劉磊,彭琴,吳澤明,黃欣慧,張廣獻,譚宇蕙

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,廣州 510006)

統(tǒng)計報告顯示,2020年全球新發(fā)癌癥約1 930萬例,癌癥患者死亡1 000萬例,其中我國新增癌癥病例約457萬,死亡病例300萬[1]。大多數(shù)癌癥患者確診時已進入進展期或者中晚期,腫瘤已開始通過血行播散轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成是腫瘤生長、進展和轉(zhuǎn)移的重要因素[2],抑制血管生成已成為臨床批準的治療方法,然而目前卻受到可選藥少、療效不足或耐藥性的限制。由于腫瘤細胞迅猛增殖,代謝水平高,實體腫瘤中心區(qū)域容易出現(xiàn)缺血缺氧的狀態(tài),而缺氧能促進血管增生,誘導(dǎo)血管生成是腫瘤的十大特征之一,其病理性血管增生是以新生毛細血管的形成為主,而內(nèi)皮細胞是構(gòu)成毛細血管管壁的主要細胞,其來源于內(nèi)皮祖細胞增殖分化或自身的繼續(xù)增殖分裂,而內(nèi)皮(祖)細胞增殖分化及遷移被證實是惡性腫瘤血管增生的重要環(huán)節(jié)[3-4]。有報道指出,內(nèi)皮(祖)細胞增殖也像癌細胞一樣依賴瓦伯格效應(yīng)(Warburg effect,即依靠大量糖酵解提供合成代謝和能量代謝的原料)[5-6],因此,通過調(diào)整內(nèi)皮(祖)細胞代謝以抑制血管增生可能是抗癌的新策略。

吳茱萸堿(evodiamine,EVO)是吳茱萸的主要活性成分之一?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),EVO具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、保護心血管系統(tǒng)及神經(jīng)等藥理作用[7]。本課題組前期已證實EVO對肝癌細胞的瓦伯格效應(yīng)有顯著的抑制作用,那么EVO能否抑制血管內(nèi)皮細胞的瓦伯格效應(yīng)?EVO是否通過影響內(nèi)皮細胞糖代謝而抑制其增殖生長從而抗血管增生?這些尚不明確。本研究通過體外模擬人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)體內(nèi)的缺氧狀態(tài),觀察常氧和缺氧下內(nèi)皮細胞糖代謝相關(guān)酶的變化、EVO的干預(yù)作用及相關(guān)信號通路變化,探討EVO抗血管增生的作用及機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 HUVECs購自廣州浩瑪生物科技有限公司(貨號:CL-0122);人肝母細胞肝癌細胞株(HepG2),由廣州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)實驗室長期保存。

1.1.2藥物及試劑 EVO購自成都曼思特有限公司(批號:MUST-21050405);六水合氯化鈷(CoCl2·6H2O)購自上海麥克林生化科技有限公司(批號:C13563922);內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基購自廣州浩瑪生物科技有限公司(貨號:CM-0122);胎牛血清購自武漢普諾賽生命科技有限公司(批號:SA220119);高糖達爾伯克必需基本培養(yǎng)基(Dulbecco's minimum essential medium,DMEM)購自美國Gibco公司(貨號:8122480);噻唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒、二甲亞砜、Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒均購自廣州瑞舒生物科技有限公司(貨號分別為:10004162、MB2470、MA0220-1);聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購自Roche(貨號:62344100);山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗均購自ABclonal(批號:AS014、AS003);鼠抗β-actin抗體、兔抗HIF-1α抗體、兔抗PFKFB3抗體均購自ABclonal公司(批號分別為AC004、A6265、A6945);兔抗VEGFR2抗體購自Abcam公司(批號:GR256989-1)。

1.1.3儀器與設(shè)備 二氧化碳(CO2)細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo Fisher公司,型號:FORMA371);超凈工作臺(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司,型號:SW-CJ-2F);多功能酶標儀(PE公司,型號:PerKinElmer);流式細胞分析儀(美國BD公司,型號:Accuri C5);蛋白垂直電泳系統(tǒng)、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能儀器有限公司,型號:5200)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將HUVECs、HepG2細胞分別置于內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基、10%胎牛血清+90%高糖DMEM培養(yǎng)基中,37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)。細胞密度達到80%～90%,用含0.25%乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)的胰酶消化、離心并收集細胞(離心率1 000 r·min-1,r=7 cm,離心5 min),加入內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)液制成單細胞懸液,選取第3～6代細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2MTT法檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期HUVECs、HepG2細胞分別制成單細胞懸液,均以每孔2 000個、細胞懸液100 μL接種于96孔板,培養(yǎng)24 h,即細胞貼壁,設(shè)置空白組(無細胞對照)、對照組(細胞對照)、實驗組[EVO 和(或)CoCl2],實驗組每孔加入不同濃度的EVO(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 μmol·L-1)或CoCl2(50、100、200、400、800 μmol·L-1)或二者聯(lián)合100 μL,每個濃度梯度設(shè)置5個平行復(fù)孔。藥物干預(yù)24 h,避光,每孔加入5 mg·mL-1MTT溶液10 μL,繼續(xù)孵育4 h,吸棄上清液后每孔加入二甲亞砜150 μL,避光震蕩10 min。酶標儀檢測波長處490 nm吸光度值(A值)。細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。改良寇式法計算半數(shù)抑制濃度(half madimal inhibitory concentration,IC50):Lg(IC50)=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]及IC50=10 Lg(IC50)。

1.2.3流式細胞術(shù)檢測HUVECs細胞凋亡水平 以每孔106個HUVECs接種至6孔板,待細胞貼壁后,設(shè)置對照組和EVO各濃度組,EVO處理24 h,用不含EDTA的胰酶消化、離心細胞,磷酸鹽緩沖液重懸并離心細胞2次,收集細胞制成單細胞懸液,使用Annexin-V/PI雙染料聯(lián)合標記,避光孵育20 min,流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

1.2.4CoCl2體外模擬缺氧模型建立 參照“1.2.2節(jié)”以CoCl2(50、100、200、400、800 μmol·L-1)干預(yù)HUVECs 24 h,MTT法檢測CoCl2對細胞增殖的影響,和參照“1.2.5”項CoCl2(50、100 μmol·L-1和5、10、20、40 μmol·L-1)干預(yù)HUVECs 24 h,Western blotting檢測HUVECs的HIF-1α蛋白表達水平,以選擇合適濃度的CoCl2建立體外模擬缺氧模型。

1.2.5Western blotting檢測 以每孔106個HUVECs接種至6孔板,待細胞貼壁后,經(jīng)EVO或(和)CoCl2干預(yù)24 h,使用RIPA裂解液提取細胞內(nèi)總蛋白,BCA法測定總蛋白濃度,加入5倍十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)上樣緩沖液稀釋為1倍工作液,置于金屬浴中加熱10 min使蛋白變性。然后使用8%～10% SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白,采用濕轉(zhuǎn)法將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉4 h,分別放入鼠抗β-actin抗體、兔抗HIF-1α、PFKFB3、VEGFR2抗體中(1：1 000稀釋),4 ℃孵育過夜。經(jīng)TBST緩沖液洗滌5 min,重復(fù)3次后,加入辣根過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)標記二抗,室溫孵育1 h,TBST緩沖液再洗滌3次后采用電化學(xué)發(fā)光法顯影,拍照并保存圖像。使用ImageJ軟件測量條帶灰度值,β-actin作為內(nèi)參,分析目的蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1EVO對HUVECs、HepG2細胞增殖的影響 MTT檢測結(jié)果顯示,EVO對HUVECs、HepG2細胞的增殖均有顯著抑制作用(P<0.05或P<0.01),對HUVECs、HepG2細胞IC50分別為1.15、1.07 μmol·L-1。由此可見,EVO對HUVECs抑制作用較對HepG2細胞稍弱,但抑制程度基本一致(圖1)。

①與對照組比較,t=2.420,P<0.05;②與對照組比較,t=7.436～32.403,P<0.01。

2.2EVO對HUVECs誘導(dǎo)凋亡的影響 流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,各組EVO作用濃度分別為0、0.1、0.2、0.4 μmol·L-1,HUVECs凋亡率逐漸升高,分別為5.05%、7.26%、8.30%、8.61% (P<0.01),見圖2。

①與對照組比較, t=-8.131,-8.461,-12.356,P<0.01。

2.3EVO對HUVECs的HIF-1α、PFKFB3和VEGFR2蛋白表達的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示,常氧條件下EVO對細胞的HIF-1α、Warburg效應(yīng)的主要關(guān)鍵酶PFKFB3(內(nèi)皮細胞主要表達的PFK的同工酶)沒有明顯下調(diào)作用,但對VEGFR2有明顯的下調(diào)作用(P<0.01)(圖3)。

①與對照組比較,t=6.706,7.867,P<0.01。

2.4CoCl2體外模擬缺氧模型的建立及CoCl2對HUVECs糖酵解代謝的影響 不同濃度CoCl2干預(yù)HUVECs 24 h,MTT檢測結(jié)果見圖4,隨著CoCl2濃度的增加,HUVECs增殖有所增加,CoCl2作用濃度≤50 μmol L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,也沒有細胞毒性;100～400 μmol·L-1CoCl2明顯促進生存率(P<0.01),800 μmol·L-1CoCl2時HUVECs生存率明顯下降,濃度過高出現(xiàn)細胞毒現(xiàn)象,可能是體外細胞的非特異性死亡,但這么高的濃度才有抑制生長作用也說明CoCl2的細胞毒性很低。

①與對照組(0 μmol·L-1CoCl2)比較, t=-15.337～5.109,P<0.01。

Western blotting檢測結(jié)果(圖4)顯示,常氧對照組HIF-1α蛋白表達水平很低,而隨著CoCl2濃度的增加,CoCl2激活HIF-1α表達明顯增加(P<0.01),說明CoCl2誘導(dǎo)的高表達HIF-1α的模型已成功建立。在HIF-1α高表達條件下,糖酵解關(guān)鍵酶PFKFB3與HIF-1α共同高表達,且均隨CoCl2濃度升高而升高(P<0.01)。CoCl2濃度>5 μmol·L-1可顯著提高HIF-1α的表達,但>50 μmol·L-1明顯影響生存率,因此模擬缺氧模型的CoCl2合適濃度范圍為5～50 μmol·L-1,選擇對HUVECs生存率影響較小又顯著提高HIF-1α蛋白表達的20 μmol·L-1CoCl2來建立模擬缺氧模型。

2.5EVO對內(nèi)皮細胞代謝機制的影響 Western blotting結(jié)果(圖5)顯示,在常氧條件下EVO組HIF-1α、PFKFB3蛋白沒有明顯改變,而在CoCl2組即模擬缺氧模型組中HIF-1α、PFKFB3表達皆非常顯著地升高(P<0.01),并且聯(lián)合組(EVO+CoCl2)被CoCl2上調(diào)的HIF-1α、PFKFB3蛋白表達均受到EVO抑制(P<0.01),說明EVO在模擬缺氧條件下才抑制HIF-1α、PFKFB3,在常氧下沒有此作用。HIF的激動劑CoCl2能上調(diào)EVO對PFKFB3的作用(P<0.05),說明EVO對PFKFB3的抑制是通過抑制HIF實現(xiàn)的。

①與對照組比較,t=-17.379～-4.670,P<0.01;②與EVO組比較,t=-3.202、-2.886,P<0.05;③與CoCl2組比較,t=4.196、9.350,P<0.05; ④與對照組比較,t=-4.255、-3.188,P<0.05;⑤與CoCl2組比較,t=26.963、4.387,P<0.01;⑥與EVO組(0.2、0.4 μmol·L-1)比較,t=-2.526、-3.836、-5.107,P<0.01。

在常氧條件下VEGFR2蛋白表達在EVO組中明顯下調(diào)(P<0.01),而在CoCl2組中明顯升高,說明HIF-1α能上調(diào)VEGFR2表達,在聯(lián)合組中VEGFR2蛋白表達仍受到EVO明顯抑制(P<0.01),聯(lián)合組與EVO組的抑制作用相差不大,說明CoCl2不能逆轉(zhuǎn)EVO對VEGFR2的抑制,EVO下調(diào)VEGFR2不是通過HIF通路實現(xiàn)的,也就是說,EVO可獨立地抑制VEGFR信號通路。

MTT檢測結(jié)果顯示,CoCl2作用濃度為20 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,在EVO濃度為0.4 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性受到明顯抑制(P<0.01);在模擬缺氧條件下0.4 μmol·L-1EVO仍能抑制細胞增殖生長(P<0.01),但此抑制作用被CoCl2減弱,即CoCl2能夠逆轉(zhuǎn)EVO對細胞增殖生長的抑制作用(P<0.05),說明EVO是通過HIF抑制HUVECs增殖生長。

3 討論

20世紀20年代,德國生物化學(xué)家Otto Warburg發(fā)現(xiàn),與正常細胞比較,快速增殖的腹腔積液腫瘤細胞以驚人的高速率消耗葡萄糖,但它并不是完全用于氧化生成CO2和H2O,而是以乳酸的形式分泌并堆積為主,這種現(xiàn)象被稱為瓦伯格效應(yīng),即指癌細胞無論有氧還是無氧均可進行大量的糖酵解。有學(xué)者提出,除腫瘤細胞外,大量糖酵解適用于所有的增殖細胞[5]。由于腫瘤細胞惡性增殖,腫瘤中心區(qū)域嚴重的缺氧狀態(tài)是大多數(shù)實體腫瘤普遍存在的現(xiàn)象,這導(dǎo)致了腫瘤細胞代謝的改變,腫瘤細胞可通過穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子并誘導(dǎo)其下游靶基因的激活,包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、代謝關(guān)鍵酶基因HK2等[8],當(dāng)大量分泌的促血管生成因子超過抗血管生成因子占據(jù)主導(dǎo)地位時,血管內(nèi)皮細胞迅速地從分裂的休眠狀態(tài)中被喚醒,同時開始大量地增殖、遷移,同樣需要高速率的糖酵解來滿足其生物合成和能量需求,而增殖、遷移的內(nèi)皮細胞逐漸形成管狀樣的病理性血管。目前抑制血管生成以饑餓腫瘤已成為臨床批準的有效治療方法,其中最經(jīng)典的是阻斷VEGF/VEGFR通路以抑制新生血管的生長[9],幾乎在所有內(nèi)皮細胞上都有表達VEGFR2,它主要通過與VEGFA結(jié)合后激活下游一系列的細胞信號通路,導(dǎo)致內(nèi)皮細胞增殖、遷移以及腫瘤新生血管的形成。因此,建立體外模擬缺氧模型對于研究內(nèi)皮細胞的代謝非常有必要。目前常用的有物理和化學(xué)2種缺氧模型,其中,物理缺氧模型是最好的選擇,但由于其需要昂貴的儀器設(shè)備和更為嚴謹?shù)牟僮鞫拗屏送茝V應(yīng)用。而以CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)法建立的體外模擬缺氧模型在常氧條件下就能夠穩(wěn)定細胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達,因此也得到了普遍的認可[10]。目前已有報道指出CoCl2對多種類型的腫瘤細胞刺激的敏感性和耐受性不同[11],因此需要確定CoCl2對HUVECs增殖影響較小又能顯著激活HIF-1α蛋白表達的合適濃度以建立體外模擬缺氧模型。

EVO是中藥吳茱萸的主要藥效成分。吳茱萸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,列為中品;《中華人民共和國藥典》記載:吳茱萸,性熱,味辛、苦,有小毒;歸肝、脾、胃、腎經(jīng);功效:散寒止痛,降逆止嘔。由吳茱萸、黃連組成的左金丸源自朱丹溪的《丹溪心法》,主治肝胃不和,中醫(yī)臨床多用于消化系統(tǒng)疾病,而消化系統(tǒng)腫瘤多伴有肝胃不和證。本課題組前期已證實EVO對多株人肝癌細胞有明顯抑制增殖生長、抑制瓦伯格效應(yīng)和誘導(dǎo)凋亡作用;并能明顯抑制小鼠肝癌移植瘤生長和延長荷瘤小鼠生存期。有研究證明EVO可以下調(diào)人結(jié)直腸癌HCT116中HIF-1α、VEGFA基因和蛋白的表達[12],還可以降低移植瘤組織中β-連環(huán)蛋白、VEGFA蛋白的表達和CD31、CD34的水平[13]。盡管目前對腫瘤血管增生與內(nèi)皮細胞代謝、Warburg效應(yīng)的關(guān)系已有不少文獻報道,但EVO通過抑制內(nèi)皮細胞代謝抗血管增生未見文獻報道。

本研究結(jié)果表明,EVO對HUVECs 24 h的IC50為1.15 μmol·L-1,故選擇低于IC50的EVO濃度進行后續(xù)實驗。常氧條件下,EVO對HUVECs的HIF-1α、PFKFB3沒有明顯下調(diào)作用,提示EVO對正常血管內(nèi)皮細胞代謝沒有影響;MTT檢測結(jié)果表明在CoCl2作用濃度≤50 μmol·L-1時,HUVECs增殖活性沒有受到明顯影響,也沒有細胞毒性,同時Western blotting檢測結(jié)果顯示HUVECs的HIF-1α蛋白表達水平顯著高于常氧對照組,這表明以CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)模擬缺氧模型建立成功,PFKFB3與HIF-1α共同高表達,且均隨CoCl2濃度升高而升高,說明HIF-1α的高表達能促進內(nèi)皮細胞的糖酵解,并選擇模擬缺氧模型的CoCl2作用濃度為20 μmol·L-1。EVO僅在模擬缺氧模型中有下調(diào)PFKFB3的作用,只影響HIF高表達的血管內(nèi)皮細胞的糖酵解。研究表明,阻斷PFKFB3可使HUVECs增殖和遷移能力減弱,抑制了移植瘤中腫瘤血管的生成及誘導(dǎo)腫瘤血管正?；痆14-15];在血液系統(tǒng)中毛細血管內(nèi)皮細胞的糖酵解速率更快、增殖能力更強,并且在血管分支形成的過程中其糖酵解速率還會進一步提高[16]。因此,EVO在模擬缺氧條件下可能下調(diào)PFKFB3進而抗腫瘤血管增生。CoCl2不能逆轉(zhuǎn)EVO下調(diào)VEGFR的作用,說明雖然HIF能影響VEGFR表達,但EVO抑制VEGFR不是必須通過HIF通路實現(xiàn)的,即EVO可能分別獨立地抑制HIF、VEGFR這兩條信號通路。綜上所述,本研究顯示EVO可能通過HIF和VEGFR通路抑制內(nèi)皮細胞的瓦伯格效應(yīng)及增殖,從而抗腫瘤血管增生。