江逸楠，秦舒蕾，季瑾玉，張瑩瑩，魏文志，楊輝

（揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇，揚州 225007）

1962 年Ritossa 在果蠅（Drosophila melanog aster）幼蟲實驗中首次發(fā)現(xiàn)了熱激蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）[1]。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了高溫能抑制絕大多數(shù)蛋白質(zhì)的合成，與此同時也啟動了一套新的蛋白合成，此過程被稱之為熱激反應(yīng)（Heat shock response,HSR）[2]。HSR 是生物體對外界環(huán)境應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)，普遍存在于生物界中，該反應(yīng)過程中生成的蛋白稱為HSPs[3]。但是，隨著研究成果的不斷積累，HSPs 已經(jīng)不僅僅具有高溫?zé)峒畏矫娴纳飳W(xué)意義。動物在應(yīng)對其他不良因素，如低氧、重金屬污染、活性氧、鹽脅迫以及病菌染毒等逆境條件時，也會產(chǎn)生相應(yīng)的應(yīng)激改變來適應(yīng)環(huán)境[4]。同時，HSPs 作為分子伴侶，會參與蛋白多肽鏈的折疊和組裝、受損蛋白復(fù)性、免疫識別、細(xì)胞凋亡等生理活動，起到保護(hù)機(jī)體的作用。在正常生理條件下HSPs的表達(dá)量非常低，而在環(huán)境脅迫、病理和生理條件下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)HSPs 的合成則會急劇增長[5]。

水產(chǎn)養(yǎng)殖為世界各地數(shù)億人提供了食物來源。隨著水產(chǎn)的集約化養(yǎng)殖使生產(chǎn)力顯著提高，導(dǎo)致了疾病流行，涉及細(xì)菌、真菌、病毒和寄生蟲等病原體。因此，需要控制疾病暴發(fā)，以維持產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)性發(fā)展，滿足人們不斷增加的對動物蛋白日益增長的需求。目前，用常規(guī)方法（如抗生素）預(yù)防和治療水生動物疾病取得的成效有限，且過量用抗生素會導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性增加，影響藥物的使用效果。疫苗接種已有效控制了許多水產(chǎn)養(yǎng)殖的疾病，但需要結(jié)合良好的管理、營養(yǎng)供給和其他疾病控制方法才能實現(xiàn)。因此，這需要開發(fā)新的方法和技術(shù)，達(dá)到不損害環(huán)境而改善養(yǎng)殖動物健康的目的。水生動物生活在高溫傳導(dǎo)性的水生環(huán)境中，各種應(yīng)激包括水溫的變化、病原的刺激、水中污染物等都會影響水生動物HSPs 的表達(dá)?？梢栽隰~類的所有生活史階段研究HSPs 的表達(dá)和調(diào)控。本文綜述了水產(chǎn)動物HSPs的功能和作用，著重介紹其在水產(chǎn)動物免疫病害防控中的重要作用。

1 HSPs 的分類與特征

HSPs 在進(jìn)化中高度保守，同一家族內(nèi)高度同源，這也說明其在生物生命活動中具有重要的作用。HSPs 家族根據(jù)同源程度及分子量由小到大可分為5 類：sHsps、Hsp60、Hsp70、Hsp90 和Hsp110[2,6]。它們一般多分布在細(xì)胞質(zhì)和部分細(xì)胞器如線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，少量分布于細(xì)胞核內(nèi)。HSPs 是分子伴侶，有助于多肽折疊和寡聚化，保護(hù)蛋白質(zhì)免受不可逆變性、重折疊或受損蛋白質(zhì)降解，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運到膜結(jié)合細(xì)胞區(qū)室中，有助于抗病。水產(chǎn)養(yǎng)殖期間疾病控制主要關(guān)注的是HSP 家族的Hsp70，但sHsps、Hsp90 和Hsp60 以及Hsp40 似乎也可以改善病原體感染[7-10]。HSP 家族如Hsp90 和Hsp70 對其他細(xì)胞蛋白的折疊和組裝至關(guān)重要[11]。它們和其他分子伴侶也參與調(diào)節(jié)折疊、易位和聚集之間的動力學(xué)分配，在免疫、凋亡和炎癥反應(yīng)中具有更廣泛的作用[12]。sHsps 為結(jié)構(gòu)紊亂蛋白質(zhì)的ATP 非依賴性結(jié)合提供寡聚平臺，防止細(xì)胞受到應(yīng)激時蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆變性。然而，這些伴侶家族的主要功能是通過ATP 驅(qū)動的變構(gòu)重排來結(jié)合和折疊新生蛋白。盡管每個伴侶的分子結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制不同，但HSPs可以通過形成伴侶蛋白、共伴侶蛋白和輔助蛋白的細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)起到協(xié)同發(fā)揮作用。

sHsps 主要存在于植物中，依據(jù)其在細(xì)胞內(nèi)的定位，可將sHsps 分為五大類：兩類定位于細(xì)胞質(zhì)，即胞質(zhì)I 類和胞質(zhì)Ⅱ類；其它三類分別定位于線粒體、葉綠體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在最適生長溫度下檢測不到sHsps，而經(jīng)過熱激誘導(dǎo)后，sHsps 的合成量迅速增加。通常情況下，sHsp 單體由一個保守的α-晶體蛋白結(jié)構(gòu)域（側(cè)翼為氨基末端序列和羧基末端延伸部分）組成，組裝成低聚物[13-15]。當(dāng)環(huán)境壓力傳遞時，sHsps 釋放的蛋白質(zhì)要么自發(fā)重折疊，要么在依賴ATP 的HSP 如Hsp70 發(fā)生重折疊[16]。當(dāng)暴露于應(yīng)激條件下，sHsps 的主要作用是保護(hù)蛋白質(zhì)免于不可逆變性。

Hsp60 是結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的HSP，由兩個背對背放置的環(huán)組成，每個環(huán)都由8～9 個不同但相關(guān)的ATP水解單體組成。這些單體由3 個功能域組成[17]。Hsp60 通過疏水鍵、極性鍵和帶電荷的氨基酸殘基與許多不同的底物結(jié)合。底物通常在折疊后期與Hsp60 結(jié)合，并在ATP 水解和ADP+Pi 解離時釋放。細(xì)胞骨架蛋白-肌動蛋白和微管蛋白依賴Hsp60進(jìn)行正確折疊[18,19]。Hsp60 具有使感染期間變性的蛋白質(zhì)重折疊的能力，并可能與無脊椎動物免疫應(yīng)答中涉及的肽和蛋白質(zhì)相互作用。

Hsp70（分子量大約在72～80 kDa）是研究最廣泛的HSP。與其他HSPs 功能相似，Hsp70 不僅作為分子伴侶在跨膜運輸、轉(zhuǎn)位、蛋白質(zhì)復(fù)合物組裝和分解等方面發(fā)揮重要作用[20]，而且被誘導(dǎo)的Hsp70可作為細(xì)胞因子參與機(jī)體的先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)[21]。環(huán)境、生理和病理原因可調(diào)控Hsp70的合成。Hsp70 可參與機(jī)體的免疫調(diào)控反應(yīng)。當(dāng)受到免疫刺激時，Hsp70 的表達(dá)量迅速增高[22-24]。有研究指出，腫瘤細(xì)胞分泌的Hsp 復(fù)合肽能激活機(jī)體的免疫響應(yīng)[25]。Hsp70 也能抑制細(xì)菌表位導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。Hsp70 能顯著增加調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞（Regulatory cells,Treg）的免疫活性，達(dá)到下調(diào)炎性因子表達(dá)的目的，提高Hsp70 的表達(dá)可治療或緩解多種免疫疾病。

Hsp90 是生物進(jìn)化過程中高度保守的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，具有多種生物學(xué)功能。Hsp90 也是在細(xì)胞正常生理條件下或應(yīng)激誘導(dǎo)下大量產(chǎn)生的一種ATP 依賴的二聚體，由3 個結(jié)構(gòu)域的單體組成。在真核生物中，Hsp90 主要分布于胞質(zhì)、核質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體及葉綠體等。線粒體中Hsp90 的同系物為腫瘤壞死因子受體關(guān)聯(lián)蛋白（tumor necrosis factor receptor-associated protein 1,TRAP1）。Hsp90α 的非傳統(tǒng)方式分泌可由低氧刺激和轉(zhuǎn)化生長因子TGFα 引起，可使Hsp90α 成為潛在的創(chuàng)傷愈合劑。Hsp90 可以調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中近100 種蛋白質(zhì)，而這些蛋白質(zhì)大多數(shù)與細(xì)胞分化、生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等作用相關(guān)。Hsp90 在機(jī)體的各個方面都發(fā)揮著重要的作用，包括：蛋白質(zhì)運輸、免疫調(diào)節(jié)和抗原遞呈等。因此，研究Hsp90的功能將為水產(chǎn)動物疾病的治療提供全新思路。

2 水產(chǎn)動物HSPs 的表達(dá)調(diào)節(jié)

2.1 環(huán)境應(yīng)激影響HSPs 的表達(dá)

HSPs 的表達(dá)受多種非生物和生物因素的影響。通常，溫度的變化，尤其是熱應(yīng)激刺激，可明顯誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生多種類型的HSP[26,27]。如高溫脅迫可提高日本沼蝦（Macrobrachium nipponense）Hsp60 和Hsp 90 的表達(dá)量[28]。低溫脅迫也會誘導(dǎo)黃姑魚（Nibea albiflora）、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）等的HSP 含量上升[29,30]。水體鹽度變化也會誘導(dǎo)產(chǎn)生HSP，相關(guān)內(nèi)容已經(jīng)在斜帶石斑魚（Epinephelus coioides）、菲律賓簾蛤（Ruditapes philippinarum）、達(dá)氏鰉（Huso dauricus）、馬氏珠母貝（Pinctada martensi）、射肋珠母貝（Pinctada radiata）和金烏賊（Sepiaesculenta）等有研究報道[31-35]。與鹽度變化應(yīng)激有關(guān)的滲透壓變化，同樣可誘導(dǎo)大鱗大馬哈魚（Oncorhynchus tshawyt scha）和大西洋鮭（Salmo salar）相關(guān)HSPs 的表達(dá)變化[36,37]。環(huán)境污染物同樣只是誘導(dǎo)水產(chǎn)動物HSPs 表達(dá)的因子。暴露于環(huán)境污染物中（包括農(nóng)藥、重金屬、有機(jī)物等）可以檢測到各種HSPs 水平的升高[38-40]，如鳙（Aristichthys nobilis）經(jīng)亞硝酸鹽氮脅迫后，可誘導(dǎo)其體內(nèi)Hsp70 表達(dá)量的升高[41]；經(jīng)重金屬Cd、Pb 暴露后，可誘導(dǎo)褐菖鲉（Sebastiscus marmoratus）Hsp70 的表達(dá)[42]。也有研究顯示，經(jīng)過鉛的脅迫，日本沼蝦的Hsp60 和Hsp90 mRNA 表達(dá)量降低[43]。太平洋真寬水蚤（Eurytemora pacifica）經(jīng)銅、鋅、鎘離子脅迫后Hsp70 于1/8 的LC50濃度時表達(dá)量達(dá)到峰值[44]。魚類的HSP 被認(rèn)為是農(nóng)藥毒性的潛在生物標(biāo)識[39]。水體中溶氧量變化同樣影響水生生物HSPs 表達(dá)量，如低氧脅迫后，野生蛤仔、斑馬蛤、白蛤、白斑馬蛤4 種蛤仔的HSPs 表達(dá)量均提高[45]。在低氧脅迫后，斑馬魚（Danio rerio）鰓中HSPs 基因的表達(dá)量升高，顯著高于心臟、皮膚等組織[46]。有研究指出，激素可以調(diào)節(jié)魚類的HSPs 水平[47]。甲狀腺激素可使牙鲆（Paralichthys olivaceus）Hsp90α 表達(dá)量上調(diào)[48]。升高皮質(zhì)醇水平可抑制鮭（Oncorhynchus keta）鰓中Hsp30 的表達(dá)、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）肝臟和鰓中Hsp70 的表達(dá)以及羅非魚（Oreochromis mossambicus）鰓中Hsp70 的表達(dá)[49-51]。也有研究指出外源性地添加生長激素分泌促進(jìn)劑海沙瑞林（Hexarelin）和催乳素藥理興奮劑舒必利（Sulpiride），可以顯著抑制黃錫鯛（Sparus sarba）Hsp70 的表達(dá)[52,53]。因此，各種非生物因素包括溫度、鹽度、環(huán)境污染物、激素等的刺激，均能夠顯著影響HSPs 的表達(dá)水平，但是關(guān)于HSPs 是否能作為可靠性強的環(huán)境污染物生物標(biāo)識還需要進(jìn)一步的探討。

2.2 病原微生物感染刺激水生動物HSPs 的表達(dá)

生物因素影響HSP 的表達(dá)主要指病原微生物的感染。病原微生物在自然環(huán)境中會對水生動物的健康產(chǎn)生有害影響。強毒病原體可能通過釋放溶解細(xì)胞的物質(zhì)來損壞細(xì)胞內(nèi)的成分，改變細(xì)胞穩(wěn)態(tài)并誘導(dǎo)HSPs。病原暴露引起的炎性病理改變了細(xì)胞水平的生理過程，如離子調(diào)節(jié)和酸堿平衡等。宿主免疫細(xì)胞（吞噬細(xì)胞和粒細(xì)胞）釋放細(xì)胞外物質(zhì)，例如活性氧、陽離子肽、溶菌酶和細(xì)胞因子，它們是各種HSPs 的已知誘導(dǎo)劑，均可誘導(dǎo)HSPs 的表達(dá)。

目前已有大量研究報道了關(guān)于細(xì)菌性病原感染誘導(dǎo)水生動物HSPs 的表達(dá)。溶藻弧菌（V.alginolyticus）感染羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii），會在24 小時內(nèi)增加肝胰腺中Hsp70 表達(dá)量[54]。嗜水氣單胞菌感染中華鱘（Acipenser sinensis）后，其脾臟與腎臟中Hsp70 表達(dá)量升高[55]。吉富羅非魚在感染無乳鏈球菌后，可誘導(dǎo)其肝臟中Hsp70 的表達(dá)[56]。鰻弧菌在急性感染虹鱒和鯛后，肝臟中Hsp70 的表達(dá)在短時間內(nèi)達(dá)到峰值[57]。溶藻弧菌（V.alginolyticus）是三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）乳化病的主要病原體，在感染后的3 h、12 h和24 h 內(nèi)，均顯著誘導(dǎo)Hsp70 的表達(dá)[58]。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）能誘導(dǎo)斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）Hsp90 的表達(dá)上調(diào)[59]。南美白對蝦（Litopenaeus vannamei）在感染金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和溶藻弧菌后，能夠誘導(dǎo)鰓和血淋巴HSP 相關(guān)蛋白表達(dá)量上調(diào)[60]。溶藻弧菌的感染能夠引起南美白對蝦Hsp60 和Hsp70 的表達(dá)變化[61]。在雙殼類菲律賓蛤仔中，鰻弧菌的感染能夠瞬間促進(jìn)血細(xì)胞合成sHsps（VpsHSP-1 和VpsHSP-2），保護(hù)病原體暴露時發(fā)生變性的蛋白質(zhì)[62]。砂海螂（Mya arenaria）感染燦爛弧菌（Vibrio splendidus）后，血細(xì)胞中的Hsp90 表達(dá)在1 h 后顯著上調(diào)，但是，2 h 和3 h 后，表達(dá)量又有所降低[63]。還在文蛤（Meretrix meretrix）中發(fā)現(xiàn)一種組成型的Hsp71，在副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的感染下，肝胰腺和鰓中的表達(dá)量增加了2 倍[64]。鰻弧菌感染后8h，海灣扇貝（Argopecten irradians）體內(nèi)Hsp70 的表達(dá)量持續(xù)升高，并保持了16 h。大部分研究表明，在水產(chǎn)病原細(xì)菌的感染下HSPs 的表達(dá)都會上調(diào)，這暗示著HSPs 與水產(chǎn)動物的免疫防御功能緊密相聯(lián)。

除了細(xì)菌性病原外，病毒感染也影響水產(chǎn)動物HSPs 的表達(dá)。CyHV-2 病毒感染后，可誘導(dǎo)異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）肝臟中Hsp70 表達(dá)上調(diào)[65]。經(jīng)草魚呼腸孤病毒（Grass carp reovirus，GCRV）感染后，草魚的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（Cytokine-Induced Killer，CIK）中Hsp70 表達(dá)量上調(diào)[66]。WSSV 感染抑制了凡納濱對蝦鰓、腸、血細(xì)胞和肌肉中Hsp60 的表達(dá)，而促進(jìn)了鰓、肝胰腺、血細(xì)胞、腸、類淋巴和肌肉中Hsp90 的表達(dá)[67]。感染W(wǎng)SSV 后，中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）和鋸緣青蟹（Scylla serrata）肝胰腺中Hsp70 的轉(zhuǎn)錄水平顯著提高，但是，鋸緣青蟹血淋巴中Hsp90 的表達(dá)被抑制[68,69]。諾達(dá)病毒（Nodaviridae）感染斜帶石斑魚時，Hsp90 的表達(dá)也會增加[70]。大菱鲆彈狀病毒（Scophthalmus maximus rhabdovirus，SMRV）會上調(diào)牙鲆胚胎細(xì)胞系中三種hsp40 基因的表達(dá)，顯著刺激PoHsp40A4，減弱PoHsp40B6 和PoHsp40B11 的產(chǎn)生[71]。傳染性造血器官壞死病毒（Infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV）在感染鮭胚胎細(xì)胞系CHSE-214 時，Hsp90 的高表達(dá)量暗示著HSP與魚類疾病之間的關(guān)系[72]。這種病原微生物對水產(chǎn)動物HSPs 的誘導(dǎo)表達(dá)更多是宿主本身針對病原入侵的一種防御反應(yīng)，也表明HSPs 與水產(chǎn)動物的多種免疫抗病功能相關(guān)。

3 HSPs 與水生動物免疫的關(guān)系

最初，HSP 對細(xì)胞應(yīng)激源的反應(yīng)被認(rèn)為是短期的功能性反應(yīng)，具有一系列基本的細(xì)胞保護(hù)功能[12]。然而，現(xiàn)在越來越多的研究認(rèn)為，HSPs 在脊椎動物和無脊椎動物免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)中起重要作用[12,73,74]。特別是在T 細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中，HSPs 可充當(dāng)細(xì)胞間信號分子，誘導(dǎo)多種細(xì)胞類型改變其活性，產(chǎn)生炎性產(chǎn)物，如細(xì)胞因子和黏附素。細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性HSP 是潛在的危險信號[75]，因為它們在各種應(yīng)激條件下被上調(diào)，由應(yīng)激、感染、壞死或腫瘤細(xì)胞釋放，而不是從凋亡細(xì)胞釋放。釋放出來的HSP 可以通過受體介導(dǎo)的相互作用向抗原呈遞細(xì)胞傳遞成熟信號肽。在哺乳動物免疫應(yīng)答中，特定的HSP 是先天性和特異性免疫的有效誘導(dǎo)劑。它們激活樹突細(xì)胞和自然殺傷T 細(xì)胞，增加抗原對效應(yīng)細(xì)胞的呈遞，增強T 細(xì)胞和體液對其特異性抗原的應(yīng)答[76]。同樣，細(xì)胞外內(nèi)源性HSP 可以觸發(fā)核因子NF-κB向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞核的易位[77]。

目前對水生動物胞外內(nèi)源性HSP 的影響尚未有全面的研究。然而，HSPs 是最古老和高度保守的蛋白質(zhì)之一，推測內(nèi)源性HSPs 也將作為危險信號，可以激活動物體內(nèi)的先天性和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)，保護(hù)動物免受（病原性）應(yīng)激。HSPs 對水生動物免疫有影響。通過冷熱應(yīng)激誘導(dǎo)增加了鹵蟲（Artemia）Hsp70 表達(dá)的個體，在受到坎氏弧菌（Vibrio campbelii）感染后其存活率顯著高于對照組[78,79]。通過RNAi 敲除鹵蟲胚胎的Hsp70，其在坎氏弧菌感染下的存活率顯著低于對照組[80,81]；增強了翡翠股貽貝（Perna viridis）Hsp70 的表達(dá)，能夠有效防止溶藻弧菌（V.alginolyticus）感染[82]。通過短時間的熱應(yīng)激增加了斑節(jié)對蝦Hsp70 的表達(dá)，增強對與鰓相關(guān)病毒的抗性[83]。

除了宿主HSPs 在介導(dǎo)免疫應(yīng)答中的作用外，越來越多的證據(jù)表明，微生物HSPs 經(jīng)常是病原體本身的主要抗原之一。宿主對病原微生物的感染可能導(dǎo)致HSPs 合成增加。HSPs 是引發(fā)大部分免疫反應(yīng)的突出抗原。在許多感染中，特別是Hsp60 和Hsp70 可以刺激產(chǎn)生高水平的抗體應(yīng)答。Hsp60 和Hsp70 家族的成員是許多蠕蟲、原生動物和細(xì)菌感染中抗體的主要靶點。結(jié)合時，Hsps 激活TLR，將炎性信號傳遞給先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，達(dá)到促進(jìn)抗病的效果。外源性的HSPs 能誘導(dǎo)免疫細(xì)胞表達(dá)和分泌細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6 和黏附分子，如E-選擇素和細(xì)胞間細(xì)胞黏附分子可以激活NF-κB 和Toll/IL-1 信號通路，產(chǎn)生針對感染的免疫應(yīng)答[21,84]。一種外源性原生動物的重組Hsp70 能夠激活金魚巨噬細(xì)胞，刺激促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶的表達(dá)，誘導(dǎo)金魚巨噬細(xì)胞產(chǎn)生強烈的一氧化氮反應(yīng)[85,86]。

蝦和雙殼貝類缺乏適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。它們清除病原體的能力取決于先天性免疫的細(xì)胞和體液機(jī)制的合作。大量研究指出，水生無脊椎動物感染細(xì)菌后血細(xì)胞中HSPs 的表達(dá)量提高，這種提高與血淋巴中的抗菌肽和吞噬活性緊密相關(guān)。但是，這些抗菌肽相關(guān)基因的表達(dá)與HSPs 的直接聯(lián)系還尚不清楚。HSPs 被認(rèn)為是通過修復(fù)損傷或保護(hù)自身免受自氧化引起的自溶和凋亡來維持吞噬細(xì)胞[87]。在脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）的刺激下，草魚（Ctenopharyngodon idella）體內(nèi)的hsp70 基因在12種免疫相關(guān)組織中均表達(dá)增強，故Hsp70 的釋放有助于草魚的免疫抗病[88]。在適應(yīng)性免疫過程中，HSPs 可能通過組裝主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex,MHC）-肽復(fù)合體在抗原呈遞中發(fā)揮不可或缺的作用，如激活T 細(xì)胞以破壞或協(xié)同殺死病原體和受感染的功能障礙細(xì)胞[89,90]。因此，HSPs 廣泛參與到水生動物的先天性免疫和獲得性免疫中，在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫中發(fā)揮重要的作用。對HSPs 功能的研究，也將有助于揭示保護(hù)水產(chǎn)動物的策略。

4 調(diào)控HSPs 增強水生動物的抗病能力

4.1 促進(jìn)水生動物HSPs 的表達(dá)

眾多的研究表明，提高機(jī)體HSPs 的合成有助于增強水生動物在病原微生物感染和應(yīng)激條件下的成活率。而刺激HSPs 表達(dá)的常用方案是短暫的非致死性熱休克，并在非應(yīng)激條件下孵育數(shù)小時[91]。非致死性熱休克會激活HSPs 的轉(zhuǎn)錄和合成，HSPs可保護(hù)機(jī)體抵抗隨后的應(yīng)激源，但關(guān)于HSPs 在疾病發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少。探索有效的非應(yīng)激性HSPs 的誘導(dǎo)方法對于水生動物疾病防控有著潛在的價值。

化學(xué)性誘導(dǎo)劑也可以促進(jìn)水生動物HSPs 的表達(dá)。姜科、天南新科植物根莖中提取的二酮類化合物——姜黃素（Curcumin），是姜黃屬植物姜黃的主要成分，可在K562 細(xì)胞中誘導(dǎo)Hsp70 表達(dá)[92]。其添加至飼料中后投喂，可誘導(dǎo)草魚體內(nèi)Hsp70 的表達(dá)[93]。來源于仙人掌中的TEX-OE 是一種有效的內(nèi)源性HSPs 非應(yīng)激誘導(dǎo)劑[94]。通過浸泡或作飼料添加劑應(yīng)用的Pro-Tex 可加速魚類和貝類體內(nèi)HSPs的表達(dá)，增強應(yīng)激耐受力[95,96]。Pro-Tex 可作為誘導(dǎo)Hsp70 表達(dá)的增強劑，通過誘導(dǎo)不同的免疫因子來增強波斯鱘（Acipenser persicus）對嗜水氣單胞菌ATCC7966 的抵抗能力[97]。額外添加TEX-OE 也能夠增加Hsp72 的釋放與表達(dá)[98]。雖然TEX-OX 多應(yīng)用于減少魚類運輸過程中產(chǎn)生的應(yīng)激，增加魚類的耐受力，但是，越來越多的研究表明，TEX-OX 也可以增強魚類的抗病免疫力[99]。闡明TEX-OE 等生物活性化合物的免疫調(diào)節(jié)作用，具有重要的基礎(chǔ)和應(yīng)用意義。

芍藥苷來自草本植物芍藥，可增強培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中Hsp70 的表達(dá)，是TEX-OE 的替代品。芍藥苷誘導(dǎo)海拉細(xì)胞（HeLa Cells）產(chǎn)生耐熱性，這種效應(yīng)要在42 ℃下熱休克2 h 而產(chǎn)生增強效果[100]。生物活性化合物雷公藤紅素是一種來自中草藥雷公藤的醌甲基化三萜，可增加HeLa 細(xì)胞中Hsp70、Hsp40 和Hsp27 的合成[101]。五味子乙素（Sch B）是中藥五味子中最具活性的二苯并環(huán)辛二烯，其以劑量依賴性方式提高小鼠肝臟Hsp70 的表達(dá)，來達(dá)到治療的目的[102]。香芹酚來自牛至屬物種的油，可引起Hsp70 表達(dá)并促進(jìn)T 細(xì)胞對內(nèi)源性Hsp70 的識別[103]。一些抗癌藥物能升高外泌體中Hsp60、Hsp70和Hsp90 的含量，增強自然殺傷細(xì)胞的免疫活性[104]。以上是目前所報道的可作為HSP 誘導(dǎo)劑的相關(guān)物質(zhì)，可能用于控制水產(chǎn)動物疾病的新策略中。

4.2 外源性HSPs 給藥

有研究指出，用富含HSP 的細(xì)菌喂養(yǎng)水生生物是控制水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病的一種新方法。向鹵蟲飼喂能夠大量表達(dá)DnaK（即Hsp70 的等價物）的大腸桿菌，在受到坎氏弧菌感染時，其存活率顯著高于對照組[79]。而這可能與通過飼喂富含DnaK 的細(xì)菌，刺激鹵蟲的酚氧化酶級聯(lián)系統(tǒng)[105]。向鹵蟲飼喂富含Hsp70 的酵母，可增強鹵蟲對坎氏弧菌的耐受能力[106]。體內(nèi)注射重組細(xì)菌的HSPs、DnaK 和GroEL蛋白能夠保護(hù)花科米奇魚（Xiphophorus maculatus）免受魯氏耶爾森氏菌（Yersinia ruckeri）的侵害[107]。雖然目前在水生動物中，關(guān)于HSPs 外源性給藥方式的研究較少，但研究和開發(fā)新型給藥途徑，提高機(jī)體HSP 的含量，來增強抗病力的目的是可行的。

4.3 HSPs 作為疫苗用于水產(chǎn)養(yǎng)殖

現(xiàn)已證實，用細(xì)菌來源的HSPs 作為抗原蛋白可作為有效的抗病疫苗，為水生動物健康養(yǎng)殖提供一定的保障。目前關(guān)于HSPs 作為疫苗的研發(fā)已有系統(tǒng)地報道[108,109]。在大西洋鮭（Salmo salar）中注射病原鮭立克次氏體（Piscirickettsia salmonis）的Hsp60和Hsp70 重組蛋白，顯著降低了鮭感染此病原的死亡率[110]。將鮭立克次氏體的Hsp60 和Hsp70，以及鮭鞭毛蛋白FlgG 的重組蛋白混合作為疫苗，能夠保護(hù)鮭免受立克次氏敗血癥（Rickettsial septicaemia,SRS）的侵害，其效率高達(dá)95%以上[111]。給虹鱒注射嗜冷黃桿菌（Flavobacterium psychrophilum）Hsp60和Hsp70 的重組蛋白和DNA 疫苗，只有rHsp70 疫苗的保護(hù)效果較好[112]。細(xì)菌的DnaJ 作為Hsp40 的同源物也可作為疫苗進(jìn)行篩選。在尖吻鱸（Lates calcarifer）中，通過重組表達(dá)了4 種美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種（Photobacterium damselae subsp.）的HSP（Hsp90、Hsp70、Hsp33 和DnaJ）作為蛋白疫苗，其保護(hù)效率分別為48.28%、62.07%、51.72%和31.03%[113]。Hsp33 更適合作為美人魚發(fā)光桿菌的疫苗保護(hù)劑。愛德華氏菌的DnaJ 重組蛋白可護(hù)牙鲆抵抗這種革蘭氏陰性病原體，與未免疫對照相比，存活率提高62%[114]。刺激隱核蟲（Cryptocaryon irritans）Hsp70 的C-端重組蛋白，通過包裹在殼聚糖納米顆粒中作為疫苗，可達(dá)到95%以上的保護(hù)效率[115]。這些研究中表明，病原體來源的HSP 是水產(chǎn)養(yǎng)殖中理想的候選疫苗，能夠減少水生動物病害的發(fā)生。

HSPs 也可作為疫苗佐劑的候選物。當(dāng)合成肽與HSPs 共價連接時，它們能顯著增加機(jī)體的免疫應(yīng)答[116]。這種特性在Hsp70、Hsp110 和Hsp170 中均有報道[117]。HSP 能夠與抗原呈遞細(xì)胞（Antigen-presenting cells,APC）相互作用。HSP-肽復(fù)合物被APC 攝取，出現(xiàn)在APC 的MHC 分子上，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子、趨化因子和NO，可以上調(diào)樹突狀細(xì)胞上共刺激分子的表達(dá)[118]。這些作用涉及受體參與、信號傳導(dǎo)以及NF-κB向巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞核的易位。HSP 伴侶肽通過Toll 樣受體（Toll-like receptors,TLR）、凝集素樣氧化LDL 受體和CD91 等特異性受體進(jìn)入APC[119]，通過增加MHC 的I 類和II 類分子的抗原展示來誘導(dǎo)T 細(xì)胞[120]。目前還沒有研究在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用HSPs 作為疫苗佐劑。盡管如此，這些HSPs 在開發(fā)針對病毒或細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的疫苗中具有特殊的重要性。

5 結(jié)論

水生動物能夠產(chǎn)生sHSPs、Hsp70、Hsp60 和Hsp90 等多種蛋白，保護(hù)機(jī)體免受各種應(yīng)激損傷。通過發(fā)揮分子伴侶的功能，調(diào)節(jié)新生蛋白質(zhì)的折疊，防止不可逆的蛋白質(zhì)變性，幫助受損蛋白質(zhì)重折疊或消除受損蛋白質(zhì)。在水產(chǎn)動物中，HSPs 不僅可以作為某些水環(huán)境污染物的生物標(biāo)識，而且HSPs 的累積量與其環(huán)境應(yīng)激的耐受水平呈正相關(guān)。HSPs還廣泛參與水產(chǎn)動物免疫調(diào)控過程，增強HSPs 的表達(dá)，有助于提高水產(chǎn)動物的抗病能力。外源性的HSPs 還可作為疫苗，刺激宿主先天性免疫的體液和細(xì)胞來提高對病原體的抵抗力。HSPs 也可作為疫苗佐劑，在開發(fā)水生生物的有效疫苗中有重要作用。因此，HSPs 可作為水生動物的一個重要靶位點，調(diào)控HSPs 表達(dá)和功能，能增強水生動物的抗應(yīng)激能力，對病害防治起到重要作用。