徐禮臻 朱再生 周鵬飛 劉全啟 徐旻 胡亮

近年來前列腺癌的發(fā)病率逐漸上升且患者趨于年輕化[1-2]。研究表明，前列腺癌是一種異質(zhì)性疾病，相同病理類型的前列腺癌表現(xiàn)形式差異很大[3-4]。對(duì)于細(xì)胞生長緩慢且長期局限于前列腺內(nèi)的患者，可采取積極觀察等應(yīng)對(duì)措施；對(duì)于侵襲性前列腺癌患者，多采取積極手術(shù)等治療方式，一般行前列腺切除術(shù)、睪丸切除術(shù)或全雄激素剝奪治療[5]。但是，轉(zhuǎn)移性前列腺癌接受手術(shù)去勢或雄激素剝奪治療后，經(jīng)過一段時(shí)間后大多發(fā)展為去勢抵抗性前列腺癌（castrationresistant prostate cancer，CRPC）。CRPC 是前列腺癌晚期的一種表現(xiàn)形式，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，且致死率極高，目前尚無確切的治療方式[6]。因此，探討前列腺癌發(fā)展為CRPC 的分子機(jī)制是突破CRPC 治療瓶頸的有效手段。驅(qū)動(dòng)蛋白5（kinesin-5，Eg5）在細(xì)胞紡錘體有絲分裂過程中起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，Eg5 參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移及DNA 損傷響應(yīng)等多種生物學(xué)功能[7]，與胰腺癌、肝癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[8]。Eg5 在惡性腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子c-Myc 表達(dá)上調(diào)；而c-Myc 過表達(dá)與前列腺癌去勢抵抗有關(guān)。作為c-Myc 的下游靶點(diǎn)SP1，與共濟(jì)失調(diào)毛細(xì)血管擴(kuò)張突變基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)，參與調(diào)節(jié)DNA 雙鏈損傷修復(fù)、細(xì)胞周期、腫瘤轉(zhuǎn)移等[9]。作為重要的有絲分裂作用因子，筆者推測Eg5 可能是CRPC 的有效靶點(diǎn)。但Eg5 調(diào)節(jié)前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生去勢抵抗的機(jī)制研究鮮有報(bào)道。因此，本研究觀測了Eg5 小分子抑制劑SB-743921 對(duì)CRPC 細(xì)胞株DU145 增殖、凋亡、細(xì)胞周期及遷移的影響，并初步探討相應(yīng)的分子機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要藥物與試劑 Eg5 小分子抑制劑SB-743921（批號(hào)：HY-12069）購自美國Med Chem Express 公司。Eg5 抗體（批號(hào)：14404S）、c-Myc 抗體（批號(hào)：18583S）、SP1 抗體（批號(hào)：9389S）、波形蛋白（Vimentin）抗體（批號(hào)：5741S）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（批號(hào)：14472S）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）（批號(hào)：4970S）、鼠二抗（批號(hào)：14709S）、兔二抗（批號(hào)：14708S）均購自美國Cell Signaling Technology 公司，周期蛋白依賴性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）1 抗體（批號(hào)：ab201008）購自美國Abcam 公司，MTT 試劑盒（批號(hào)：C0009）、Annexin V-FITC 典化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒（批號(hào)：C1062M）均購自上海碧云天生物技術(shù)公司，MEM 培養(yǎng)基（批號(hào)：KGM41500N-500）購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，RIPA 裂解液（批號(hào)：SY021-100）購自南京三翊生物科技有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：R323）、qRT-PCR 試劑盒（批號(hào)：Q311）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司，慢病毒NC 小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）（批號(hào)：PLV-10）、Eg5 siRNA（批號(hào)：AM4639）均購自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 人CRPC 細(xì)胞株DU145 購自上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。將DU145 細(xì)胞置于含10%FBS、100 mg/L 鏈霉素、100 U/L 青霉素的MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期的DU145 細(xì)胞，設(shè)置對(duì)照組、NC siRNA 組、Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組，每組3 個(gè)重復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，NC siRNA 組、Eg5 siRNA 組分別用NC siRNA、Eg5 siRNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞；SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組分別用4 、8 nmol/L 的SB-743921處理細(xì)胞48 h[預(yù)實(shí)驗(yàn)提示SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞處理72 h 的半數(shù)抑制濃度為（8.83±0.67）nmol/L，故本實(shí)驗(yàn)以4、8 nmol/L 濃度進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)]。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測 采用MTT 法。取5 組DU145 細(xì)胞，以4×104個(gè)/mL 的濃度接種于96 孔板；每孔加入MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液；每孔加入150 μL二甲基亞砜震蕩30 s，使用美國Biotek 公司Cytation 5酶標(biāo)儀測定570 nm 波長處的吸光度值。細(xì)胞生長抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組吸光度值/空白對(duì)照組吸光度值×100%。

1.4 細(xì)胞凋亡能力檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。收集5 組DU145 細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL 的濃度接種于6 孔板，PBS洗滌2 次；在室溫、避光下Annexin V-FITC 染色5 min，PI 染色5 min。使用德國美天旎生物技術(shù)公司MACSQuant 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，利用FlowJo 7.6軟件分析并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.5 細(xì)胞周期檢測 采用PI 單染實(shí)驗(yàn)。收集5 組DU145 細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL 的濃度接種于6 孔板，PBS 洗滌2 次；將各組細(xì)胞固定于70%乙醇，再加入含有RNA 酶RNAase A 的PI 染液，在室溫下孵育細(xì)胞30 min；用PBS 除去多余PI 染液，使用美國BD 公司FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞周期分布情況，利用ModFit LT3.3 軟件分析并計(jì)算G2/M 期百分比。

1.6 細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。取5 組DU145 細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL 的濃度接種于6 孔板，待細(xì)胞貼壁后用移液器吸頭制造劃痕，繼續(xù)培養(yǎng)。于0、48 h 使用倒置顯微鏡觀察劃痕情況并拍照，使用Image J 軟件分析并計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=0 h劃痕寬度-培養(yǎng)48 h 后劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度×100%。

1.7 c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA 表達(dá)水平檢測 采用qRT-PCR 法。取5 組DU145 細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL 的濃度接種于60 mm3的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48 h 后提取總RNA；使用NanoDrop-100 微量核酸蛋白測定儀測定對(duì)應(yīng)RNA 的濃度和純度；利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄1 μmol/L RNA 得到cDNA，使用qRT-PCR 試劑盒進(jìn)行反應(yīng)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。各基因引物列見表1。

表1 引物序列

1.8 c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平檢測 采用Western blot 法。取5 組DU145 細(xì)胞，以1×106個(gè)/mL 的濃度接種于100 mm3的培養(yǎng)皿，培養(yǎng)48 h 后提取總蛋白；使用RIPA 裂解液在冰上裂解40 min，離心收集上清蛋白；用美國Bio-rad 公司蛋白電泳儀系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳并分離目標(biāo)蛋白，利用濕法電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜。膜上的蛋白用5%（w/v）脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗4 ℃孵育8 h，加入二抗室溫孵育1.5 h。使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光液顯色，利用美國Bio-rad 公司Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)檢測條帶灰度值，并用Image J 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞增殖的影響 5 組細(xì)胞生長抑制率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組生長抑制率分別為（33.35±3.12）%、（34.23±2.38）%、（36.32±2.67）%，均高于對(duì)照組的（2.32±0.23）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。

2.2 SB-743921對(duì)DU145細(xì)胞凋亡的影響 5組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中Eg5 siRNA組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組細(xì)胞凋亡率分別為（24.22±2.13）%、（18.79±1.33）%、（31.35±3.11）%，均高于對(duì)照組的（7.37±0.88）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖1。

圖1 SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞凋亡的影響

2.3 SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞周期的影響 5 組細(xì)胞G2/M 期百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組G2/M 期百分比分別為（13.29±1.23）%、（11.46±2.31）%、（15.61±2.47）%，均高于對(duì)照組的（1.79±0.43）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 SB-743921 對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.4 SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞遷移的影響 5 組細(xì)胞遷移率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組細(xì)胞遷移率分別為（2.35±0.52）%、（6.50±1.56）%、（5.40±1.30）%，均明顯低于對(duì)照組的（25.32±5.80）%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3。

圖3 SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞遷移的影響

2.5 SB-743921 對(duì)c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA 表達(dá)水平的影響 5 組細(xì)胞c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA 表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；其中Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin mRNA 表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，E-cadherin mRNA 表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表2。

表2 SB-743921對(duì)c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin mRNA表達(dá)水平的影響

2.6 SB-743921 對(duì)c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平的影響 5 組細(xì)胞c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中Eg5 siRNA 組、SB-743921（4 nmol/L）組、SB-743921（8 nmol/L）組c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin 蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，E-cadherin 蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；SB-743921（8 nmol/L）組CDK1、Vimentin 蛋白表達(dá)水平均明顯低于Eg5 siRNA組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4和表3。

圖4 5 組DU145 細(xì)胞c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin 蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 SB-743921對(duì)c-Myc、SP1、CDK1、E-cadherin、Vimentin蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

前列腺癌是男性泌尿系統(tǒng)常見的腫瘤。在前列腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中，細(xì)胞有絲分裂異常發(fā)揮著重要作用。研究表明，Eg5 異常表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞有絲分裂異常和細(xì)胞異常增殖，是一個(gè)有效的靶點(diǎn)[10]。但它與很多參與調(diào)節(jié)有絲分裂的因子不同，Eg5 在正常組織細(xì)胞中的表達(dá)水平極低，但在惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平異常升高[11]。研究發(fā)現(xiàn)，Eg5 在正常細(xì)胞及惡性腫瘤細(xì)胞內(nèi)的差異表達(dá)可導(dǎo)致靶向Eg5 療法的不良反應(yīng)相對(duì)較少，是一個(gè)很好的抗有絲分裂基因[12]。CRPC 細(xì)胞內(nèi)存在著Eg5 過表達(dá)和活化[13]，因此探討Eg5 對(duì)CRPC 細(xì)胞株DU145 細(xì)胞惡性增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用具有重要意義。本研究評(píng)價(jià)了Eg5 小分子抑制劑SB-743921 對(duì)DU145 細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期及遷移的影響，同時(shí)初步探討了相關(guān)分子機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，靶向沉默Eg5 表達(dá)可明顯抑制DU145 細(xì)胞惡性增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，減弱腫瘤細(xì)胞遷移能力；Eg5 小分子抑制劑SB-743921 可以抑制DU145 細(xì)胞惡性增殖和遷移。研究表明，Eg5 表達(dá)和功能的抑制可引起轉(zhuǎn)錄因子SP1、CDK1 表達(dá)水平降低[14-15]。SP1 是c-Myc 的下游靶基因，與腫瘤的惡性增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[16]。SP1 表達(dá)水平降低可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移能力減弱。CDK1 是細(xì)胞有絲分裂的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)水平降低會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期，繼而導(dǎo)致細(xì)胞因無法進(jìn)行有絲分裂而凋亡[17]。本研究進(jìn)一步探討相關(guān)分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，靶向沉默Eg5 表達(dá)可下調(diào)c-Myc、SP1、CDK1、Vimentin mRNA 及蛋白表達(dá)水平，上調(diào)E-cadherin mRNA 及蛋白表達(dá)水平；而Eg5 小分子抑制劑SB-743921 可進(jìn)一步下調(diào)CDK1、Vimentin 蛋白表達(dá)水平。

綜上所述，Eg5 小分子抑制劑SB-743921 通過c-Myc/SP1/CDK1 信號(hào)通路阻斷CRPC 細(xì)胞的惡性增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并將細(xì)胞周期阻滯在G2/M 期；提示SB-743921 具有治療CRPC 的潛在價(jià)值。