鄧方祺 劉思 羅小華 柳宇峰 施歌

1中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院醫(yī)學(xué)美容整形中心（廣州 510655）；2廣州市黃埔區(qū)中六生物醫(yī)學(xué)創(chuàng)新研究院（廣州 510799）

從大黃、蘆薈、虎杖、何首烏和虎杖等藥用植物根與皮中提取的大黃素，為1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，在中醫(yī)中廣泛用于解滯、清濕熱、瀉火、涼血、散瘀解毒。有研究表明它能減輕肺損傷［1］、治療結(jié)腸炎［2］、可以提高卵巢癌細胞對卡鉑敏感性［3］、誘導(dǎo)白血病HL-60 細胞凋亡［4］，可見其具有廣泛的抗炎、抗癌作用。也有報道稱其可通過抗炎活性、脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、抗細胞凋亡和血管保護等機制治療動脈粥樣硬化［5］，YU 等［6］的研究則表明大黃素能夠抑制高脂飲食喂養(yǎng)小鼠脂肪組織中的脂質(zhì)積，這些研究提示脂質(zhì)代謝密切相關(guān)。那么，大黃素是否能對與過量皮脂生成密切相關(guān)的尋常痤瘡（acne vulgaris）［7-8］有作用？人們已經(jīng)清楚表皮脂質(zhì)的含量和成份隨著角質(zhì)形成細胞的分化而不斷變化［9］，也有研究提示角質(zhì)形成細胞的皮脂合成增加與痤瘡發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。為此，我們以HaCaT 人永生化角質(zhì)形成細胞為細胞模型，探究了大黃素對人永生化角質(zhì)形成細胞增殖、凋亡和脂質(zhì)合成等生理學(xué)特性的影響，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 HaCaT 人永生化角質(zhì)形成細胞，購自南京凱基生物有限公司（產(chǎn)品編號：KG300）。

1.1.2 藥物與試劑 大黃素、油紅O 染色劑購自美國Sigma-Aldrich 公司；CCK-8、AnnexinV、FITC 凋亡檢測試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；胎牛血清、DEME 高糖培養(yǎng)基、PBS、0.25%胰酶購自美國Gibco 公司；Bcl-2、Bax、PPARγ、Akt、p-Akt、FoxO1、p-foxO1 等之抗體購自美國CST 公司；PCNA、β-actin、SREBP-1、LXR、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG 等之抗體購自美國SantaCruze 公司；ECL 檢測試劑盒購自美國Invitrogen 公司。

1.2 儀器 Miltiskan FC 酶標(biāo)儀、EvosFLAuto2 細胞成像系統(tǒng)、電泳儀、水平電泳槽為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品，Qsonica Q700 超聲波細胞破碎儀為美國Qsonica 公司產(chǎn)品，CytoFLEX 流式細胞儀為美國Beckman 公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 HaCaT 角質(zhì)形成細胞培養(yǎng) 用含10% FBS和1%雙抗的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)HaCaT，于5% CO2孵箱37 ℃培養(yǎng)，每天洗滌細胞并更換培養(yǎng)液（下同）；用0.25%胰蛋白酶進行消化、傳代，當(dāng)細胞融合程度達到50%時，分別加入含有濃度為0、25、50、100 μmol/L 的大黃素的培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育24 h。

1.3.2 結(jié)晶紫染色觀察大黃素對細胞集落形成的影響 將細胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，PBS 浸洗細胞2 次，每孔加入預(yù)冷4%多聚甲醛室溫固定細胞20 min，棄甲醇，PBS 浸洗2 次，置于搖床輕柔洗滌，每次5 min；加入結(jié)晶紫染色液染色10 min，棄去染色液，PBS 浸洗2 遍，熒光顯微鏡觀察拍照。

1.3.3 CCK-8 細胞活力檢測 細胞經(jīng)胰酶消化后，加入100 μL 細胞懸液于96 孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)5 ～6 個復(fù)孔，后向培養(yǎng)板每孔加入10 μL CCK-8液，孵育1 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm 處的吸光度。

1.3.4 TUNEL 熒光染色檢測細胞集落 重復(fù)1.3.2細胞培養(yǎng)和固定步驟，然后在每孔加入稀釋后的TUNEL 檢測液50 μL，37 ℃箱孵60 min；棄去TUNEL 染液，PBS 浸洗2 遍，取出爬片，封片后熒光顯微鏡觀察拍照。以上操作均收集3 次樣本進行重復(fù)實驗。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測周期和凋亡 將HaCaT 接種于6 孔板中培養(yǎng)，吸除細胞培養(yǎng)液后用胰酶消化細胞，制備成單細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，離心沉淀細胞后棄上清，用預(yù)冷PBS 潤洗一遍，再次離心棄去上清收集細胞；向離心管中加入1 × Binding Solution 重懸細胞，充分混勻后，轉(zhuǎn)移至流式細胞術(shù)檢測管，依次加入Annexin V-FITC 結(jié)合物和PI Solution各5 μL，輕晃混勻，室溫下避光孵育15 min，再加入400 μL 1xAnnexinV Binding Solution，流式儀上機檢測。

1.3.6 Western Blot 檢測增殖、凋亡及成脂因子蛋白表達 將細胞接種于60 mm 培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入蛋白質(zhì)裂解液，用細胞刮刮取收集于EP 管中，使用超聲波細胞破碎儀超聲裂解蛋白，4 ℃12 000 r/min離心15 min；吸取上清液至新的EP 管，使用BCA測定法分析蛋白質(zhì)濃度，配平各組體積和質(zhì)量，制備蛋白樣品；用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉90 min；加入濃度為1∶1 000 的鼠抗人PCNA、p-Akt、Akt、FOXO1、p-FOXO1、PPARγ、SREBP-1、LXR、β-actin、Bcl-2、Bax一抗，孵育床室溫孵育1 h，4 ℃過夜；加入濃度為1∶5 000 的上述一抗的兔抗鼠二抗，孵育床室溫孵育1 h，使用增強型化學(xué)發(fā)光液（ECL）顯影定影，置于凝膠成像儀顯影并拍照，使用Image J 軟件，以β-actin 為內(nèi)參，比較各蛋白表達水平。操作均收集3 次獨立樣本進行重復(fù)實驗。

1.3.7 油紅O 檢測觀察皮脂分泌水平 重復(fù)1.3.2細胞培養(yǎng)和固定步驟，以后每孔加入0.5%油紅O染液，37 ℃恒溫箱染色10 min；棄油紅O 染液，PBS洗2 遍，風(fēng)干后加入100%異丙醇37°C 溫箱孵育10 min；分光光度計在500 nm 波長處檢測吸光度，繪制濃度曲線。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 用Graph Pad Prism8.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計和繪圖分析。所有數(shù)據(jù)均以（±s）表示，采用單因素方差分析及事后檢驗來分析統(tǒng)計學(xué)差異，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大黃素對HaCaT 細胞增殖的影響 經(jīng)不同濃度大黃素溶液處理HaCaT 細胞24 h 后，光鏡下結(jié)晶紫染色可見，細胞集落數(shù)量及融合度與大黃素濃度呈負相關(guān)，細胞形態(tài)未見明顯變化（圖1A）；CCK-8 試驗顯示，大黃素明顯抑制HaCaT 細胞增殖，與濃度呈正相關(guān)（P＜0.001，圖1B）。Western blot 結(jié)果則提示大黃素明顯抑制PCNA 蛋白表達（圖1C）。

圖1 大黃素對HaCaT 細胞增殖的影響Fig.1 Effect of emodin on proliferation of HaCaT cells

2.2 大黃素對HaCaT細胞周期的調(diào)控作用 FACS檢測發(fā)現(xiàn)，大黃素處理HaCaT 角質(zhì)形成細胞中，G1期細胞比例增加且與其濃度呈正相關(guān)，S 期、G2/M期細胞比例減少但與其濃度呈負相關(guān)（圖2）。

圖2 大黃素對HaCaT 細胞周期的調(diào)控作用Fig.2 Regulation of emodin on HaCaT cell cycle

2.3 大黃素對HaCaT 細胞凋亡的影響 TUNEL 熒光染色結(jié)果提示，處理組綠光熒染凋亡細胞數(shù)量隨大黃素濃度升高而逐漸增多（圖3A）。FACS 檢測和定量分析結(jié)果顯示大黃素處理組較對照組細胞早、晚期凋亡率均有明顯升高（P＜0.05，圖3B）。Western blot 結(jié)果提示，大黃素可以下調(diào)Bcl-2 表達和上調(diào)Bax 表達，作用強弱與濃度呈正相關(guān)（P＜0.05，圖3C）。

圖3 大黃素對HaCaT 細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of emodin on apoptosis of HaCaT cells

2.4 大黃素對HaCaT 細胞皮脂分泌的影響 圖4（A）顯示ORO 染色光鏡下可見胞質(zhì)內(nèi)紅色點狀脂滴累積減少與大黃素濃度正相關(guān)，細胞體積也發(fā)生由大到小的漸進變化。Western blot 結(jié)果表明，低濃度大黃素僅下調(diào)PPARγ 蛋白表達（P＜0.05），而高濃度則可使PPARγ、SREBP-1 和LXR 三種關(guān)鍵成脂因子表達均發(fā)生下調(diào)（P＜0.05，圖4B）。

圖4 大黃素對HaCaT 細胞皮脂合成與分泌的影響Fig.4 Effects of emodin on sebum synthesis and secretion in HaCaT cells

2.5 大黃素對HaCaT 細胞中皮脂合成通路IGF-1/Akt/FoxO1 的影響 ORO 染色光鏡下可見：IGF-1處理HaCaT 細胞質(zhì)內(nèi)紅色點滴狀中性脂滴蓄積較空白對照組顯著增加（P＜0.001），而IGF-1+50 μmol/L 處理組細胞較IGF-1 處理組細胞明顯減少（P＜0.001，圖5A）。Western blot 結(jié)果表明，IGF-1處理HaCaT 細胞Akt 和FoxO1 磷酸化水平較空白對照組增加（P＜0.05），而IGF-1 + 50 μmol/L 處理組細胞較IGF-1 處理組細胞則顯著降低（P＜0.05，圖5B）。

圖5 大黃素對HaCaT 細胞中皮脂合成通路IGF-1/Akt/FoxO1 的影響Fig.5 Effects of emodin on sebum synthesis pathway IGF-1/Akt/FoxO1 in HaCaT cells

3 討論

細胞的角化過度是痤瘡產(chǎn)生的原因之一，涉及角質(zhì)形成細胞的過度增殖和異常分化［11］。細胞凋亡是皮膚中調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細胞增殖和表皮生長的生理過程。Bcl-2、Bax 是在細胞凋亡調(diào)控起重要作用［11］。Bcl-2為抗凋亡蛋白，通過抑制線粒體釋放細胞色素C下調(diào)Caspase激活水平而抑制細胞凋亡。Bax為促凋亡蛋白，在凋亡刺激下發(fā)生構(gòu)象變化，遷移到線粒體外膜并寡聚化而形成孔隙，導(dǎo)致細胞色素C 從線粒體釋放到細胞質(zhì)中，隨后激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶級聯(lián)，與Bcl-2 相拮抗而促進細胞凋亡［12］。本實驗結(jié)果顯示大黃素對角質(zhì)形成細胞具有濃度依賴性的G1/S 期阻滯作用（圖2），增殖標(biāo)志物PCNA 表達下調(diào)也證實了這一點（圖1）。同時實驗結(jié)果還提示大黃素可增加細胞凋亡且與濃度呈正相關(guān)，其作用機制可能為下調(diào)Bcl-2 蛋白表達和上調(diào)Bax 蛋白表達所致（圖3）。

目前的研究表明皮脂分泌過度會引發(fā)皮脂腺毛囊的炎癥并誘導(dǎo)痤瘡形成［13］，如何減少皮脂的過量產(chǎn)生是痤瘡治療的關(guān)鍵，而IGF-1/Akt/FoxO1通路在包括角質(zhì)形成細胞在內(nèi)的多種細胞類型的脂質(zhì)合成和代謝、細胞生長和存活中發(fā)揮重要作用［14］。IGF-1 與其受體結(jié)合后，激活PI3K/Akt 通路［15］。Akt 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，被磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）磷酸化后激活［16］。在脂質(zhì)合成中，活化的Akt 通過抑制FoxO1 促進脂質(zhì)生成［17］。IGF-1 激活皮脂腺細胞中PI3K/Akt 信號通路，抑制FoxO1 表達，增強下游成脂因子PPARγ、LXR、SREBP-表達，從而促進皮脂生成和分泌。本研究結(jié)果顯示大黃素可通過促進角質(zhì)形成細胞凋謝亡（圖3）、抑制IGF-1/Akt/FoxO1 通路（圖5）而限制細胞分泌皮脂。FoxO1 作為一種轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下皮脂腺細胞胞質(zhì)中FoxO1 不斷進入胞核中，可抑制核受體PPARγ、LXR 及SREBP-1 轉(zhuǎn)錄［18-19］，而減少皮脂腺細胞增殖及皮脂分泌、降低炎癥因子釋放，從而而阻止痤瘡的發(fā)生。但IGF-1 則可通過PI3K/Akt 途徑促進FoxO1 磷酸化［20］轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)內(nèi)而促進細胞的皮脂分泌，我們的實驗研究結(jié)果則提示大黃素可以通過抑制Akt/FoxO1 通路的激活而拮抗IGF-1 活性（圖5）。不過，我們未對胞核和胞質(zhì)內(nèi)Akt、FoxO1 及其磷酸化蛋白的表達進行定位研究，有待進一步探索。

至于大黃素在細胞脂質(zhì)代謝中的作用，研究［21-23］發(fā)現(xiàn)大黃素可抑制細胞增殖與分化、減少脂質(zhì)合成、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)等，并指出其機制與Pl3K/Akt 通路活性調(diào)節(jié)、抑制Akt 磷酸化、下調(diào)SREBP、C/EBP 等脂質(zhì)合成相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。SU 等［24］也發(fā)現(xiàn)大黃素可降低肥胖小鼠的血清和肝臟中的膽固醇含量與下調(diào)SREBP-2 表達水平。這些結(jié)果與我們的研究總體趨于一致，但大黃素是否通過影響成脂因子進而調(diào)控角質(zhì)形成細胞的皮脂合成與分泌目前筆者尚未查見相關(guān)文獻報道，我們的結(jié)果提示大黃素可以抑制角質(zhì)細胞皮脂分泌而降低皮脂分泌水平，也由此可以想見大黃素這一天然化合物具有抗痤瘡治療功效，在痤瘡預(yù)防和治療中應(yīng)占一席之地。

【Author contributions】DENG Fangqi and LIU Si performed the experiments and wrote the article.LUO Xiaohua and LIU Yufeng performed the experiments.SHI Ge designed the study and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.