王曉煥,尹昭,曹鴻鹍

2015年數(shù)據(jù)顯示,全球每年有超過1 700萬人死于心血管疾病,為主要的死亡原因之一,部分國家心血管疾病的死亡人數(shù)遠超癌癥死亡人數(shù),而冠心病(CAD)在心血管疾病中所占比例較大[1]。有研究[2]表明,高血壓、吸煙、肥胖、糖尿病及膽固醇升高為CAD預測因子。近年來研究[3-4]提示,遺傳因素在CAD發(fā)病中所起作用占20%～60%,多數(shù)常見的基因變異可能與CAD的發(fā)生、發(fā)展相關[3-4]。揮發(fā)性分子一氧化氮(nitric oxide,NO)由L-精氨酸通過神經(jīng)元NO合成酶、誘導型NO合成酶及內皮NO合成酶(eNOS)催化合成[5]。NO為生理過程的主要第二信使,對維持血管張力和血壓起著關鍵作用[5]。推測eNOS基因可能參與CAD發(fā)病。eNOS基因存在許多變異,包括編碼序列、5'側翼區(qū)及內含子多態(tài)性。關于eNOS基因多態(tài)性與CAD的關聯(lián)性研究多集中于第7外顯子中的G894T(rs1799983),該變異由Glu-Asp替代(Glu298Asp)引發(fā)[6]。盡管多項研究[7-20]報道了eNOS基因多態(tài)性(包括G894T)與CAD發(fā)生的關聯(lián)性,但結果存在爭議。本研究旨在探索云南漢族人群eNOS基因Tag SNPs與CAD發(fā)生發(fā)展的潛在關聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012—2015年云南省第二人民醫(yī)院收治的云南漢族冠心病患者514名作為冠心病組。納入標準:均接受標準化冠狀動脈造影術,一支或多支主要冠狀動脈直徑狹窄≥50%;由至少兩位心臟病專家診斷。另選取同期云南省第二人民醫(yī)院健康體檢中心體檢排除CAD的云南漢族健康體檢者198名作為對照組。所有受試者均獲得知情同意,研究經(jīng)云南省第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 收集2組受試者外周靜脈血3 mL,放于含有EDTA二鈉作為抗凝劑的試管。用酚氯仿法提取外周血淋巴細胞基因組DNA。所有DNA樣品均溶于不含DNA酶的水中,保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 基因分型 在HapMap-CHB數(shù)據(jù)庫中,選擇MAF>10%(http://www.hapmap.org/)SNP,采用HaploView軟件包基于連鎖不平衡(r2≥0.8)篩選獲得eNOS基因的6個Tag SNP(rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186、rs7830)作為遺傳標記。采用MALDI-TOF-MS方法,以表1所示的序列為擴增引物和延伸引物,使用SEQUENOM質量陣列系統(tǒng)對SNP進行基因分型。

表1 eNOS單核苷酸多態(tài)性引物

2 結果

2.1 2組受試者一般資料比較 冠心病組年齡、BMI、TC、TG、HDL-C及LDL-C水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2組間性別、收縮壓及舒張壓比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 2組受試者一般資料比較

2.2 2組受試者eNOS Tag SNP基因型分布比較 對照組人群基因分型均符合HWE(哈德溫平衡)。2組受試者eNOS Tag SNP基因型和等位基因分布比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3,表4。多變量Logistic回歸分析結果顯示,矯正年齡、性別、BMI、血脂、血壓后,rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186及rs78306個eNOSTag SNP基因型和等位基因分布與CAD發(fā)病無關(P>0.05)。見表5。

表3 2組受試者基因型分布比較

表4 2組受試者等位基因分布比較

表5 eNOS Tag SNP顯性、共顯性模型與CAD發(fā)病的Logistic回歸分析

2.3 eNOS Tag SNP單倍型與CAD發(fā)病的多因素Logistic回歸分析 對6個eNOS Tag SNP(rs1800783、rs1799983、rs743507、rs3918184、rs3918186及rs7830)構建單倍型,排除MAF頻率<0.001的單倍型后共建立24個單倍型。多因素Logistic回歸分析結果顯示,Hap1、Hap2、Hap3、Hap4、Hap5、Hap6、Hap7、Hap8、Hap9及Hap10單倍型均與CAD發(fā)病風險無關(P>0.05)。其余14個單倍型個數(shù)小于1,未做分析。見表6。

3 討論

心血管疾病人群發(fā)病率高,全球范圍內醫(yī)療負擔重[21]。CAD作為心血管疾病占比較大的疾病,其發(fā)生、發(fā)展受遺傳和環(huán)境因素的綜合作用。研究[3-4]表明,遺傳因素參與了CAD發(fā)病。盡管有研究[22]探索了遺傳因素與CAD的關聯(lián)性,但可能因研究對象存在種族差異等原因,研究結果不盡相同[23]。

血管內皮對維持血管完整性起著重要作用,內皮功能障礙在動脈粥樣硬化和其他心血管疾病發(fā)病機制中起著重要作用,可增加心血管不良事件的發(fā)生風險[24]。動脈粥樣硬化患者體內存在促氧化和抗氧化失衡[25]。NO是由血管內皮細胞釋放,其可調節(jié)血管舒縮張力。動脈粥樣硬化與內皮功能障礙和 NO生物利用度降低有關[26]。內皮源性NO是由eNOS催化產(chǎn)生,可抑制血小板聚集,減少白細胞與血管內皮的粘附[27]。NO減少與血管功能障礙有關[25]。人eNOS基因位于第7號染色體上,由26個外顯子組成,約21kb[28]。關于eNOS基因多態(tài)性與CAD相關性報道多集中于第7外顯子中的G894T(rs1799983)[7]。G894T(rs1799983)變異為谷氨酸在基因298位點(Glu298Asp)上發(fā)生變異,對應的eNOS區(qū)域易被eNOS酶裂解[29], G894T可能影響血漿NO水平[30],參與CAD發(fā)病。但關于eNOS-G894T多態(tài)性與CAD發(fā)病機制的關聯(lián)性研究結論不一致[11, 13-19, 31]。eNOS-G894T基因多態(tài)性與延邊地區(qū)老年CHD和心肌梗死(MI)發(fā)病可能相關,T等位基因可能為易感基因[32];而在韓國人群中未發(fā)現(xiàn)G894T與CAD發(fā)病的相關性[10]。有研究[29-33]報道了eNOS-T786C和4a4b多態(tài)性與CAD發(fā)病風險的相關性;針對中國漢族人群的研究[31]發(fā)現(xiàn),eNOS多態(tài)性rs1799983和rs20707744可能與CAD的發(fā)病相關。巴基斯坦一項研究[11]表明,rs1799983與冠狀動脈疾病相關。關于eNOS基因多態(tài)性與CAD發(fā)病風險的研究結果也不一致[7, 9-19, 31, 34-35],2者間的相關性仍有待進一步驗證[36]。本研究評估了6個eNOS Tag SNP(rs1800783,rs1799983,rs743507,rs3918184,rs3918186、rs7830)與CAD間的潛在關聯(lián)。結果顯示,2組間6個eNOS Tag SNP基因型、等位基因分布均無差異,多因素分析也顯示,在校正年齡、性別、BMI、血脂、血壓后,eNOS Tag SNP基因型和單倍型均與CAD發(fā)病無關。這與之前部分研究[31-32]結果得出的rs1799983與CAD關聯(lián)性的結論不一致?？赡芘c種族差異、樣本量不足有關。rs1800783,rs743507,rs3918184,rs3918186、rs7830與CAD的關聯(lián)性為本研究首次探索,結論亦可能存在種族差異、樣本量不足等因素影響。本研究還存在一些不足:(1)樣本來源于醫(yī)院病人,可能存在選擇偏倚;(2)2組年齡、體質量指數(shù)、甘油三酯及低密度脂蛋白不匹配,可能存在混雜偏移。CAD是多基因病,可能存在其它與CAD發(fā)病相關的基因變異。盡管有GWAS研究[37]顯示,eNOS/NO通路參與了CAD的發(fā)生、發(fā)展,但同一位點基因變異仍需要深入研究。

綜上所述,本研究尚不支持在云南漢族人群中eNOS多態(tài)性、單倍型與冠心病發(fā)病風險的關聯(lián)性。