h 后進(jìn)行分組：（1）對照組（Normoxia）：采用常氧21% O2培養(yǎng)細(xì)胞；（2）缺氧組（Hypoxia）；（3）丙泊酚組（propofol）：處理細(xì)胞時(shí)加入1 μmol/L 的丙泊酚；（4）缺氧陰性轉(zhuǎn)染組（Hypoxia+mimics NC）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染 mimics NC；（5）丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組（Hy?poxia+Propofol+mimics NC）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染mimics NC 后加入1μmol/L 的丙泊酚；（6）丙泊酚+轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor組（Hypoxia+propofol+miR-182-inhibitor）：細(xì)胞轉(zhuǎn)染 miR-182-inhibitor 后，加入1 μmol/L 的丙泊酚。除對照組外，其余組全部在3%缺氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞。

1.2.2 CCK8 檢測細(xì)胞活力的變化取處于對數(shù)生長期細(xì)胞，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8 （CCK8）測定以檢查細(xì)胞活力。按照試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測450 nm 吸光值。

1.2.3 定時(shí)qPCR 檢測miR-182 及HIF-1α 的表達(dá)水平采用TriQuick Reagent 提取細(xì)胞總RNA，然后采用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 進(jìn)行qPCR 檢測，使用 2?ΔΔCt測量所有樣品的循環(huán)閾值（Ct）。使用U6 作為內(nèi)參計(jì)算miR-182a-5p 的相對轉(zhuǎn)錄水平，同時(shí)選擇GAPDH 作為內(nèi)參計(jì)算HIF-1α 的mRNA 表達(dá)水平。

1.2.4 免疫印跡檢測蛋白使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液分離總蛋白。蛋白濃度測定采用BCA 蛋白定量試劑盒；分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。膜在室溫下用與以下一抗孵育過夜：抗HIF-1α（1∶800）、抗VEGF（1∶800）和抗MMP-9（1∶800）、GAPDH（1∶2 000）。將膜與二抗（1∶4 000）孵育，最后采用ECL 化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行曝光，通過image-J 軟件對條帶進(jìn)行分析。

1.2.5 Transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將1 × 106/mL 細(xì)胞，取100 μL 接種到Transwell 小室的上孔中。放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，甲醛固定、PBS 洗滌、結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)穿過的細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)：按Matrigel：培養(yǎng)基=1∶3 的比例稀釋，取40 μL 加入Transwell 小室中。37 ℃孵育2 h 使Matrigel 凝固。將1 × 106/mL細(xì)胞，取100 μL 接種至Transwell 小室上孔，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48 h 后，取出小室，用棉簽擦去上室的細(xì)胞，甲醛固定、PBS 洗滌、結(jié)晶紫染色。顯微鏡拍照并統(tǒng)計(jì)穿過的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6 TUNEL 法檢測細(xì)胞凋亡將玻片放入24孔板，細(xì)胞懸液加入孔中過夜。棄上清液，PBS 清洗細(xì)胞，用4%PFA 室溫固定，PBS 清洗。細(xì)胞用0.3%TrtonX-100 處理。棄透化液，PBS 清洗，加入TUNEL 反應(yīng)液37 ℃避光孵育，PBS 清洗封片后熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.2.7 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)用HIF-1α 的3'-UTR 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞。構(gòu)建HIF-1α 突變型和野生型載體，并將載體與NC-mimics 和miR-182 mimics 轉(zhuǎn)入HTR-8/SVneo 細(xì)胞中。將突變引入miR-182 的2 個(gè)預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)（UUGCCAA），48 h 后測定熒光酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 25.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。所有上述測定的結(jié)果都是通過3 個(gè)獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得的。兩組數(shù)據(jù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（ANVOA），Bonferroni法進(jìn)行事后比較，以P< 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確定合適氧濃度和丙泊酚預(yù)處理濃度將細(xì)胞暴露不同氧濃度處理（常氧21% O2、10% O2、3% O2、1% O2），并通過CCK8 法測定細(xì)胞活力。發(fā)現(xiàn)缺氧以時(shí)間相關(guān)的方式降低細(xì)胞活力，與常氧比較，缺氧抑制作用在 24 h 后出現(xiàn)，并在72 h 治療后達(dá)到峰值（圖1，P< 0.05）。為了研究丙泊酚對細(xì)胞活力的影響，分別采用不同濃度（0、0.1、0.3、1、3 μmol/L）的丙泊酚預(yù)處理細(xì)胞，與0、0.1、0.3 μmol/L 相比1、3 μmol/L 異丙酚預(yù)處理細(xì)胞活力最好（圖2，P< 0.05）。本次實(shí)驗(yàn)選取3%氧濃度和1 μmol/L 丙泊酚濃度對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)處理。

圖1 不同氧濃度下細(xì)胞活力Fig.1 Cell viability at different oxygen

圖2 不同濃度丙泊酚預(yù)處理細(xì)胞活力Fig.2 Cell viability of pretreated cells with different concen?trations of propofol concentrations

2.2 qRT-PCR 檢測miR-182-5p mRNA 和HIF-1α mRNA 的表達(dá)qRT-PCR 顯示，與對照組相比，缺氧組miR-182-5p mRNA 的表達(dá)下調(diào)（P< 0.05），而HIF-1α mRNA 的表達(dá)顯著升高（P< 0.05）。與缺氧組比較，丙泊酚處理組miR-182-5p mRNA 表達(dá)的升高（P< 0.05），而HIF-1α mRNA 的表達(dá)降低（P< 0.05，圖3）。

圖3 miR-182 mRNA 和HIF-1α mRNA 的表達(dá)Fig.3 The relative expression of miR-182 mRNA and HIF-1α mRNA

2.3 通過蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)變化水平通過Wetern blot 檢測各組蛋白表達(dá)結(jié)果顯示：與對照組相比，缺氧組HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平升高（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低（P< 0.05）；與缺氧組相比，丙泊酚組HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平降低（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高（P< 0.05，圖4）。

圖4 Western blot 檢測不同組蛋白表達(dá)變化水平Fig.4 Western blot detection of the relative protein expres?sion levels in different groups

2.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移以及侵襲變化Tran?swell 實(shí)驗(yàn)表明與對照組相比，缺氧組的細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量均受到顯著抑制（P< 0.05）；與缺氧組比較，丙泊酚組細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)量顯著升高（P< 0.05，圖5）。

圖5 Transwell 檢測細(xì)胞遷移以及侵襲變化Fig.5 Transwell detects changes in migration and invasion of different groups of cells

2.5 qPCR 檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染HTR8 /SVneo 細(xì)胞后miR-182-5p 和HIF-1α mRNA 的表達(dá)通過qRTPCR 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組中miR-182-5p 的mRNA 表達(dá)水平顯著下降（P< 0.05），HIF-1α 的mRNA 表達(dá)水平顯著上升（P< 0.05）。與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組miR-182-5p 的mRNA 表達(dá)水平升高（P<0.05），HIF-1α 的mRNA 表達(dá)水平降低（P< 0.05）。與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+ miR-182-in?hibitor 組的miR-182-5p 的mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），而HIF-1α 的mRNA 表達(dá)水平顯著升高（P<0.05，圖6）。

圖6 qPCR 檢測各組miR-182-5p 和HIF-1α mRNA 的表達(dá)Fig.6 The relative expression of mRNA in different groups

2.6 TUNEL 檢測各組細(xì)胞凋亡的變化與對照組相比，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P< 0.05）。與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P< 0.05）。與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+miR-182-in?hibitor 組細(xì)胞凋亡率顯著上升（P< 0.05，圖7）。

圖7 TUNEL 檢測各組細(xì)胞凋亡變化Fig.7 Apoptosis rate in different groups

2.7 Transwell檢測細(xì)胞遷移以及侵襲變化Tran?swell 實(shí)驗(yàn)顯示，與對照組相比，缺氧組和缺氧陰性轉(zhuǎn)染組的侵襲和遷移細(xì)胞計(jì)數(shù)均有下降（P< 0.05）；與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)均有顯著提高（P< 0.05）；與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+miR-182-inhibitor 組的侵襲和遷移細(xì)胞數(shù)顯著下降（P< 0.05，圖8）。

圖8 Transwell 檢測各組細(xì)胞遷移和侵襲變化Fig.8 Transwell detects changes in migration and invasion of different groups of cells

2.8 檢測各組蛋白水平的變化通過Western blot 檢測不同組中蛋白水平變化，結(jié)果顯示與對照組相比，低氧組 HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平升高（P< 0.05），MMP-9 蛋白表達(dá)水平降低（P< 0.05）；與缺氧陰性轉(zhuǎn)染組相比，丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組的HIF-1α、VEGF 蛋白表達(dá)水平降低，MMP-9 蛋白表達(dá)水平升高；與丙泊酚陰性轉(zhuǎn)染組比較，丙泊酚+轉(zhuǎn)染miR-182-inhibitor組HIF-1α、VEGF蛋白表達(dá)水平降低，MMP-9蛋白表達(dá)水平升高（P< 0.05，圖9）。

圖9 Western blot 檢測各組蛋白水平的變化Fig.9 Western blot detection of the relative protein expression levels in different groups

2.9 HTR?8/SVneo 細(xì)胞中HIF?1α 與miR?182?5p的相關(guān)性基于Targetscan 預(yù)測軟件的在線生物分析，miR-182-5p和HIF-1α 3'UTR具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)。為了進(jìn)一步確定miR-182-5p 和HIF-1α 之間的相關(guān)性，進(jìn)行雙熒光素酶測定。根據(jù)相應(yīng)結(jié)果，miR-182-mimics 能夠降低含有熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒的HIF-1α 3'UTR 序列所在細(xì)胞的熒光素酶活性，但它對細(xì)胞的熒光素酶活性沒有影響，其中位于序列中含有HIF-1α 3'UTR突變的熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒。見圖10。

圖10 HTR-8/SVneo 細(xì)胞中HIF-1α 與miR-182-5p 的相關(guān)性Fig.10 Correlation of HIF-1α with miR-182-5p in HTR-8/SVneo cells

3 討論

絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的正常遷移和侵襲對于子宮螺旋小動(dòng)脈的成功重塑至關(guān)重要。低氧導(dǎo)致絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞遷移侵襲能力下降，細(xì)胞凋亡增加，抑制子宮螺旋動(dòng)脈重構(gòu)［7］。因此，如何改善低氧條件下絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移侵襲能力，對治療PE有重大意義。

miR-182a-5p 是一種與炎癥、腫瘤和免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的microRNA，位于人類染色體7q32.2。研究發(fā)現(xiàn)miR-182在PE患者胎盤組織中低表達(dá)［8］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-182a-5p 在缺氧誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo細(xì)胞中的表達(dá)明顯下調(diào)，而在丙泊酚給藥后，miR-182a-5p 表達(dá)水平增加，且HTR/SVneo 細(xì)胞的生物活性恢復(fù)，轉(zhuǎn)染miR-182a-5p-inhibitor 后，則逆轉(zhuǎn)了丙泊酚對缺氧滋養(yǎng)細(xì)胞的治療作用。雙熒光素酶檢測表明，HTR/SVneo細(xì)胞系中的miR-182a-5p可以調(diào)節(jié)HIF-1α。在此基礎(chǔ)上可以推斷，丙泊酚對改善缺氧誘導(dǎo)的胎盤絨毛細(xì)胞損傷的原因可能與miR-182a-5p對HIF-1α的調(diào)控有關(guān)。

HIF-1α 是調(diào)節(jié)細(xì)胞對缺氧和低氧張力反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在免疫和炎癥過程中發(fā)揮重要作用。在正常妊娠期間，HIF-1α 會(huì)影響氧張力、細(xì)胞因子和血管生成因子釋放的變化［9］。在PE 的發(fā)病機(jī)制中HIF-1α 起著至關(guān)重要的作用［10］。研究發(fā)現(xiàn)HIF-1α在PE患者胎盤組織和缺氧條件下的HTR8/SVneo 細(xì)胞中高表達(dá)［11］。缺氧可通過上調(diào)HIF-1α調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥巨噬細(xì)胞極化異常［12］。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在缺氧刺激下，HTR8/Svneo 細(xì)胞的HIF-1α 的表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡增加，這與之前的研究一致，但是在給予丙泊酚處理后，HIF-1α 的表達(dá)降低，并抑制了細(xì)胞凋亡，增加了細(xì)胞的侵襲遷移能力。這說明丙泊酚可能通過抑制HIF-1α 的表達(dá)改善缺氧誘導(dǎo)的HTR-8/SVneo 細(xì)胞凋亡、侵襲遷移能力下降等功能。

VEGF 基因的啟動(dòng)子區(qū)域有一個(gè)HIF-1α 的結(jié)合位點(diǎn)，它在缺血缺氧條件下與HIF-1α 結(jié)合，誘導(dǎo)VEGF 的基因表達(dá)，從而誘發(fā)內(nèi)皮功能障礙［13］。MMP-9 是一種金屬蛋白酶，與妊娠早期胎盤生長和子宮重塑所需的VEGF 的釋放有關(guān)［14］。本研究表明，缺氧刺激下VEGF 表達(dá)增高，MMP-9 表達(dá)水平降低，這與之前研究一致，但是給予丙泊酚后，VEGF 表達(dá)降低，MMP-9 表達(dá)水平升高，說明丙泊酚可以調(diào)節(jié)缺氧條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)，改善缺氧下滋養(yǎng)層細(xì)胞的生物學(xué)功能。

綜上所述，丙泊酚可能通過上調(diào)miR-182 抑制HIF-1α 和VEGF 表達(dá)，并促進(jìn)MMP-9 表達(dá)，進(jìn)而改善低氧條件下滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果探討了丙泊酚在缺氧條件下滋養(yǎng)層細(xì)胞生物學(xué)功能改變及相關(guān)通道蛋白的變化，為子癇前期孕產(chǎn)婦圍術(shù)期用藥及預(yù)后提供了理論依據(jù)和新的思路。本研究的不足：（1）本文僅進(jìn)行了體外實(shí)驗(yàn)，本研究通過缺氧刺激滋養(yǎng)層細(xì)胞得到的結(jié)果不一定和臨床實(shí)際相符合，需要進(jìn)一步進(jìn)行臨床觀察和研究；（2）本研究沒有用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。關(guān)于丙泊酚對缺氧下滋養(yǎng)細(xì)胞的影響及其具體是通過哪些機(jī)制發(fā)揮作用，未來將在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察中作進(jìn)一步的探索和研究。