楊嶸長

(寬甸滿族自治縣動物疫病預防控制中心，遼寧 寬甸 118200)

為避免豬流感病毒對養(yǎng)殖區(qū)域造成較大的影響，需重視豬流感病毒復制病毒，在篩選宿主基因的基礎上，尋找其中存在的SIV (結構投資載體) 對豬生命周期造成的影響，深入研究SLC35A1 對豬流感病毒復制產生的干擾，從而根據檢測基因的方式，明確在自然環(huán)境下豬受感染的現象是如何產生的。 這樣，本研究則可基于SLC35A1 對豬流感病毒復制的影響，為后續(xù)的致病機理奠定良好的基礎。

1 豬流感病毒的基本概述

流感病毒隸屬于正黏病毒科，其中的基因組主要分為單股負鏈RNA，具體大小被規(guī)劃在12 ～14 kb，并且可以分為從A 到D 四種類型。此時，B 型、A 型內的基因組片段有8 個；D型和C 型之間的基因組片段有7 個。 而B 型的感染性更強，其可以對人類的身體健康造成影響，引發(fā)人類出現感染問題，嚴重則會造成呼吸系統(tǒng)等疾病的產生；C 型的流感病毒是以寄生為主，其宿主范圍是豬和人。 在此基礎上，可結合血清學、流行病學以及病理學等方面的研究進行分析，其中D 型的病毒主要是感染自然宿主，如牛等；A 型的流感病毒則可劃分為病毒表層的NA (神經氨酸酶)、HA (抗原蛋白血凝素)[1]。

其中豬流感被認定為其中的A 型病毒，會引起豬出現發(fā)熱、打噴嚏、厭食、流鼻涕、咳嗽以及呼吸困難等疾病。 在豬流感發(fā)生后一般在5 ～7 日內可以恢復正常，但由于此病毒的致死率高達4% ～10%并且具有較高的發(fā)病率，一旦豬流感發(fā)生則會造成較大的經濟損失。 同時由于豬群在養(yǎng)殖過程中需控制屠宰體重，若發(fā)生豬流感豬的免疫力則會下降，引發(fā)其他的病毒的并發(fā)產生，如鏈球菌、巴氏桿菌、綜合征病毒等，提高的豬的死亡率，無法保證豬養(yǎng)殖人員的經濟效益[2]。

2 SLC35A1 對豬流感病毒復制的影響

2.1 配置實驗材料及設備

2.1.1 材料 為監(jiān)測SLC35A1 對豬流感病毒復制的影響，可選取正確的實驗材料配置方式，運用固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基執(zhí)行實驗。選購8% 含量的polybrene，可選取粉末狀的polybrene，讓其在無菌的狀態(tài)下將培養(yǎng)基內的離子水去除，保證其在充分溶解后能夠定容在25 mL 的溶液中，將其保存于4 ℃以內，確保在實驗過程中相關材料試劑不會出現問題。

同時可選取50 × TAE 緩沖液，讓其能夠注入于800 mL 的離子水內運用充分的攪拌方式，注入對應的醋酸，在確保相互之間能夠完全混合后，讓其中的離子水能夠定容到1 000 mL 并且在室溫下進行保存。 另外，可增加甘氨酸電泳、轉膜緩沖液等的應用，讓其能夠在室溫條件下與鹽酸進行混合，適量粉底增加愛甲醇，做好備用準備[3]。

2.1.2 設備 在進行實驗過程中需運用搖床、多功能PCR 儀、生化培養(yǎng)箱(恒溫)、冷凍離心機、顯微鏡、多功能酶標儀等設備[4]。

2.2 設置實驗方法

2.2.1 細胞相關實驗 從豬的身體中獲取細胞，運用液氮容器對細胞進行凍存，在應用時直至液氮排凈后則可將其應用于37 ～42 ℃的溫水內。

同時若需將細胞進行凍存，可將無血清培養(yǎng)基中血清、DMSO 以及凍存液的比例控制在6∶3∶1，讓細胞可以在4 ℃內的冰箱內進行預冷，將單層的細胞近懸浮，確保可以注入15 mL 的細胞懸浮液，在執(zhí)行離心3 ～5 min后，則可將上清去除，將保存好的細胞進行沉淀，在實驗環(huán)節(jié)將其進行取出。

再者，為保證細胞的計數工作能夠順利實施，需將蓋玻片、計數板擦拭干凈，在單層細胞密集的區(qū)域，確保單個細胞呈現出懸浮的狀態(tài)，根據實驗要求吸出對應的細胞，讓其密度可以稀釋到100 ～1 000 倍，這樣，則可讓懸浮液充滿整個計數板和蓋玻片以內，在完成3 分鐘的靜止后，則可運用“計上不計下，計左不計右” 的方式，完成對細胞的計算。

2.2.2 病毒相關實驗 首先，通過病毒原液的應用，執(zhí)行對應的滅菌操作，在PBS 稀釋進行時候，則可運用無菌的注射器，將200 μL的病毒進行稀釋，保證其可以利用絨毛尿囊腔完成接種工作，在此操作執(zhí)行9 ～11 日后，則可運用石蠟進行封口，讓其可以放置在37 ℃恒溫箱中完成對應的孵化操作。 這樣，在豬流感病毒增殖培養(yǎng)過程中，實驗人員則可通過12 h 的觀察，運用雞胚胎來確認其是否存活，若在接種完畢后48 ～72 h 以內出現雞胚死亡的現象，則可將其放置于4 ℃的環(huán)境中，在4 h以內完成離心操作，汲取其中的尿囊液并開展對應的離心操作，保證在上清收集完畢后，可進行高速的離心操作，讓其能夠進入濾器過濾，在確認病毒的滴度后，方可讓其進入負80 ℃的環(huán)境下進行保存。

其次，可運用豬流感病毒細胞接種的方式，在細胞板內增加單層流感病毒的應用。 優(yōu)先將病毒原液放置于無菌的環(huán)境中，讓其能夠進行稀釋，保證可以運用無菌PBS 執(zhí)行對細胞的二次清洗。 由此方式，適當地增加病毒液的應用，促使流感病毒能夠在37 ℃內的培養(yǎng)箱中進行一個小時的孵化。 這樣，在每孔內都已經完全棄去病毒液后，則可運用無菌PBS 洗液執(zhí)行二次清洗操作，讓青鏈霉素含量為1%，使其可以在現象的培養(yǎng)基內進行繁殖。

最后，可在37 ℃的室溫內進行對豬流感病毒的培養(yǎng)，讓實驗人員可以根據不同的時間點對細胞的狀態(tài)進行觀察，運用收集上清的方式，合理地規(guī)劃存活細胞數量。 這樣，則可在96 孔微量的反應板上執(zhí)行對應的操作。 實驗人員通過左右孔內注入50 μL 生理鹽水的方式，讓病毒液能夠與之混合，在二者充分融合后，方可將其中的50 μL 病毒液吸出，將其應用于第二個孔內，按照次序依次對其進行吸取。 在此基礎上，則可將12 個孔內豬流感病毒的變化情況進行分析，運用12 孔內的陰性對照實驗，保證不同孔內的細胞懸浮液可以自右至左進行排列。 據此，則可在穩(wěn)定15 min 后按照操作需求，在激光顯微鏡下進行對應的觀察操作，順利檢測出SLC35A1 對豬流感病毒復制的影響。

2.3 結果與分析

2.3.1 創(chuàng)建SLC35A1 敲除細胞系，抑制SIV增殖 SLC35A1 對豬流感病毒復制具有一定的增值影響，運用實驗比對的方式可驗證了12個準確的候選因素，一旦SLC35A1 被敲定，則可看出其對豬流感病毒復制產生的抑制作用，當豬已經感染流感病毒72 h 之后，細胞的存貨數量相對較多，此時為創(chuàng)建出SLC35A1的細胞敲除體系，可基于NPTr -Cas9 細胞進行考慮，運用ALG5 的操作方式，在NPTr -Cas9 的基礎上構建對應的SLC35A1 敲除細胞組。 這樣，則可結合實驗中4 株單克隆細胞，讓其他病株不會受到影響，運用野生型的對照方式，在36 小時后測定4 株單克隆細胞所受到的抑制性作用。 得出結果，在第3、第4 株單克隆細胞對豬流感病毒的增殖細胞抑制作用作為強烈。 同時為印證SLC35A1 對NPTr -Cas9 的影響，需將 SIV 劃分為 NPTr -ΔSLC35A1 以及NPTr -Cas9，通過12 h、24 h以及36 h 的試驗對比方式，正確地收集存活細胞及上清。 經實驗表明，前者可表達為通過蛋白定量檢測的方式，展現出其中涵蓋的NP蛋白表達量，而后者內所檢測出的病毒為TCID50。 據此，則可根據SLC35A1 敲除操作，了解在SLC35A1 應用后，其會對SIV 產生一定的抑制作用。

2.3.2 發(fā)揮SLC35A1 敲除作用，抑制豬流感病毒吸附 由于SLC35A1 作為一種唾液酸轉運蛋白，其在生成過程中需要唾液酸進行合成，當出現豬流感病毒時，唾液酸會吸附于細胞的表面，運用HA 與細胞表層結合的方式，形成唾液酸。 在此背景下，可通過實驗研究的方式，掌握SLC35A1 敲除后期是否能夠對豬流感病毒的吸附造成影響。

通過NPTr - Cas9 細胞的復制，讓其能夠進行高速的冷凍以及濃縮，控制好SIV 的狀態(tài)，讓操作人員可以運用MOI ＝75 的劑量，實現SLC35A1 敲除細胞與SIV 的反應。 首先，可將病毒進行固定，在經過一段吸附時間后，運用依次發(fā)育的方式，執(zhí)行顯微鏡與激光工具的觀察。 經結果下顯示，在野生型細胞內病毒會出現于細胞膜的附近，并且會在短時間內進行聚集。 但在SLC35A1 敲除細胞的觀察過程中未發(fā)現明顯的病毒顆粒。 據此，則可運用細胞比對的方式，掌握SLC35A1 于HA 之間存在無法結合的問題，表示當SLC35A1 敲除細胞系運行過程中，其會對SIV 造成一定的影響，了解到豬流感的產生是由于細胞表層與病毒顆粒的集合效率下降造成。

其次，在SLC35A1 敲除后，能夠了解到HA 會產生一定的吸附抑制作用，其可以保證SIV 不會持續(xù)增殖。

2.3.3 開展SLC35A1 實驗，調控豬流感病毒復制問題 通過凝集素實驗的方式，印證SLC35A1 敲除過程中細胞表層所發(fā)生的唾液酸受阻現象，運用流式細胞術掌握細胞在敲除后細胞與HA 蛋白的結合量呈現出下降的趨勢，由此則可判定SLC35A1 對豬流感病毒的抑制的作用。 通過3F -Neu5Ac 來對唾液酸的轉移進行抑制，保證在細胞內豬流感病毒不會持續(xù)增殖。 由此方式，可運用SLC35A1 敲除的方式，證實了其對豬流感病毒復制產生的抑制作用。 即使未進行蛋白水平的檢測，也可在72 h內掌握細胞存活階段SLC35A1 敲除細胞系的狀態(tài)。 據此，利用吸附實驗的方式，實現對HA 蛋白的驗證，運用有活性的豬流感病毒試驗方式，了解到豬細胞增殖后，其中的病毒會產生濃縮，只有運用高劑量的SLC35A1 才可控制細胞的密度，抑制其中的F26、PR8 以及H9N2 毒株的增殖。

3 結論

綜上所述，經過上述實驗檢驗的方式，可得出豬流感具有較強的傳染性，并且豬是流感病毒的一種混合器，一旦豬感染了豬流感則會產生新型的病毒，增強人感染流感的可能性。所以，為避免豬流感帶來經濟損失或是對人們的身體健康造成影響，應加強對豬流感病毒的控制，做好預防計劃，保證流感病毒在整個細胞周期內都能得到控制，這樣在網格蛋白接入環(huán)節(jié)，相關治理人員則可根據流感病毒進入細胞的狀態(tài)，避免宿主因子與流感病毒進行重疊，從而運用通過替代篩選的方式降低宿主因子的實際表達水平，保證豬的健康成長，推動生豬養(yǎng)殖水平的不斷提升。