毛治安

(撫順市農(nóng)業(yè)特產(chǎn)學(xué)校，遼寧 撫順 113123)

豬流行性腹瀉病毒(PEDV) 可引起各種日齡豬發(fā)生腹瀉，是目前引起養(yǎng)豬生產(chǎn)中病毒性腹瀉的最主要病原，主要危害仔豬，10 日齡內(nèi)仔豬發(fā)病后死亡率達(dá)95%以上。 為防治仔豬流行性腹瀉對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的危害，本試驗(yàn)采用自制抗PEDV 的特異性卵黃抗體，應(yīng)用于發(fā)病仔豬和受威脅的健康仔豬群，研究其在預(yù)防和治療PED 的效果。

1 試驗(yàn)材料

PEDV HeB09 流行株(中國(guó)農(nóng)科院北京畜牧獸醫(yī)研究所)、高產(chǎn)蛋雞、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂；血瓊脂培養(yǎng)基；小鼠；PED 抗原速測(cè)卡(金標(biāo))，韓國(guó)安捷BIONOTE 公司；硫酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、乙酸—乙酸鈉等分析純?cè)噭┵?gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；流行性腹瀉病豬、新生仔豬。

2 試驗(yàn)方法

2.1 卵黃抗體的制備

選取200 只120 日齡左右的高產(chǎn)蛋雞，應(yīng)用PEDV HeB09 株進(jìn)行免疫，收集瓊擴(kuò)效價(jià)1∶32 以上高免蛋，應(yīng)用醋酸—醋酸鈉緩沖液法制備卵黃抗體粗提液，應(yīng)用水稀釋法—硫酸銨沉淀法純化工藝進(jìn)行卵黃抗體的純化并進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。

2.2 卵黃抗體安全性檢測(cè)

2.2.1 細(xì)菌檢測(cè) 將制備的卵黃抗體液涂布普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、血瓊脂平板培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～72 h，觀(guān)察有無(wú)菌落生長(zhǎng)。

2.2.2 安全性實(shí)驗(yàn) 小鼠安全性試驗(yàn): 選擇4只小鼠，兩只后腿部肌注0.5 mL PEDV 卵黃抗體，連用7 d，觀(guān)察注射部位有無(wú)腫脹、潰瘍，以及藥物吸收情況；兩只每天口服0.5 mL，連用7 d，觀(guān)察小鼠是否出現(xiàn)異常。 仔豬安全性試驗(yàn): 選取1 周齡仔豬4 頭。 2 只后腿部肌注5 mL PEDV 純化卵黃抗體，2 只口服10 mL粗提卵黃抗體液，連用7 d；觀(guān)察注射部位有無(wú)腫脹、潰瘍以及藥物吸收情況，觀(guān)察仔豬是否出現(xiàn)胃腸道不良反應(yīng)。

2.3 動(dòng)物治療試驗(yàn)

2016 年11 月?lián)犴樖懈邽衬池i場(chǎng)109 頭仔豬發(fā)生腹瀉，其中10 日齡內(nèi)仔豬34 頭，10 ～30 日齡仔豬75 頭，病豬發(fā)生水樣腹瀉，精神沉郁，不食或減食，糞便呈灰黃色，較小日齡仔豬陸續(xù)出現(xiàn)死亡，尸體嚴(yán)重脫水. 剖檢可見(jiàn): 死亡豬小腸擴(kuò)張明顯，腸壁變薄，充滿(mǎn)黃色液體，腸系膜充血，盲腸扁桃體出血，胃內(nèi)多空虛或有未消化乳凝塊。 根據(jù)發(fā)病表現(xiàn)及PEDV 快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)，最后確診為PEDV 感染。

將發(fā)病仔豬分成三組，應(yīng)用高免卵黃抗體進(jìn)行治療。 第一組: 糖鹽水補(bǔ)液組，腹腔注射，15 mL/次，每天2 次；第二組: 糖鹽水補(bǔ)液＋純化IgY 注射治療組，每只發(fā)病豬在糖鹽水補(bǔ)液的同時(shí)，肌注純化IgY 液4 mL，每天1次；第三組: 糖鹽水補(bǔ)液＋粗提IgY 口服治療組，每只發(fā)病豬在糖鹽水補(bǔ)液的同時(shí)，口服粗提IgY 液4 mL，每天1 次；連續(xù)觀(guān)察1 周。 具體分組如表1。 補(bǔ)液用糖鹽水配方為糖鹽水250 mL，碳酸氫鈉30 mL，慶大霉素40 萬(wàn)IU，阿托品0.5 mg，地塞米松0.5 mg。 治愈標(biāo)準(zhǔn):豬只吃食、飲水基本恢復(fù)正常，糞便固態(tài)成型。

表1 患病仔豬治療分組情況

撫順市馬金豬場(chǎng)1 號(hào)分娩舍200 多頭仔豬發(fā)生腹瀉，死亡23 頭，患病仔豬發(fā)生不同程度的腹瀉，7 日齡內(nèi)初生仔豬不食，迅速脫水；較大日齡仔豬亦出現(xiàn)水樣腹瀉，精神沉郁，厭食，出現(xiàn)口渴現(xiàn)象，糞便為黃色或灰色，糞便pH 檢測(cè)呈酸性。 根據(jù)流行特點(diǎn)、臨床表現(xiàn)及PEDV 快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)確診為PEDV 感染。 應(yīng)用制備的高免卵黃抗體、糖鹽水補(bǔ)液對(duì)其中192 頭發(fā)病仔豬進(jìn)行治療，分組情況見(jiàn)表2。

表2 患病仔豬治療分組情況

2.4 動(dòng)物預(yù)防試驗(yàn)

2017 年2 月，泗水豬場(chǎng)豬群出現(xiàn)腹瀉，母豬減食、嘔吐，隨后出現(xiàn)水樣腹瀉，仔豬腹瀉嚴(yán)重，迅速脫水，較小日齡仔豬陸續(xù)出現(xiàn)死亡，在豬群內(nèi)迅速蔓延，根據(jù)發(fā)病表現(xiàn)及PEDV 快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)確診為PEDV 感染。對(duì)分娩舍165 頭新生仔豬進(jìn)行卵黃抗體預(yù)防試驗(yàn)。 試驗(yàn)分卵黃抗體注射預(yù)防組(1 組)、卵黃抗體口服預(yù)防組 (2 組)、未預(yù)防組 (3組)；1 組仔豬出生當(dāng)天肌注4 mL 純化IgY 提取液，隔日1 次，連用7 次；2 組出生當(dāng)天口服4 mL 粗提IgY 液，隔日1 次，連用7 次；3組口服生理鹽水對(duì)照。 觀(guān)察各組仔豬的發(fā)病情況。 在不改變豬場(chǎng)其他生產(chǎn)操作的情況下，觀(guān)察卵黃抗體對(duì)于新生仔豬病毒性腹瀉的防控效果。

3 結(jié)果

3.1 抗體效價(jià)及無(wú)菌檢測(cè)結(jié)果

PEDV 卵黃抗體的純化IgY 提取液、粗提IgY 瓊擴(kuò)效價(jià)均達(dá)到1∶32。 將粗提、純化產(chǎn)物分別接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)基表面無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

3.2 安全性檢測(cè)結(jié)果

小鼠后腿部肌注卵黃抗體部位無(wú)腫脹、潰瘍出現(xiàn)，藥物吸收良好；口服給藥后小鼠精神狀態(tài)正常，未出現(xiàn)胃腸道癥狀。

仔豬后腿部肌注5 mL PEDV 卵黃抗體后注射部位亦無(wú)腫脹、硬結(jié)、潰瘍等情況發(fā)生，藥物吸收良好，仔豬體溫正常，精神狀態(tài)、食欲正常。 口服給藥仔豬未出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等胃腸道反應(yīng)。 說(shuō)明制備的粗提IgY 液、純化IgY提取液安全性較好，可以應(yīng)用于豬流行性腹瀉感染的臨床治療。

3.3 動(dòng)物治療試驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 高灣豬場(chǎng)治療效果 高灣豬場(chǎng)109 頭發(fā)病仔豬應(yīng)用糖鹽水、PEDV 特異性卵黃抗體治療后，各試驗(yàn)組均有一定的治療效果，見(jiàn)表3。 2、3 組應(yīng)用卵黃抗體注射治療組、口服治療組比單獨(dú)使用糖鹽水補(bǔ)液組治愈率分別高39.3%、34.1%，說(shuō)明應(yīng)用PEDV 特異性卵黃抗體對(duì)流行性腹瀉疾病的治療效果顯著。

表3 高灣豬場(chǎng)患病仔豬治療效果

3.3.2 馬金豬場(chǎng)治療效果 豬場(chǎng)1 號(hào)分娩舍192 頭仔豬發(fā)生豬流行性腹瀉疾病，根據(jù)窩數(shù)隨機(jī)分成三組，各組均腹腔注射5% 糖鹽水15 mL，每天2 次；2 組、3 組發(fā)病豬只在糖鹽水補(bǔ)液的同時(shí)，分別肌注5 mL 純化IgY 液、口服5 mL 粗提IgY 液，每天1 次。 治療結(jié)果如表4，10 日齡內(nèi)發(fā)病仔豬由于豬只體重小、抵抗力較差，各組治愈數(shù)都較低；1 組僅使用糖鹽水補(bǔ)液組總治愈率僅為24.4%，2 組、3組治愈率分別達(dá)到70.1%、60.0%。

表4 馬金豬場(chǎng)患病仔豬治療效果

3.4 動(dòng)物預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分娩舍15 窩、165 頭新生仔豬進(jìn)行PEDV 特異性IgY 預(yù)防試驗(yàn)。 結(jié)果見(jiàn)表5，圖1。 IgY 口服預(yù)防組、注射預(yù)防組仔豬出現(xiàn)均發(fā)病仔豬，由表可見(jiàn)口服預(yù)防組的發(fā)病率為61.1%，注射預(yù)防組發(fā)病率42.9%，而生理鹽水對(duì)照組因?yàn)槿狈贵w保護(hù)整窩仔豬全部發(fā)病，發(fā)病率100%。 在現(xiàn)場(chǎng)觀(guān)察中，發(fā)病后全窩仔豬都會(huì)出現(xiàn)腹瀉癥狀。 不過(guò)在經(jīng)過(guò)后續(xù)的治療(這三組發(fā)病仔豬同時(shí)進(jìn)行藥物的腹腔補(bǔ)液，和豬場(chǎng)以前的操作方案一樣)，其中口服預(yù)防組的死亡率為63.6%，注射預(yù)防組的死亡率為58.3%，而對(duì)照組的死亡率達(dá)到94.5%。由此可以說(shuō)明特異性IgY 可以降低新生仔豬的PEDV 發(fā)病率和死亡率，對(duì)豬場(chǎng)控制豬群流行性腹瀉有一定的幫助。

圖1 動(dòng)物預(yù)防試驗(yàn)結(jié)果

表5 泗水豬場(chǎng)新生仔豬卵黃抗體預(yù)防效果

4 討論與分析

本試驗(yàn)中PEDV 特異性卵黃抗體臨床治療應(yīng)用結(jié)果表明，發(fā)病仔豬肌注純化IgY、口服粗提IgY 液治愈率都達(dá)到55%以上，說(shuō)明粗提、純化的IgY 具有很好的抗病毒活性。

2 個(gè)豬場(chǎng)肌注給藥、口服給藥的總治愈率分別為68.1%、58.0%，肌注IgY 給藥的治愈率比口服給藥高10%，治療效果更好。 分析其原因主要是雖然粗提卵黃抗體液中IgY 的含量高于純化IgY，但經(jīng)口服給藥后，胃內(nèi)酸性環(huán)境會(huì)破壞一部分IgY 的生物活性[1]，以及胃蛋白酶、胰蛋白酶對(duì)IgY 的分解作用，使能夠在消化道內(nèi)發(fā)揮抗病毒作用的有效IgY 量下降，隨著豬只日齡的增長(zhǎng)，胃內(nèi)pH 下降，逐漸達(dá)到成年豬2.5 ～3.5 的水平，口服卵黃抗體活性被破壞快，因此可以考慮開(kāi)發(fā)IgY 的緩釋制劑及保護(hù)劑[2]。 而肌注給藥的IgY 吸收后直接入血，不會(huì)引起抗體活性下降，血液中PEDV抗體效價(jià)迅速上升，通過(guò)抗原抗體的特異性結(jié)合發(fā)揮抗病毒作用。

卵黃抗體經(jīng)粗提去脂后口服給藥的治愈率為58.0%，與應(yīng)用PEDV SD 株制備的卵黃抗體液對(duì)自然發(fā)病豬場(chǎng)病豬治療效果(治愈率67%) 接近[3]，雖然本試驗(yàn)口服給藥在治愈率上比純化IgY 注射給藥途徑低，但是粗提去脂方法簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本比較低，相比較比純化卵黃抗體更容易在基層養(yǎng)殖業(yè)中推廣使用。

不同日齡段仔豬經(jīng)糖鹽水補(bǔ)液、卵黃抗體給藥后的治療效果顯示10 日齡內(nèi)仔豬的總治愈率僅為21.2%，10 ～30 日齡仔豬的治愈率可達(dá)80.5%。 主要因?yàn)?0 日齡內(nèi)仔豬體重、免疫力較低，一旦發(fā)生腹瀉迅速發(fā)生脫水，而隨著病豬日齡的增加，豬只的抵抗力增加，及時(shí)采取補(bǔ)液、特異性抗體療法死亡豬只數(shù)量明顯下降，治療效果良好。

應(yīng)用制備的卵黃抗體純化產(chǎn)物、粗提去脂液預(yù)防給藥后，新生仔豬的發(fā)病率比對(duì)照組分別降低了57.1%、38.9%，發(fā)病豬的死亡率分別降低了36.2%、30.9%，說(shuō)明PEDV 特異性卵黃抗體的預(yù)防給藥對(duì)豬場(chǎng)控制豬群尤其是新生仔豬的流行性腹瀉有一定的幫助。 通過(guò)卵黃抗體預(yù)防實(shí)驗(yàn)、治療試驗(yàn)結(jié)果看出，PEDV 卵黃抗體緊急預(yù)防、治療給藥是控制疫情蔓延、減少豬場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失的有效措施。 同時(shí)，針對(duì)此病的發(fā)生，應(yīng)加強(qiáng)生產(chǎn)管理，包括豬舍溫濕度的控制、定期消毒等操作，母豬產(chǎn)前做好病毒性腹瀉疫苗的普免，提高豬群的免疫狀態(tài)和抵抗力，以預(yù)防流行性腹瀉的流行，提高豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。