元 娜，張美美，耿 健，李向清，趙寶凱

(1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；2. 北京大偉嘉生物技術(shù)股份有限公司，北京 100085；3. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；4. 遼寧偉嘉農(nóng)牧生態(tài)食品有限公司，遼寧 葫蘆島 125199)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR) 是由皰疹病毒科，a -皰疹病毒亞科的豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV) 引起的一種以發(fā)熱、奇癢和腦脊髓炎為特征的急性傳染病[1]。 此病危害新生仔豬的消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)，可引起母豬的繁殖障礙。 感染PRV 耐過(guò)豬是病毒的長(zhǎng)期帶毒者和排毒者[2]。 2011 年后，我國(guó)多地區(qū)出現(xiàn)豬PR 變異毒株并流行，引發(fā)母豬流產(chǎn)和豬只死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[3]。 隨著PR 免疫和凈化措施的有效落地，PRV 感染案例的報(bào)道逐漸減少。 但免疫方法不科學(xué)、程序不合理以及使用疫苗毒株不匹配，不能構(gòu)筑有效的免疫屏障易引起豬場(chǎng)發(fā)病。 2022 年12 月，山西某規(guī)?；i場(chǎng)發(fā)生了有典型癥狀的PR，通過(guò)4 個(gè)月的跟蹤觀察、實(shí)驗(yàn)室診斷、病毒分離和中和抗體的測(cè)定，對(duì)疾病的流行特點(diǎn)和防控效果進(jìn)行了總結(jié)分析。

1 豬場(chǎng)基本情況

山西某5 000 頭母豬的種豬場(chǎng)，母豬免疫PR C 株疫苗4 次/年，1 頭份/頭豬；仔豬24 h滴鼻1 頭份/頭豬，35 ～45 日齡免疫1 頭份/頭豬。 從2021 年12 月9 日開(kāi)始，母豬出現(xiàn)流產(chǎn)且以妊娠中后期為主，病豬體溫升高，采食量下降；產(chǎn)房母豬產(chǎn)死胎、木乃伊胎和弱子比例升高；仔豬出生后2 周內(nèi)出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，病死率達(dá)70%以上，主要表現(xiàn)為神經(jīng)癥狀，頭歪向一側(cè)，共濟(jì)失調(diào)，同時(shí)伴有呼吸困難。 對(duì)病死仔豬進(jìn)行剖檢，可見(jiàn)腦膜明顯充血、出血，腦脊髓液增多；肺臟出血；腹股溝淋巴結(jié)腫大、出血，顏色呈紫黑色。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 樣品 采集流產(chǎn)母豬血拭子4 份，流產(chǎn)胎兒2 頭，發(fā)病仔豬的腦組織、扁桃體、肺臟、淋巴結(jié)各3 份；隨機(jī)采集2021 年12 月、2022 年1 月、3 月和4 月母豬的血清共計(jì)332份；豬場(chǎng)使用的C 株弱毒疫苗和HB2000 弱毒疫苗各1 瓶。

2.1.2 主要試劑及儀器 核酸提取試劑盒購(gòu)自杭州博日科技有限公司；PRV gE 基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)試劑盒、豬瘟病毒(CSF)實(shí)時(shí)熒光定量RT -PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV) 實(shí)時(shí)熒光定量RT -PCR 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX；PRV gB 和gE 抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)IDEXX；DL 2000 DNA Marker 購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；LA Taq、GC Buffer 購(gòu)自寶生物工程(大連) 有限公司；高糖DMEM、胎牛血清(FBS)、細(xì)胞消化液購(gòu)自Thermo Fisher；Vero細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；PRV 陰性血清和PRV陽(yáng)性血清由本實(shí)驗(yàn)室保存。 PCR 儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio -Rad；熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)ABI；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自SANYO。

2.2 方法

2.2.1 生產(chǎn)指標(biāo) 2021 年12 月至2022 年4月，以月為單位記錄和計(jì)算平均流產(chǎn)率、死胎率、木乃伊率、窩均總仔數(shù)、窩均活仔數(shù)、窩均健仔數(shù)和仔豬成活率。

2.2.2 樣品處理 血拭子樣品加入1 mL 滅菌生理鹽水，渦旋振蕩，于-80 ℃反復(fù)凍融3次，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，取上清進(jìn)行DNA 及RNA 提??；流產(chǎn)胎兒及組織樣品剪取約2 g 組織，按1∶5 質(zhì)量比加入滅菌生理鹽水，研磨成勻漿，于-80 ℃反復(fù)凍融3 次，4 ℃、8 000 r/min 離心5 min，取上清進(jìn)行DNA 及RNA 提取。

2.2.3 病毒DNA 及RNA 提取 參照核酸提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及RT-PCR 檢測(cè)

用商品化的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 及RT -PCR 檢測(cè)試劑盒分別檢測(cè)CSFV、PRRSV 和PRV。

2.2.5 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 中PRV Ea 株(登錄號(hào): KU315430.1) gC 基因上下游保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，預(yù)期PCR產(chǎn)物約1 748 bp，具體信息見(jiàn)表1，引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成。

2.2.6 gC 基因擴(kuò)增及測(cè)序分析 取PRV 陽(yáng)性病料、PRV HB2000 疫苗液、PRV C 株疫苗液提取DNA，使用gC 1F、gC 1R 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。 PCR 擴(kuò)增體系50 μL: 上下游引物各2.5 μL，LA Taq 酶0.5 μL，DNA 模板4 μL，補(bǔ)充無(wú)菌雙蒸水至總體積50 μL。 反應(yīng)條件為:95 ℃5 min，95 ℃30 s，63 ℃30 s，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延長(zhǎng)10 min，4 ℃保存。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀記錄結(jié)果。 將gC 基因擴(kuò)增產(chǎn)物送到北京金唯智生物技術(shù)有限公司測(cè)序。 應(yīng)用DNAman軟件和MEGA 軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2.2.7 病毒分離培養(yǎng) 將PRV 陽(yáng)性腦組織剪碎研磨勻漿后，反復(fù)凍融3 次，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清，經(jīng)0.22 μm 濾器過(guò)濾除菌。 取0.5 mL 接種長(zhǎng)滿(mǎn)單層Vero 細(xì)胞的25 m2底面積細(xì)胞瓶，37 ℃吸附1 h 后，棄吸附液，加入含2% FBS 的DMEM 培養(yǎng)液5 mL，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變(CPE)，待CPE 達(dá)80%左右收毒，反復(fù)凍融2 次，4 ℃、4 000 r/min 離心5 min，取上清液接種Vero 細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

2.2.8 ELISA 抗體檢測(cè) 將采集的2021 年12月、2022 年1 月和2022 年3 月共300 份血清按IDEXX 抗體檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)檢測(cè)PRV gE 和gB 抗體。

2.2.9 PRV 中和抗體測(cè)定 將免疫C 株疫苗后2 個(gè)月和免疫HB2000 疫苗后2 個(gè)月的共65份血清過(guò)濾除菌，56 ℃水浴滅活30 min 后，用無(wú)血清DMEM 將待檢血清按1∶4、1∶8、1∶16、1∶32 進(jìn)行稀釋。 用無(wú)血清DMEM 將PRV 病毒液稀釋成200 TCID50/0.1 mL，取上述不同稀釋度的待檢血清200 μL 分別加入等量200 TCID50/0.1 mL 的病毒液，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)1 h 后接種已長(zhǎng)成良好單層的Vero 細(xì)胞，每個(gè)稀釋度接種4 孔，每孔0.1 mL，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照、不加病毒液的血清毒性對(duì)照、陽(yáng)性血清對(duì)照、陰性血清對(duì)照及病毒回歸對(duì)照(100 個(gè)TCID50、10 個(gè)TCID50、1 個(gè)TCID50、0.1 個(gè)TCID50)。 置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 ～7 日，觀察并記錄細(xì)胞病變情況。 當(dāng)正常細(xì)胞對(duì)照孔、血清毒性對(duì)照孔不出現(xiàn)CPE，且病毒回歸試驗(yàn)結(jié)果符合，100 個(gè)TCID50 孔應(yīng)全部出現(xiàn)CPE，0.1 個(gè)TCID50 應(yīng)全部不出現(xiàn)CPE 時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立。 按Reed -Muench 法計(jì)算中和效價(jià)。

3 結(jié)果與分析

3.1 生產(chǎn)指標(biāo)

由表2 可知，2021 年12 月，豬場(chǎng)流產(chǎn)率、死胎率、木乃伊率開(kāi)始升高，最高分別達(dá)到3.90%、26.13% 和8.63%，采取措施后，2022 年4 月分別低于2021 年12 月；仔豬的窩均總仔數(shù)、窩均活仔數(shù)、窩均健仔數(shù)和仔豬成活率均出現(xiàn)波動(dòng)，先降低后升高，2022 年4 月接近或高于2021 年12 月。

表2 2021 年12 月～2022 年4 月生產(chǎn)性能

3.2 qPCR 檢測(cè)結(jié)果

15 份樣本檢測(cè)PRV 核酸為陽(yáng)性，檢測(cè)CSFV 和PRRSV 核酸為陰性。

3.3 PRV gC 基因擴(kuò)增及測(cè)序分析

對(duì)PRV 陽(yáng)性樣品、C 株疫苗液、HB2000疫苗液的gC 基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為1 748 bp (圖1)。 對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果顯示，其與國(guó)內(nèi)2012 年后流行變異毒株TJ、CD2019 和SN2018 等毒株同源性高達(dá)100%，而與國(guó)內(nèi)外經(jīng)典毒株如Bartha、Becker 和Kaplan及LA 毒株同源性?xún)H為95.9%～99.3%；與市場(chǎng)上商品活疫苗HB2000 同源性為99.7%，與C 株疫苗同源性為95.82%(圖2)。 說(shuō)明此毒株為國(guó)內(nèi)流行變異毒株。

圖1 gC 基因PCR 擴(kuò)增電泳

圖2 gC 基因同源性分析

應(yīng)用MEGA7.0 軟件繪制遺傳進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果如圖3 所示，PRV 毒株與國(guó)內(nèi)經(jīng)典強(qiáng)毒株Ea、Fa、2012 年之后的變異強(qiáng)毒株及HB2000疫苗株親緣關(guān)系較近，處于同一分枝，而與國(guó)外經(jīng)典毒株Bartha、Becker、Kaplan 及國(guó)內(nèi)疫苗株C 株親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，處于不同分枝。

圖3 gC 基因遺傳進(jìn)化分析

3.4 病毒分離培養(yǎng)

病料處理液接種Vero 細(xì)胞后24 h 后開(kāi)始出現(xiàn)CPE，細(xì)胞腫脹變圓、細(xì)胞融合或拉網(wǎng)，48h 后成片脫落，將分離毒株命名為PRV -TZ。

3.5 ELISA 抗體檢測(cè)

對(duì)gE 和gB ELISA 抗體進(jìn)行分析，由表3可知，不同月份gB 抗體陽(yáng)性率均為100.00%，gE 抗體陽(yáng)性率隨著月份及感染時(shí)間的推遲呈上升趨勢(shì)，從2020 年12 月的15.00%上升到2021 年3 月的84.62%。

表3 PRV gE-ELISA 和gB-ELISA 抗體檢測(cè)結(jié)果

表4 中和抗體檢測(cè)結(jié)果

3.6 PRV 中和抗體測(cè)定

測(cè)定C 株疫苗免疫后2 個(gè)月和HB2000 疫苗免疫后2 個(gè)月共65 份血清的PRV 中和抗體，由表可知，使用PRV C 株疫苗免疫后2 個(gè)月即發(fā)病前，針對(duì)此毒株的母豬血清中和抗體水平較低，使用同源性較高的HB2000 疫苗免疫后2 個(gè)月，針對(duì)此毒株的gE 抗體陰性的母豬血清中和抗體水平較高，其中中和抗體1∶32 的比例達(dá)到68.75%。

4 討論

綜合豬場(chǎng)的發(fā)病情況、臨床癥狀以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果和不同月份gE 抗體陽(yáng)性率，確診豬場(chǎng)感染了PRV。 PRV 可以通過(guò)直接接觸、皮膚傷口或空氣等途徑傳播。 PRV 侵入機(jī)體后先在咽黏膜和扁桃體處增殖形成原發(fā)感染灶，再通過(guò)嗅神經(jīng)、三叉神經(jīng)和吞咽神經(jīng)的神經(jīng)鞘淋巴傳播至腦和脊髓，在此進(jìn)行大量復(fù)制，以異染色質(zhì)形式存在并形成潛伏感染[4]。 在潛伏狀態(tài)下當(dāng)受到外界的刺激時(shí)可被激活，并通過(guò)口、鼻或生殖道的分泌物散毒。2021 年12 月gE 抗體陽(yáng)性率為15.00%，說(shuō)明豬場(chǎng)部分豬只攜帶PRV，天氣突然降溫和連續(xù)3 天的斷電刺激豬只排毒成為此次發(fā)病的誘因。

PR 目前尚無(wú)特效藥，預(yù)防該病仍以疫苗免疫為主，目前商品化的疫苗主要有缺失gE基因的Bartha-k61、缺失3 個(gè)基因的HB2000和自然基因缺失的C 株疫苗。 若免疫方法和程序不合理，豬群的抗體水平不達(dá)標(biāo)，豬場(chǎng)仍存在爆發(fā)PR 的風(fēng)險(xiǎn)。 該豬場(chǎng)全群免疫4 次/年P(guān)RV C 株疫苗，2021 年12 月PRV gB 抗體陽(yáng)性率為100%，但豬場(chǎng)仍然暴發(fā)了疾病，這可能跟所使用的疫苗對(duì)此毒株交叉保護(hù)作用差有關(guān)，也可能跟免疫效果的評(píng)價(jià)方法有關(guān)。 嚴(yán)偉東[5]研究表明，Bartha K61 株活疫苗對(duì)傳統(tǒng)毒株有良好保護(hù)效果，而對(duì)流行變異毒株不能提供完全保護(hù)。 馬晶晶[6]攻毒試驗(yàn)證實(shí)，偽狂犬活疫苗C 株免疫仔豬后，80%免疫仔豬獲得保護(hù)。 為了進(jìn)一步研究發(fā)病原因，對(duì)從該場(chǎng)分離的PRV 毒株進(jìn)行g(shù)C 基因片段擴(kuò)增測(cè)序，比對(duì)結(jié)果表明此毒株與國(guó)內(nèi)2012 年后流行變異毒株TJ、CD 2019 和SN2018 等毒株同源性高達(dá)100%，為2010 年后流行的變異PRV 毒株，與豬場(chǎng)所使用的PRV C 株疫苗同源性為95.8%，推測(cè)免疫C 株疫苗對(duì)該場(chǎng)流行的PRV 變異毒株交叉保護(hù)作用較差，無(wú)法為豬群提供完全的免疫保護(hù)。

根據(jù)報(bào)道，國(guó)內(nèi)各地已先后分離到多株新流行的PRV 毒株，存在毒力增強(qiáng)和抗原位點(diǎn)發(fā)生突變的現(xiàn)象[7-9]。 PRV 的基因組為雙股線(xiàn)性DNA，約150kb，可編碼70 ～ 100 種蛋白質(zhì)[10]。 gB 蛋白作為PRV 的主要免疫原蛋白，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體；gC 蛋白是PRV 的免疫原蛋白和主要毒力蛋白；gE 蛋白是PRV主要毒力蛋白[11]。 2011 年后分離的PRV 變異新毒株其gE 毒力基因上發(fā)生了多個(gè)位點(diǎn)插入或基因點(diǎn)突變導(dǎo)致毒力增強(qiáng)；gB 和gC 主要免疫基因與以前毒株相比發(fā)生了基因的插入或缺失以及點(diǎn)突變，導(dǎo)致產(chǎn)生中和抗體位點(diǎn)發(fā)生突變[12-16]。 中和抗體是針對(duì)完整的病毒抗原決定簇，因此，檢測(cè)中和抗體可反應(yīng)機(jī)體的保護(hù)作用。

測(cè)定發(fā)病前母豬血清中針對(duì)此毒株的中和抗體效價(jià)，中抗體陽(yáng)性率為100%，達(dá)到1∶16的比例為36.36%，達(dá)到1 ∶32 的比例為0.00%，說(shuō)明免疫C 株疫苗不能刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)此毒株的較高中和抗體。 替換成與該毒株同源性較高的HB2000 疫苗免疫后，再次檢測(cè)gE 抗體陰性的母豬血清中和抗體，≥1∶32 的比例達(dá)到了68.75%，此時(shí)豬群生產(chǎn)指標(biāo)恢復(fù)正常，可能使用同源性較低的疫苗毒株免疫豬群是此次豬場(chǎng)發(fā)病的主要原因，推斷當(dāng)豬群中和抗體≥1∶32 的比例達(dá)到60%以上時(shí)，可保護(hù)gE 陽(yáng)性豬場(chǎng)的豬群不發(fā)病。 gB ELISA 抗體檢測(cè)試劑盒只是檢測(cè)gB 抗體，無(wú)法詳細(xì)了解豬群實(shí)際的保護(hù)作用[17]，研發(fā)出與中和抗體相關(guān)性較高的檢測(cè)方法對(duì)PR 免疫效果的監(jiān)測(cè)有重大意義。

母豬感染PRV 后表現(xiàn)出不同的臨床癥狀，妊娠前期感染返情率可高達(dá)90%[18]，中期或者后期感染可出現(xiàn)流產(chǎn)或產(chǎn)死胎，臨產(chǎn)母豬感染，會(huì)因垂直傳播直接引起后代仔豬患病[19，20]。 此豬場(chǎng)規(guī)模較大，有4 條生產(chǎn)線(xiàn)，發(fā)病期內(nèi)，不同懷孕階段母豬均出現(xiàn)癥狀，導(dǎo)致本場(chǎng)整體的流產(chǎn)率、死胎率和木乃伊胎率較高，斷奶仔豬成活率較低，歷時(shí)4 個(gè)月時(shí)間，給豬場(chǎng)帶來(lái)了較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，研究PR 發(fā)病原因、免疫方法和評(píng)估免疫效果對(duì)PR防控具有重大意義。