侯曉麗,張亞慧,唐迎樂(lè),程宏*

帕金森病(parkinson’s disease, PD) 是一種常見(jiàn)的影響中老年人運(yùn)動(dòng)功能的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性變性疾病[1-2]。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)步態(tài)異常等,病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元缺失、殘存神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)Lewy小體,迄今為止,PD發(fā)病機(jī)制不清[3-5]。魚藤酮作為一種殺蟲劑可能對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)的功能產(chǎn)生影響,魚藤酮誘導(dǎo)的PD動(dòng)物模型是一個(gè)較成功的環(huán)境毒素PD模型[6]。本課題組采用具有緩釋作用的魚藤酮納米脂質(zhì)載體(rotenone nanostructured lipid carriers,R-NLC)建立了一種長(zhǎng)期的慢性魚藤酮暴露,個(gè)體差異小、死亡率低的PD大鼠模型[7-8]。

人參皂苷Rg3是人參的重要活性成分,對(duì)人體內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、物質(zhì)代謝等生命過(guò)程均有作用[9-10]。最近研究[11-12]認(rèn)為Rg3對(duì)非小細(xì)胞肺癌以及新冠病毒引起的部分癥狀都有較好的治療效果,Rg3能降低自由基水平,維持正常線粒體膜電位,改善受損線粒體氧化磷酸化功能,減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡。本研究以R-NLC制備PD大鼠模型,通過(guò)行為學(xué)實(shí)驗(yàn)、黑質(zhì)HE染色和透射電鏡觀察,檢測(cè)人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)表現(xiàn)、神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)以及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物與分組 Sprague Dawley (SD)雄性成年大鼠36只,體質(zhì)量(185±20)g,由揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SPF級(jí),許可證號(hào):SYXK(蘇)2007-0005,自由飲食飲水及活動(dòng)。SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組和陽(yáng)性藥物組,每組6只,分別編號(hào)1～6號(hào)。各組大鼠均于造模前3 d開(kāi)始給藥,每天1次,連續(xù)31 d,低劑量組給予3 mg/kg Rg3灌胃、中劑量組給予6 mg/kg Rg3灌胃、高劑量組給予12 mg/kg Rg3灌胃、陽(yáng)性藥物組給予11 mg/kg司來(lái)吉蘭灌胃,對(duì)照組及模型組給予同等劑量羧甲基纖維素鈉CMC-Na灌胃。灌胃3天后,除對(duì)照組外其余5組大鼠均皮下注射R-NLC,首劑量給予0.5 mg/kg,第2次給予0.8 mg/kg,此后每次1 mg/kg,2 d一次,連續(xù)28 d,對(duì)照組皮下注射同等劑量空白納米脂質(zhì)載體。采用肌僵直實(shí)驗(yàn)和評(píng)分法考察外觀行為學(xué)表現(xiàn);黑質(zhì)HE染色和透射電鏡觀察神經(jīng)元形態(tài)和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)情況。

1.2 試劑與儀器 人參皂苷-Rg3(純度98%)購(gòu)自吉林大學(xué)植化室;鹽酸司來(lái)吉蘭片購(gòu)自南京思科藥業(yè);羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)購(gòu)自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所;魚藤酮購(gòu)自廣東省豐順化工廠;泊洛沙姆188(F-68)購(gòu)自南京威爾化工有限公司;大豆磷脂購(gòu)自上海太偉藥業(yè)有限公司;辛酸/癸酸三甘油酯購(gòu)自浙江嘉興市滬東日用助劑廠;三硬脂酸甘油酯購(gòu)自上?；瘜W(xué)試劑有限公司。配制R-NLC[7]:稱取處方量魚藤酮、三硬脂酸甘油酯、辛酸/癸酸三甘油酯至一大試管中,加熱、超聲溶解,作為油相;稱取處方量F-68、大豆磷脂,攪拌溶解,作為水相。將水相用針管緩緩加入油相中,邊加邊攪拌,在75 ℃、20 000 r/min條件下高速攪拌10 min,然后在75 ℃水浴中超聲,放冰箱低溫固化,得R-NLC混懸液。不加入魚藤酮,其他步驟同上,得空白NLC混懸液。配制人參皂苷Rg3溶液:稱取60 mg人參皂苷Rg3加入0.5% CMC-Na 20 mL,振搖、混旋,得3 mg/mL人參皂苷Rg3溶液,此為高劑量組,再將該溶液分別稀釋1倍和2倍得中劑量組和低劑量組。配制司來(lái)吉蘭溶液:136 mg司來(lái)吉蘭溶解于0.5% CMC-Na 20 mL溶液。使用儀器:數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司);電子天平(Sartorius,德國(guó));臺(tái)式離心機(jī)(MODEL550,德國(guó)Eppendorf);恒溫磁力攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司);高速均質(zhì)乳化機(jī)(PT-3100,瑞士POLYTRON);高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);超低溫冰箱(-86 ℃,美國(guó)Thermo Scientific Revco);石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司);透射電子顯微鏡(Tecnai,荷蘭PHILIPS)。

1.3 外觀行為表現(xiàn)評(píng)分 對(duì)大鼠的行為表現(xiàn)進(jìn)行評(píng)分[13]:大鼠出現(xiàn)拒捕行為減弱,毛色變黃變臟,弓背,主動(dòng)活動(dòng)減少記為1分;動(dòng)作遲緩,并有震顫或有步態(tài)不穩(wěn)記為2分;步態(tài)不能成一條直線,出現(xiàn)單側(cè)旋轉(zhuǎn)記為4分;單側(cè)癱瘓,行走困難,進(jìn)食困難記為6分;完全癱瘓,不能進(jìn)食記為8分;瀕臨死亡或死亡記為10分。

1.4 肌僵直實(shí)驗(yàn) 大鼠肌僵直實(shí)驗(yàn)反映的是大鼠運(yùn)動(dòng)的啟動(dòng)難易,用移動(dòng)潛伏期時(shí)間來(lái)表示,時(shí)間短表明啟動(dòng)容易,而時(shí)間長(zhǎng)表明啟動(dòng)困難,對(duì)應(yīng)PD患者的癥狀是運(yùn)動(dòng)遲緩。應(yīng)用網(wǎng)格試驗(yàn):實(shí)驗(yàn)裝置為一個(gè)與水平面垂直的金屬網(wǎng)格(60 cm×40 cm,格間距為1 cm);將大鼠頭朝上置于金屬網(wǎng)格中央,使與地面垂直,趾爪均抓住金屬網(wǎng)格;用秒表記錄大鼠靜止?fàn)顟B(tài)至任意一爪移動(dòng)時(shí)所需的時(shí)間,即為移動(dòng)潛伏期[14]。

1.5 HE染色 各組大鼠取一半用1%戊巴比妥鈉麻醉后,迅速斷頭,取腦,置于4 ℃的40%多聚甲醛溶液中固定。石蠟包埋切片,切片厚5μm,HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各細(xì)胞的形態(tài)并攝片[15]。

1.6 黑質(zhì)透射電鏡觀察 各組大鼠取一半用1%戊巴比妥鈉麻醉后,迅速斷頭,取黑質(zhì)組織,雙面刀片把樣品切割成1 mm×1 mm×1 mm小塊,置于4 ℃的2.5%戊二醛溶液中固定,環(huán)氧樹脂包埋,超薄切片,乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色,透射電子顯微鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)變化[16]。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠外觀行為表現(xiàn)的影響 對(duì)照組外觀行為表現(xiàn)正常,外觀行為表現(xiàn)評(píng)分為0分;模型組大鼠出現(xiàn)姿態(tài)不穩(wěn)、精神萎靡等癥狀,外觀行為表現(xiàn)評(píng)分高于1分,且隨造模時(shí)間增加而升高,至第28天外觀行為表現(xiàn)評(píng)分平均值高于5分;Rg3低劑量組及中劑量組大鼠自發(fā)活動(dòng)正常,肌肉不強(qiáng)直,外觀行為表現(xiàn)評(píng)分均低于或接近1分;Rg3高劑量組及陽(yáng)性藥物組大鼠步態(tài)穩(wěn)定,精神亢奮,自發(fā)活動(dòng)多,未見(jiàn)異常表現(xiàn),外觀行為表現(xiàn)評(píng)分為0分。見(jiàn)表1、圖1。

圖1 Rg3對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響

表1 Rg3對(duì)PD模型大鼠行為學(xué)評(píng)分的影響

2.2 人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠移動(dòng)潛伏期的影響 對(duì)照組大鼠移動(dòng)潛伏期小于1.5秒,表現(xiàn)正常;模型組大鼠移動(dòng)潛伏期平均值從4.32秒到14.17秒,高于對(duì)照組(P<0.05);低、中、高劑量人參皂苷Rg3組與陽(yáng)性藥物組均見(jiàn)潛伏期縮短,潛伏期平均值在0.26秒至3.35秒之間,低于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

圖2 Rg3對(duì)PD模型大鼠移動(dòng)潛伏期的影響

表2 Rg3對(duì)PD模型大鼠移動(dòng)潛伏期的影響

2.3 人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響

2.3.1 HE染色觀察黑質(zhì)神經(jīng)元形態(tài) 與對(duì)照組相比,模型組大鼠神經(jīng)元減少,尼氏體減少,神經(jīng)元出現(xiàn)核固縮,胞體縮小,細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)出現(xiàn)邊集現(xiàn)象,有的出現(xiàn)嗜酸性細(xì)胞;低、中、高劑量人參皂苷Rg3組與陽(yáng)性藥物組可見(jiàn)更多正常形態(tài)神經(jīng)元,減少尼氏體的消失,減少細(xì)胞死亡。見(jiàn)圖3。

3A 對(duì)照組 3B 模型組 3C Rg3低劑量組 3D Rg3中劑量組 3E Rg3高劑量組 3F 司來(lái)吉蘭組

2.3.2 透射電鏡觀察黑質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 對(duì)照組神經(jīng)元細(xì)胞核大而圓,核膜完整,可見(jiàn)膜間隙,核膜上有較多的核糖體,細(xì)胞核內(nèi)著色均勻,可見(jiàn)常染色質(zhì)與異染色質(zhì),核仁大且圓,著色較深,無(wú)明顯異染色質(zhì)邊聚現(xiàn)象,細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)較多完整的線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu),線粒體中可見(jiàn)清晰的嵴,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)多為粗面型的,上有較多核糖體,較多為扁平囊狀,無(wú)腫脹擴(kuò)張現(xiàn)象(圖4A)。模型組神經(jīng)元細(xì)胞稍有皺縮,細(xì)胞體積變小,細(xì)胞核膜邊界不清晰,少見(jiàn)膜間隙,核膜上少見(jiàn)核糖體,核仁體積變小,染色質(zhì)凝聚成塊并有邊聚傾向;胞漿體積變小,細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞器數(shù)量減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上核糖體數(shù)量減少,線粒體出現(xiàn)嵴部分溶解現(xiàn)象,線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)出現(xiàn)腫脹、擴(kuò)張現(xiàn)象,有空泡產(chǎn)生(圖4B)。經(jīng)過(guò)低、中、高劑量人參皂苷Rg3干預(yù),與模型組相比,神經(jīng)元細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)正常,少見(jiàn)細(xì)胞皺縮,細(xì)胞核膜清晰,核仁大而圓,細(xì)胞質(zhì)中可見(jiàn)正常完整的細(xì)胞器,與正常組接近;高劑量Rg3及陽(yáng)性藥物干預(yù)后未見(jiàn)結(jié)構(gòu)異常細(xì)胞(圖4C-4F)。

4A 對(duì)照組 4B 模型組 4C Rg3低劑量組 4D Rg3中劑量組 4E Rg3高劑量組 4F 陽(yáng)性藥物組。

3 討論

近年來(lái),魚藤酮作用于培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞或動(dòng)物模型后導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象被廣泛研究[17-18]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果提示人參皂苷Rg3在體外能夠抑制MPP+(1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶)誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡[19]。此外也有報(bào)道[20-21]證實(shí)魚藤酮可激活Caspase-3等凋亡途徑參與PC12細(xì)胞的凋亡過(guò)程,發(fā)現(xiàn)魚藤酮可通過(guò)升高NO含量引起線粒體膜通透性增加,由此產(chǎn)生一系列關(guān)鍵性變化,包括Cyt c的釋放、線粒體跨膜電位的下降等,最終導(dǎo)致Caspase-3激活,并進(jìn)一步激活下游的Caspase引起細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)前期研究表明,應(yīng)用R-NLC制備PD大鼠模型比用魚藤酮溶液效果更好,因此,本實(shí)驗(yàn)選用R-NLC來(lái)制備PD大鼠模型,進(jìn)一步探討人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

PD患者的癥狀主要有靜止性震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩和姿勢(shì)不穩(wěn)等,本研究對(duì)各組大鼠進(jìn)行外觀行為表現(xiàn)評(píng)分,檢測(cè)各組大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)。結(jié)果顯示,模型組出現(xiàn)了毛色變臟、弓背、動(dòng)作遲緩,并有震顫、步態(tài)不穩(wěn)甚至癱瘓等癥狀,外觀行為表現(xiàn)評(píng)分集中在4～7分左右,與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;與模型組相比,低、中、高劑量Rg3組顯示PD癥狀減輕,自主活動(dòng)能力增強(qiáng),運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力改善,外觀行為表現(xiàn)評(píng)分集中在1～2分之間,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從大鼠外觀行為表現(xiàn)評(píng)分可見(jiàn),人參皂苷Rg3可改善PD模型大鼠行為學(xué)表現(xiàn),且與陽(yáng)性藥物組效果相似,這與之前的研究[19]結(jié)果一致。

本項(xiàng)研究還開(kāi)展了肌僵直實(shí)驗(yàn),分析大鼠移動(dòng)潛伏期的變化。與對(duì)照組相比,模型組的移動(dòng)潛伏期時(shí)間明顯延長(zhǎng),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與模型組相比,低、中、高劑量Rg3給藥組移動(dòng)潛伏期時(shí)間明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示人參皂苷Rg3和陽(yáng)性藥物司來(lái)吉蘭均對(duì)PD模型大鼠的行為學(xué)障礙有改善作用。

PD的主要病理改變是中腦腹側(cè)特別是黑質(zhì)致密部DA能神經(jīng)元進(jìn)行性變性缺失。近年資料[22]表明,細(xì)胞凋亡可能是PD發(fā)病機(jī)制涉及的一條共同通路,細(xì)胞凋亡是受特定基因經(jīng)特定信號(hào)傳導(dǎo)途徑調(diào)控的細(xì)胞死亡的一種形式,其形態(tài)改變主要在細(xì)胞核,有區(qū)別于壞死的典型特征。本研究應(yīng)用HE染色和透射電鏡技術(shù)檢測(cè)人參皂苷Rg3對(duì)模型大鼠神經(jīng)元形態(tài)的影響。HE染色結(jié)果顯示,模型組黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少,凋亡細(xì)胞比例增多。透射電鏡可更直觀地觀察到神經(jīng)元凋亡的形態(tài)特征,如細(xì)胞核皺縮、染色質(zhì)凝集成塊狀或新月形小體并聚集于核膜,或出現(xiàn)凋亡小體等。本研究應(yīng)用透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn),模型組黑質(zhì)致密帶雖無(wú)凋亡小體形成,但神經(jīng)元有早期凋亡的形態(tài)學(xué)改變,這可能與觀察時(shí)機(jī)和凋亡細(xì)胞數(shù)量有限有關(guān)。經(jīng)一定劑量的人參皂苷Rg3預(yù)處理后,存活神經(jīng)元數(shù)量增多,神經(jīng)元缺失現(xiàn)象減少,凋亡細(xì)胞比例也隨之下降。以上研究結(jié)果提示,人參皂苷Rg3對(duì)R-NLC誘導(dǎo)黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡有阻斷作用,并且此作用與Rg3的劑量呈一定的量效關(guān)系:Rg3高劑量組>Rg3中劑量組>Rg3低劑量組。本課題組前期研究曾應(yīng)用TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),模型組黑質(zhì)TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增高,經(jīng)人參皂苷Rg3預(yù)處理后,TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目減少;應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染PC12細(xì)胞,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率,吖啶橙/溴化乙錠染色觀察細(xì)胞凋亡形態(tài),結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg3能夠使MPP+誘導(dǎo)升高的凋亡率下降[19]。至此,本課題組應(yīng)用三種細(xì)胞凋亡檢測(cè)方法,用體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)了人參皂苷Rg3能改善神經(jīng)元形態(tài),減少細(xì)胞器變形,抑制黑質(zhì)神經(jīng)元凋亡,發(fā)揮對(duì)黑質(zhì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。

本研究使用的陽(yáng)性藥物司來(lái)吉蘭是臨床治療PD的上市藥物。司來(lái)吉蘭為選擇性單胺氧化酶-B(MAO-B)抑制劑,能迅速通過(guò)血腦屏障,抑制多巴胺的降解,相對(duì)增加多巴胺含量,補(bǔ)充神經(jīng)元合成多巴胺能力的不足,它的代謝產(chǎn)物可抑制多巴胺的再攝取,這些作用可加強(qiáng)腦中多巴胺能神經(jīng)功能,從而達(dá)到治療震顫性麻痹的作用[23]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用司來(lái)吉蘭作為陽(yáng)性藥物的目的主要在于判斷人參皂苷Rg3對(duì)PD動(dòng)物模型的保護(hù)作用。結(jié)果表明司來(lái)吉蘭可改善PD模型大鼠的行為學(xué)評(píng)分,減少細(xì)胞凋亡,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用;而Rg3對(duì)R-NLC誘導(dǎo)的黑質(zhì)能神經(jīng)元損傷有保護(hù)作用,可減少神經(jīng)元的凋亡,尤其是Rg3高劑量組的干預(yù)效果與司來(lái)吉蘭組的效果接近。為了選擇合適的司來(lái)吉蘭使用濃度,本課題組參考相關(guān)文獻(xiàn)并做了預(yù)實(shí)驗(yàn)。有文獻(xiàn)針對(duì)小鼠灌胃采用了10 mg/kg司來(lái)吉蘭有較好效果并作為陽(yáng)性對(duì)照,本課題組則發(fā)現(xiàn)11 mg/kg司來(lái)吉蘭對(duì)大鼠有明顯的效果,因此采用11mg/kg司來(lái)吉蘭作為針對(duì)大鼠PD模型的陽(yáng)性對(duì)照組[24]。

本項(xiàng)研究采用外觀行為表現(xiàn)評(píng)分、肌僵直實(shí)驗(yàn)、HE染色及透射電鏡檢測(cè)等方法,分析了人參皂苷Rg3對(duì)R-NLC誘導(dǎo)的PD模型大鼠的影響。研究結(jié)果表明人參皂苷Rg3有助于改善PD模型大鼠的外觀行為表現(xiàn)評(píng)分,縮短移動(dòng)潛伏期時(shí)間,改善大鼠運(yùn)動(dòng)能力,維持正常神經(jīng)元形態(tài),抑制黑質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,提高神經(jīng)元存活率,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。該研究的開(kāi)展有助于進(jìn)一步探討PD的發(fā)病機(jī)制,有助于探討Rg3對(duì)PD模型的保護(hù)作用,有助于進(jìn)一步探索Rg3發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用人參皂苷Rg3治療神經(jīng)退行性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

雖然本項(xiàng)研究明確了人參皂苷Rg3對(duì)PD模型大鼠有神經(jīng)保護(hù)作用,但其作用的分子機(jī)制如何,是否涉及誘導(dǎo)多種類型的細(xì)胞死亡,如細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬、細(xì)胞焦亡、鐵死亡等,是否涉及多條細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,是否涉及抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)等都值得進(jìn)一步探討。