朱杰胄，梁驍，李婧鈺，湯蓉，李莉，李大鵬，張曦

（1.嘉興市漁業(yè)管理服務(wù)站，浙江 嘉興 314050；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，水產(chǎn)養(yǎng)殖國家級實驗教學(xué)示范中心，長江經(jīng)濟(jì)帶大宗水生生物產(chǎn)業(yè)綠色發(fā)展教育部工程研究中心，池塘健康養(yǎng)殖湖北省工程實驗室，湖北 武漢 430070；3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水生生物研究所，浙江 杭州 310021）

近年來，隨著人類合理膳食營養(yǎng)意識的普及，對高營養(yǎng)價值的蛋白需求日益增加。魚類的主要食用部分肌肉是富含多不飽和脂肪酸（PUFA）和平衡氨基酸的優(yōu)質(zhì)蛋白源[1]。但在魚類養(yǎng)殖過程中容易遭受氧化應(yīng)激，大量產(chǎn)生的活性氧ROS 會導(dǎo)致DNA、類固醇成分以及細(xì)胞膜不飽和脂質(zhì)的過氧化，損傷器官[2]。而魚類肌肉中這種脂質(zhì)氧化會損失膜功能和流動性，最終導(dǎo)致魚體營養(yǎng)的缺失，影響魚體的生長及品質(zhì)[3]。

生物和非生物因素影響魚類抗氧化防御反應(yīng)。魚類的行為和環(huán)境因素，例如食物種類、溫度、溶解氧、環(huán)境毒素、寄生蟲等，均可以增強(qiáng)或減弱抗氧化能力[4]。酶促抗氧化防御主要是由SOD、GSH-Px 以及CAT 完成。其中CAT 和GSH-PX 是機(jī)體酶促抗氧化系統(tǒng)中的重要酶類，用以清除體內(nèi)過量的ROS[5,6]。SOD 通過促進(jìn)O2-轉(zhuǎn)變?yōu)镠2O2的方式來清除體內(nèi)的O2-[7]。T-AOC 用以衡量機(jī)體的抗氧化能力，反映其清除自由基的能力[8]。游泳運(yùn)動是貫穿魚類生活史的行為運(yùn)動，對維持魚類生命活動具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，游泳訓(xùn)練能促進(jìn)養(yǎng)殖魚類的生長，通過適宜的水流速度可誘導(dǎo)養(yǎng)殖魚類游泳運(yùn)動，提高攝食及非特異性免疫等[10-13]，而這均與機(jī)體抗氧化能力的提升密切相關(guān)[4]。對軟骨魚類與硬骨魚類的研究發(fā)現(xiàn)，魚類抗氧化能力取決于游泳性能的強(qiáng)弱，而不是其進(jìn)化關(guān)系[14]。可見，游泳運(yùn)動對養(yǎng)殖魚類抗氧化能力有直接影響[15]，因此，越來越多的研究著眼于通過游泳訓(xùn)練提升魚類養(yǎng)殖品質(zhì)。

草魚（Ctenopharyngodon idellus）是我國重要的淡水養(yǎng)殖種類，2021 年淡水養(yǎng)殖魚類總產(chǎn)量為2 586.38 萬t，其中草魚的產(chǎn)量為557.1 萬t，占比約21.5%[16]。如何能夠更好更高效地養(yǎng)殖高品質(zhì)草魚是水產(chǎn)養(yǎng)殖關(guān)注的重點問題之一。當(dāng)前草魚可以通過流道養(yǎng)殖、工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖誘導(dǎo)其進(jìn)行逆流游泳來養(yǎng)殖。相關(guān)研究多側(cè)重于流速運(yùn)動訓(xùn)練促進(jìn)草魚的長生[17]，但肝臟、肌肉是草魚易受ROS 損傷的組織，不同強(qiáng)度的運(yùn)動訓(xùn)練對草魚不同肌肉部位有何影響尚未明確報道。本試驗采用封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，探討了不同水流刺激對草魚幼魚的長期運(yùn)動訓(xùn)練，對草魚幼魚紅肌、腹肌、尾肌、肝臟抗氧化能力的影響，旨在確定草魚適宜流速范圍，為草魚流道養(yǎng)殖模式提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗用草魚體質(zhì)量（92.76±6.63）g，來源于湖北省黃岡市團(tuán)鳳縣百容良種場，在“華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院教學(xué)實習(xí)基地”完成整個實驗魚的養(yǎng)殖過程。

利用總蛋白、相關(guān)抗氧化能力測定試劑盒和酶標(biāo)儀，測定草魚紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟的相關(guān)抗氧化酶酶活和總抗氧化能力；利用RNA 提取試劑盒、cDNA 合成試劑盒、PCR 擴(kuò)增試劑盒和實時熒光定量PCR 儀，完成草魚紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟的相關(guān)抗氧化基因的熒光定量PCR 實驗。

1.2 方法

1.2.1 實驗魚飼養(yǎng)

將草魚放在直徑1 m、水深78 cm 的塑料圓柱魚缸暫養(yǎng)2 個月（4—6 月），期間溶氧水平保持在7 mg/L，水溫大約在22 ℃～24 ℃之間。在飼養(yǎng)期間，每天投喂草魚2 次。然后進(jìn)行為期70 d 的養(yǎng)殖試驗，將草魚分別在0 bl/s（對照組）、0.5 bl/s、1 bl/s 和1.5 bl/s 流速下，每組3 個平行養(yǎng)殖缸，每缸14 尾魚，實驗設(shè)計參考前期研究成果[18]。

1.2.2 樣品采集與測定

訓(xùn)練結(jié)束后，每缸隨機(jī)取9 尾魚，生長相關(guān)數(shù)據(jù)參考已發(fā)表研究結(jié)果[18]。采樣魚用MS-222（140 mg/L）麻醉，每尾草魚采集游泳運(yùn)動相關(guān)的紅肌、腹肌、尾肌以及肝臟組織，置于液氮中速凍后于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)相關(guān)試劑盒說明書測定總蛋白質(zhì)濃度、T-AOC、SOD、CAT、GSH-Px 酶活?？偟鞍踪|(zhì)濃度采用BCA 法，T-AOC 采用ABTS 法，SOD 采用羥胺法，CAT 采用鉬酸銨法，GSH-Px 采用酶促反應(yīng)及顯色反應(yīng)兩步進(jìn)行測定。

基因表達(dá)量測定根據(jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)獲得引物序列[19]，交由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列表見表1。根據(jù)試劑盒說明書指示提取RNA、cDNA 的合成和熒光定量PCR 的擴(kuò)增來完成實驗，使用TRIpure Reagent TRIpure Reagent 試劑盒提取RNA，使用試劑盒HifairⅢ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，使用PCR擴(kuò)增試劑盒HieffqPCR SYBRGreen Master Mix（LowRox）進(jìn)行熒光定量。

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

采用2-ΔΔCt法來計算抗氧化基因的相對表達(dá)量，在檢測實驗數(shù)據(jù)的正態(tài)分布和方差齊性后，使用SPSS 21 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）和顯著檢驗，用鄧肯檢驗法（Duncan）進(jìn)行多重比較分析，當(dāng)差異在P＜0.05 時被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義，圖中以不同小寫英文字母表示顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同游泳速度對草魚紅肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚紅肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達(dá)量有顯著性差異（P＜0.05，圖1）。同0 bl/s流速組相比，0.5 bl/s 與1 bl/s 流速下草魚紅肌抗氧化基因cat 和gpx 表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），但與1.5 bl/s 流速組無顯著差異（P＞0.05）。不同游泳速度處理下草魚紅肌的CAT、GSH-Px 和T-AOC 活性無顯著性差異（P＞0.05），而SOD 有顯著性差異（P＜0.05），1.5 bl/s 流速下草魚紅肌SOD 活性顯著低于其他流速組（P＜0.05，圖2）。

圖1 草魚紅肌抗氧化基因表達(dá)量Fig.1 Relative expression levels of antioxidant gene transporters of grass carp red muscle

圖2 草魚紅肌抗氧化酶活性Fig.2 Antioxidant enzyme activities of grass carp red muscle

2.2 不同游泳速度對草魚腹肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚腹肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05，圖3）。不同游泳速度處理下草魚腹肌的CAT 活性和T-AOC 無顯著性差異（P＞0.05），而GSH-Px 和SOD 有顯著性差異，1 bl/s 流速下草魚腹肌GSH-Px 活性顯著高于其他流速組；1.5 bl/s 流速下草魚腹肌SOD 活性顯著高于其他流速組（P＜0.05，圖4）。

圖3 草魚腹肌抗氧化基因表達(dá)量Fig.3 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp abdominal muscle

圖4 草魚腹肌抗氧化酶活性Fig.4 Antioxidant enzyme activities of grass carp abdominal muscle

2.3 不同游泳速度對草魚尾肌抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚尾肌抗氧化基因cat、gpx和sod 表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05，圖5）。不同游泳速度處理下草魚尾肌的CAT、GSH-Px、SOD 和T-AOC 均無顯著性差異（P＞0.05，圖6）。

圖5 草魚尾肌抗氧化基因表達(dá)量Fig.5 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp caudal muscle

圖6 草魚尾肌抗氧化酶活性Fig.6 Antioxidant enzyme activities in grass carp caudal muscle

2.4 不同游泳速度對草魚肝臟抗氧化能力的影響

不同游泳速度下草魚肝臟抗氧化基因cat、gpx和sod 表達(dá)量無顯著性差異（P＞0.05，圖7）；肝臟的CAT、GSH-Px 和 SOD 活性無顯著性差異（P＞0.05），而T-AOC 差異顯著，1.0 bl/s 和1.5 bl/s流速下肝臟T-AOC 活性顯著高于0 bl/s 流速組（P＜0.05，圖8）。

圖7 草魚肝臟抗氧化基因表達(dá)量Fig.7 Relative expression levels of antioxidant gene transporters in grass carp liver

圖8 草魚肝臟抗氧化酶活性Fig.8 Antioxidant enzyme activities of grass carp liver

3 討論

肝臟與肌肉是養(yǎng)殖魚類維持正常生理代謝的關(guān)鍵組織，極易遭受ROS 損傷。適宜的水流速度刺激有利于魚類的生長及生理代謝穩(wěn)態(tài)，而過高的流速也會導(dǎo)致生長和免疫性能的下降[20-22]?；诖?，本研究測定了草魚不同游泳狀態(tài)下紅肌、腹肌、尾肌及肝臟的抗氧化性能，以期明確流速對養(yǎng)殖草魚的影響。

早先研究以1.5 bl/s 或以下的流速對多種魚類訓(xùn)練，可以提升其紅肌、白肌生長與有氧代謝的能力[9,23]。游泳訓(xùn)練還可以通過線粒體生物合成途徑影響魚類肌纖維生理代謝過程，對紅肌與白肌生理代謝的作用不盡相同[24,25]，但尚未明確肌肉中抗氧化能力的變化。隨著研究不斷深入，越來越多的報道闡述了流速對養(yǎng)殖魚類肌肉抗氧化性的影響。對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）進(jìn)行不同的運(yùn)動強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練，中等強(qiáng)度的游泳訓(xùn)練為2.0 bl/s，訓(xùn)練時間為每天23.5 h；高強(qiáng)度游泳訓(xùn)練為3.2 bl/s，每天訓(xùn)練2 h，訓(xùn)練10 d 后同未訓(xùn)練的虹鱒比較，僅高強(qiáng)度訓(xùn)練可以提升虹鱒紅肌gpx-1 基因表達(dá)量，但兩種運(yùn)動強(qiáng)度對虹鱒白肌、紅肌抗氧化酶活性均無影響[24]。歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla L.）在持續(xù)游泳運(yùn)動過程中通過增強(qiáng)有氧代謝的方式來抵消ROS 過度產(chǎn)生的影響，但游泳運(yùn)動對紅肌SOD、CAT 及GSH-Px 活性并無顯著的調(diào)節(jié)效果[26]。而不同游泳能力的軟、硬骨魚尾部肌肉組織中CAT、GSH-Px 及SOD 水平具有明顯差異[14]。因此，在1.5 bl/s 流速下，草魚紅肌與腹肌SOD 活性變化的顯著差異表明,該流速下腹肌中清除O2-的能力提升，紅肌中清除O2-的能力減弱，這可能是草魚肌肉有氧代謝適應(yīng)高流速訓(xùn)練的結(jié)果。而1.0 bl/s 流速顯著提升了腹肌GSH-Px 活性，表明1.0 bl/s 流速下草魚腹肌獲得了更強(qiáng)清除體內(nèi)過量的ROS 的能力?？梢娺m當(dāng)?shù)挠斡居?xùn)練可以影響草魚抗氧化途徑來調(diào)控肌肉相關(guān)生理活動。

魚類組織中肝臟通常具有較高的抗氧化酶活性[27-30]，這在本研究中也有所體現(xiàn)，可以看到肝臟的抗氧化酶活性明顯高于肌肉組織。在其他魚類相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）在0 bl/s、0.5 bl/s、1.0 bl/s 和2.0 bl/s 游泳速度下，肝臟T-AOC 和CAT 及SOD 的活性隨游泳速度的增加先增加后降低，在1.0 bl/s 時活性最大[15]。在0 bl/s、1 bl/s、2 bl/s、4 bl/s 不同流速的訓(xùn)練下，隨著強(qiáng)度的增加，黑鯛（Sparus macrocephalus）肝臟GSH-Px 含量和CAT 活性均呈現(xiàn)上升的趨勢，而其T-AOC 沒有顯著性變化[31]。本研究中，隨著流速增加，草魚肝臟T-AOC 活性逐漸提升，表明清除自由基的能力增強(qiáng)，可見游泳訓(xùn)練增強(qiáng)了草魚肝臟抗氧化性能。

綜上所述，不同流速下魚類的抗氧化能力的變化或許與魚類種類相關(guān)。同時不同流速下草魚各組織中抗氧化能力改變存在差異，這可能是草魚機(jī)體調(diào)節(jié)能量代謝平衡，以適應(yīng)不同流速的結(jié)果。整體來講，在實際生產(chǎn)中可以適當(dāng)改變水的流速來促進(jìn)草魚的生長。