楊 嘉，王秀梅

(清華大學(xué)材料學(xué)院 再生醫(yī)學(xué)與仿生材料研究所，北京 100084)

1 前 言

近年來，隨著人口老齡化加劇、疾病和意外事故頻發(fā)，組織和器官的損傷及功能性障礙已成為影響人類生命健康的重要因素。傳統(tǒng)的外科治療策略經(jīng)歷了切除、修補(bǔ)、替代的過程。近年來，隨著組織工程和再生醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，再生修復(fù)被認(rèn)為是最具前景和挑戰(zhàn)的組織修復(fù)策略。再生是指生命體整體或器官受外力作用發(fā)生創(chuàng)傷而部分丟失，在剩余部分的基礎(chǔ)上又生長(zhǎng)出與丟失部分在形態(tài)與功能上相同的結(jié)構(gòu)的過程。然而，眾所周知，絕大部分成體組織的修復(fù)和再生能力極為有限，尤其是在嚴(yán)重創(chuàng)傷后，由于大量細(xì)胞丟失、凋亡，和細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的破壞，使組織再生變得尤為困難，組織工程策略應(yīng)運(yùn)而生。20世紀(jì)90年代，國(guó)際著名學(xué)者，美國(guó)麻省理工學(xué)院教授Langer和Vacanti[1]提出組織工程的概念，即應(yīng)用生命科學(xué)、工程學(xué)與其它學(xué)科的原理與技術(shù)，在正確認(rèn)識(shí)哺乳動(dòng)物正常及病理兩種狀態(tài)下組織結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基礎(chǔ)上，研究和開發(fā)用于修復(fù)或維護(hù)人體各種組織/器官損傷后的功能和形態(tài)的生物替代物。作為組織再生修復(fù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，自體移植始終是一種“拆東墻補(bǔ)西墻”的修復(fù)策略，存在供體來源有限，給患者帶來二次手術(shù)傷害等問題。雖然異體或異種移植物也展示出了優(yōu)秀的再生修復(fù)能力，但仍然存在眾多挑戰(zhàn)，例如免疫原性以及可能存在的倫理問題等。因此，人工合成出理想的生物替代物，修復(fù)損傷組織或器官，成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)的核心任務(wù)。

組織工程基本原理包括生物材料、細(xì)胞和調(diào)控因子三要素。其中，生物材料在組織損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用[2]。生物材料不僅可作為支架填補(bǔ)組織缺損區(qū)以保持受損部位的結(jié)構(gòu)完整性，提供物理結(jié)構(gòu)支撐并促進(jìn)細(xì)胞附著和生長(zhǎng)[3]，同時(shí)，生物材料還可以被設(shè)計(jì)為生物活性物質(zhì)的遞送載體，如干細(xì)胞[4]、藥物[5]、生長(zhǎng)因子[6]、外泌體[7]、小分子核糖核酸[8]等，以調(diào)控組織再生修復(fù)進(jìn)程。然而，近年來越來越多的研究證明生物材料的作用不限于此。隨著“干細(xì)胞微環(huán)境”概念的提出，生物材料在組織再生修復(fù)中承擔(dān)著“再生微環(huán)境”的作用，即調(diào)控干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、組織特異性細(xì)胞的細(xì)胞行為并激活組織再生潛能。生物材料所具備的本征理化特性(結(jié)構(gòu)、力學(xué)、表面化學(xué)、基質(zhì)成分、親疏水性等)、生物活性(基因、蛋白、多肽、藥物等)，以及傳遞的外源刺激(聲、光、電、磁等)等不同模態(tài)的材料學(xué)信號(hào)均可調(diào)控細(xì)胞行為，激活基因表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)組織再生。鑒于天然組織的復(fù)雜性，應(yīng)用組織工程策略再生修復(fù)損傷組織離不開多種不同類型細(xì)胞和活性因子在不同時(shí)空的協(xié)同作用。可見，通過加載單一模態(tài)的再生調(diào)控信號(hào)無法重建較為完整的組織結(jié)構(gòu)和功能?；诖?，利用生物材料加載多種模態(tài)的再生調(diào)控信號(hào)，發(fā)揮協(xié)同作用，調(diào)控多種細(xì)胞行為，模擬復(fù)雜的組織生態(tài)位，進(jìn)而激活受損組織的再生潛能，有望成為未來組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要發(fā)展方向。鑒于此，本文綜述了多種材料信號(hào)對(duì)于調(diào)控細(xì)胞行為的重要作用，并提出了一種基于生物材料的多模態(tài)組織工程策略。此外，以神經(jīng)組織工程為例，闡明了遞送多模態(tài)信號(hào)的生物材料在促進(jìn)組織再生修復(fù)中的重要性。

2 生物材料在組織工程和再生醫(yī)學(xué)中的重要地位

組織工程與再生醫(yī)學(xué)的最終目標(biāo)是實(shí)現(xiàn)損傷組織和器官的再生與替代，從而恢復(fù)它特有的結(jié)構(gòu)與功能。然而，組織再生過程是基于一系列復(fù)雜的生理活動(dòng)，尤其是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)之間、細(xì)胞與細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)相互作用。組織損傷后，修復(fù)過程啟動(dòng)。各類炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞貫序進(jìn)入損傷區(qū)，清除壞死的細(xì)胞和組織，分泌炎癥因子，激活修復(fù)過程。受損部位組織細(xì)胞和多能干細(xì)胞被激活，開始增殖和分化，以補(bǔ)充受損細(xì)胞。與此同時(shí)，這些細(xì)胞會(huì)在損傷部位分泌和合成細(xì)胞外基質(zhì)，以支持細(xì)胞本身的粘附、生長(zhǎng)和分化，最終發(fā)育為新生的組織結(jié)構(gòu)。然而，由于損傷區(qū)細(xì)胞依賴的基質(zhì)環(huán)境缺失，且損傷微環(huán)境逐漸惡化，細(xì)胞通常面臨著“孤掌難鳴”的困境，從而使再生過程變得尤為困難。因此，最初的生物材料被設(shè)計(jì)為一種臨時(shí)的可為細(xì)胞附著和生長(zhǎng)提供支持的生物支架，其降解速率應(yīng)匹配組織再生速度，以完成“功成身退”的使命。然而，近年來，隨著對(duì)促進(jìn)組織修復(fù)的生物材料研究的日漸深入，生物材料的功能已得到充分拓展，不止作為新生組織的模板，更作為一種指導(dǎo)生命活動(dòng)的智能組件，以最大限度地激活內(nèi)源性再生潛力促進(jìn)組織重塑。因此，基于仿生設(shè)計(jì)原則，解碼天然細(xì)胞外基質(zhì)的材料學(xué)信號(hào)并揭示它對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控作用和分子機(jī)制，指導(dǎo)多功能生物材料的設(shè)計(jì)，誘導(dǎo)組織再生修復(fù)，已成為組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究的共性科學(xué)問題。

3 基于生物材料的多模態(tài)組織工程策略

材料誘導(dǎo)組織再生修復(fù)是基于“材料-細(xì)胞”的相互作用而實(shí)現(xiàn)的[9]。設(shè)計(jì)生物功能性材料為細(xì)胞遞送“促再生”信號(hào)，是生物材料設(shè)計(jì)中最為重要的一環(huán)。然而，由于組織再生修復(fù)的生理復(fù)雜性以及各類調(diào)控因素中固有的交叉對(duì)話作用，材料負(fù)載的單一模態(tài)的信號(hào)很難達(dá)到理想的修復(fù)效果。因此，破譯細(xì)胞生態(tài)位中的特定物理、化學(xué)、生物學(xué)等因素的作用，探索材料靶向調(diào)控組織損傷修復(fù)的多線索協(xié)同作用，為指導(dǎo)生物材料設(shè)計(jì)指明了方向。本文提出了一種基于生物材料的多模態(tài)組織工程策略，即設(shè)計(jì)開發(fā)“All-in-One”多功能生物材料，遞送多模態(tài)的物理、化學(xué)、生物學(xué)調(diào)控信號(hào)和外部刺激，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的精準(zhǔn)、貫序調(diào)控，并建立多模態(tài)信號(hào)與組織再生的多級(jí)構(gòu)效關(guān)系和協(xié)同增效機(jī)制(圖1)。這里，“All”代表與特定組織再生修復(fù)密切相關(guān)的各類多模態(tài)再生調(diào)控信號(hào)；“One”代表多功能集成的再生生物材料，該材料可實(shí)現(xiàn)多模態(tài)調(diào)控信號(hào)可控遞送和協(xié)同增益。基于此，設(shè)計(jì)開發(fā)的新一代“All-in-One”多功能生物材料將以一種更為靶向、精準(zhǔn)的方式服務(wù)于組織再生修復(fù)。本節(jié)將重點(diǎn)介紹生物材料負(fù)載的模態(tài)類型及其特征信號(hào)對(duì)于調(diào)控細(xì)胞生命活動(dòng)、促進(jìn)組織再生修復(fù)的重要作用。

圖1 基于生物材料遞送的多模態(tài)再生調(diào)控信號(hào)示意圖

3.1 化學(xué)信號(hào)

生物材料固有的化學(xué)信號(hào)對(duì)于指導(dǎo)生物材料植入后的細(xì)胞行為等具有重要作用[10]。材料的化學(xué)信號(hào)不僅通過本體特征影響細(xì)胞行為，還通過其表面化學(xué)、親疏水作用、表面能等調(diào)控細(xì)胞與材料的相互作用[11]。從化學(xué)成分角度而言，天然來源的生物材料通常具有類似于原生細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)信號(hào)，參與并指導(dǎo)細(xì)胞活動(dòng)[12]。例如，作為細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，透明質(zhì)酸可以與細(xì)胞表面受體相互作用，介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)相關(guān)受體(RHAMM)和分化簇(CD44)，促進(jìn)細(xì)胞形態(tài)發(fā)生[13]。此外，已被證明不同分子量的透明質(zhì)酸對(duì)于組織的免疫反應(yīng)具有截然不同的調(diào)節(jié)作用[14]。細(xì)胞與生物材料發(fā)生相互作用的界面通常位于生物材料的表面。因此，生物材料的表面化學(xué)性質(zhì)可強(qiáng)烈影響細(xì)胞的粘附、形態(tài)發(fā)生、增殖及分化等細(xì)胞行為。Ren等[15]研究發(fā)現(xiàn)，表面化學(xué)基團(tuán)影響神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cell，NSC)行為；培養(yǎng)于帶正電的—NH2表面的NSC展現(xiàn)出最顯著的粘附和遷移行為，同時(shí)向神經(jīng)元方向分化；然而，培養(yǎng)于帶負(fù)電的—SO3H表面上的NSC在單細(xì)胞水平雖表現(xiàn)了最大的接觸面積，但更傾向于分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞。另外，生物材料的表面親疏水性可影響細(xì)胞粘附與蛋白質(zhì)吸附[16]。有研究報(bào)道，疏水性表面更容易吸附蛋白質(zhì)，且結(jié)合的蛋白質(zhì)的種類、濃度、相互作用強(qiáng)度以及結(jié)合后的蛋白質(zhì)構(gòu)象均會(huì)影響細(xì)胞行為[17，18]。然而，不同類型的細(xì)胞對(duì)于親疏水性界面的傾向性不同，一般而言，為了平衡界面能，親水性細(xì)胞傾向于粘附在親水性表面，反之，疏水性細(xì)胞則易于粘附于疏水性表面[19，20]。另外，據(jù)Hotchkiss等[21]和Abaricia等[22]的報(bào)道，親水性界面抑制了促炎標(biāo)志物的表達(dá)，并大大增強(qiáng)了抗炎標(biāo)志物的表達(dá)，這表明生物材料的親疏水性對(duì)免疫反應(yīng)也有一定的調(diào)控作用。

3.2 物理信號(hào)

利用生物制造技術(shù)，例如靜電紡絲、立體光刻、3D打印等，可以將生物材料制作成具有一定結(jié)構(gòu)特征的3D支架，3D支架除了為受損組織提供足夠的機(jī)械支持外，還可充當(dāng)臨時(shí)的細(xì)胞生長(zhǎng)代謝的活動(dòng)場(chǎng)所，最終逐漸被降解并被細(xì)胞所分泌的新生的細(xì)胞外基質(zhì)所替代[23，24]。在此過程中，細(xì)胞通過粘附在支架上感知外部環(huán)境的物理特性，細(xì)胞膜受體整合素會(huì)將微環(huán)境中的物理信號(hào)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，使得細(xì)胞增殖、分化、遷移或凋亡[25]。因此，生物支架的物理參數(shù)例如表面的納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)[26]、幾何尺寸與空間結(jié)構(gòu)[27，28]、生物力學(xué)特征[29]等以物理信號(hào)的形式調(diào)控細(xì)胞微環(huán)境，從而指導(dǎo)細(xì)胞行為，使支架作為再生組織的生長(zhǎng)模板，促進(jìn)組織整合，實(shí)現(xiàn)可控再生。

對(duì)于生物材料的表面形貌特性(例如支柱、凹坑、管、纖維)設(shè)計(jì)，通常包括微米及納米尺度，微米級(jí)尺寸影響細(xì)胞遷移，而納米級(jí)尺寸決定受體分子的感知行為，從而影響細(xì)胞命運(yùn)[30]。Fu等[31]通過選擇性激光熔化與堿熱處理方法使鈦表面形成有序微米和無序納米形貌結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，細(xì)胞通過整合素α5和整合素β1感知材料的各向同性和各向異性線索，并通過觸發(fā)Wnt/β-catenin信號(hào)通路誘導(dǎo)核定向，證明該結(jié)構(gòu)成功誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化。另外，生物材料的三維空間組織結(jié)構(gòu)對(duì)于組織修復(fù)尤為重要。首先，生物材料的宏觀空間結(jié)構(gòu)應(yīng)與組織缺損適配，其次，微觀結(jié)構(gòu)應(yīng)為細(xì)胞提供廣泛粘附空間。Lian等[32]通過低溫沉積建模打印與冷凍干燥技術(shù)制造開發(fā)了一種具有分層多孔結(jié)構(gòu)的海綿支架，該支架的特點(diǎn)在于高孔隙率與孔連通性以及一定的表面粗糙度，結(jié)果證明該3D多孔支架可以高效地包載間充質(zhì)干細(xì)胞并顯著增強(qiáng)其旁分泌作用，且體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)該3D支架的多孔結(jié)構(gòu)有效促進(jìn)了血管再生。生物材料攜帶的多樣化的力學(xué)信號(hào)例如剛度、粘彈性會(huì)向細(xì)胞傳遞機(jī)械信號(hào)，細(xì)胞將機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)為與功能相關(guān)的下游信號(hào)通路與分子調(diào)節(jié)器，并調(diào)節(jié)新生細(xì)胞外基質(zhì)的類型與排列，促進(jìn)組織重塑[33，34]。另外，機(jī)械性能適配性的生物支架移植后表現(xiàn)出更理想的宿主整合效果[35]。

3.3 生物活性信號(hào)

天然的組織再生過程是一個(gè)復(fù)雜的生理事件，涉及一系列具有時(shí)空調(diào)制屬性的、多種生化信號(hào)操縱的多細(xì)胞主導(dǎo)的生命活動(dòng)[36]，因此，解碼組織損傷后再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要靶點(diǎn)信息，設(shè)計(jì)具有生物活性信號(hào)的生物材料精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞行為是決定修復(fù)效果的關(guān)鍵因素之一。

常見生物活性信號(hào)包括可溶性因子、細(xì)胞外泌體、核酸小分子、活性多肽和蛋白質(zhì)等，可通過化學(xué)綴合或物理負(fù)載的方式將生物活性信號(hào)與基體生物材料組裝為新型功能化生物材料[37]，靶向調(diào)控與損傷相關(guān)的任一或多個(gè)具有時(shí)間序列屬性的生理事件，如炎癥、衰老、瘢痕、干細(xì)胞募集、血管化等，由此促進(jìn)組織損傷修復(fù)。例如，Zhu等[38]設(shè)計(jì)了一種具有干細(xì)胞歸巢作用的自組裝多肽水凝膠，并采用該凝膠遞送與骨關(guān)節(jié)衰老基因相關(guān)的微小核糖核酸，用以抑制軟骨細(xì)胞衰老并創(chuàng)造骨關(guān)節(jié)再生微環(huán)境，從而促進(jìn)受損軟骨的組織修復(fù)及功能重建。Li等[39]將具有抗菌作用的多肽和長(zhǎng)骨生長(zhǎng)肽通過生物正交反應(yīng)結(jié)合到聚醚醚酮材料表面，以獲得具有宿主防御和組織修復(fù)雙重作用的生物活性材料。Kwak等[40]研發(fā)了一種新型的負(fù)載M2型巨噬細(xì)胞(抗炎型巨噬細(xì)胞)外泌體的水凝膠系統(tǒng)，用于維持體內(nèi)持續(xù)釋放高劑量的外泌體，以促進(jìn)損傷區(qū)局部微環(huán)境內(nèi)的巨噬細(xì)胞由M1型(促炎型巨噬細(xì)胞)向M2型轉(zhuǎn)變，加速局部急性炎癥消退，提高傷口愈合的速率?；谏锘钚孕盘?hào)的靶向性及個(gè)性化屬性，設(shè)計(jì)具備生物活性信號(hào)的生物材料是否可以精準(zhǔn)調(diào)控?fù)p傷修復(fù)微環(huán)境，是否可以加速損傷修復(fù)的關(guān)鍵。

3.4 外部刺激信號(hào)

天然組織是一個(gè)不斷產(chǎn)生并解碼動(dòng)態(tài)線索以維持正常生理功能的系統(tǒng)，因此在組織再生過程中重現(xiàn)動(dòng)態(tài)線索，例如組織中由壓電信號(hào)或細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的電場(chǎng)、應(yīng)變和剪切力等，具有重要意義[41]。常見外部刺激信號(hào)例如光刺激、電刺激、磁場(chǎng)刺激、超聲刺激、機(jī)械刺激等環(huán)境物理信號(hào)已被證實(shí)可以通過調(diào)控細(xì)胞行為驅(qū)動(dòng)組織再生[42，43]。特別是，外部電刺激已在臨床上用作脊髓損傷后促進(jìn)神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的輔助手段[44]。然而，由于損傷區(qū)的組織丟失或壞死，損傷區(qū)缺乏有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)，因此使用外部刺激作為獨(dú)立療法具有一定的局限性?，F(xiàn)階段研究表明，外部刺激聯(lián)合智能化響應(yīng)性的生物材料可以提高信號(hào)的傳導(dǎo)效率。在組織修復(fù)進(jìn)程中，接收了外部刺激信號(hào)的響應(yīng)性生物材料在損傷組織處對(duì)信號(hào)進(jìn)行翻譯并轉(zhuǎn)導(dǎo)為對(duì)內(nèi)源性細(xì)胞有觸發(fā)意義的信號(hào)，使細(xì)胞將接收的外部刺激信號(hào)轉(zhuǎn)化為生化輸出，從而實(shí)現(xiàn)外部刺激精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞行為[45]。例如，Yun等[46]研究發(fā)現(xiàn)，包載磁性納米材料的聚己內(nèi)酯支架與靜磁場(chǎng)聯(lián)合應(yīng)用顯著增強(qiáng)了成骨細(xì)胞的體外堿性磷酸酶活性和成骨相關(guān)基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)。另外，成骨細(xì)胞的分化在體外提高了內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達(dá)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，磁性支架與外部刺激的聯(lián)合應(yīng)用加速了小鼠顱骨缺損的體內(nèi)骨形成。Lei等[47]報(bào)道了一項(xiàng)電刺激與導(dǎo)電水凝膠結(jié)合用于治療深層傷口修復(fù)的研究，研究表明，原位移植到損傷區(qū)的導(dǎo)電水凝膠不僅可以接收并傳導(dǎo)內(nèi)源性電流，還可以響應(yīng)外部電刺激信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞增殖并遷移至損傷深處，促進(jìn)血管生成和傷口愈合。另外，通過設(shè)計(jì)異質(zhì)性的響應(yīng)性生物材料或編碼外部刺激參數(shù)可實(shí)現(xiàn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的時(shí)間及空間可控性，達(dá)到信號(hào)按需釋放，以協(xié)調(diào)復(fù)雜的組織再生行為[48]。

4 基于生物材料的多模態(tài)組織工程策略在神經(jīng)損傷修復(fù)中的應(yīng)用

神經(jīng)系統(tǒng)由中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)組成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)包括腦和脊髓，而周圍神經(jīng)系統(tǒng)則包括除中樞神經(jīng)系統(tǒng)以外的所有神經(jīng)。中樞神經(jīng)損傷后的再生能力極其有限，目前臨床上仍缺乏確切有效的治療方案。周圍神經(jīng)損傷后雖然具有一定的再生能力，但仍有許多挑戰(zhàn)亟待解決，比如長(zhǎng)距離、粗直徑、混合神經(jīng)的缺損、神經(jīng)瘤的形成等。神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)涉及一系列復(fù)雜的病理生理過程，一直是組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)難點(diǎn)之一。

近年來，用于神經(jīng)組織工程的生物材料支架為神經(jīng)損傷修復(fù)帶來了新的思路。研究表明，各類可移植生物材料支架可以填充神經(jīng)損傷后形成的空腔或缺損，為細(xì)胞提供適合生長(zhǎng)粘附的基質(zhì)和適宜生存的微環(huán)境，并通過與細(xì)胞的相互作用對(duì)細(xì)胞命運(yùn)施加影響，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)再生。而在促進(jìn)神經(jīng)再生的過程中，通過設(shè)計(jì)生物材料的物理、化學(xué)、力學(xué)、生物學(xué)等性質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)“定制化設(shè)計(jì)”的生物材料-細(xì)胞相互作用是至關(guān)重要的?；诖嗽O(shè)計(jì)策略，作者課題組在前期工作中設(shè)計(jì)了一系列“All-in-One”的多模態(tài)生物功能材料，發(fā)揮多模態(tài)再生調(diào)控信號(hào)的協(xié)同作用用于神經(jīng)損傷修復(fù)。

纖維蛋白是天然細(xì)胞外基質(zhì)的成分之一，在術(shù)中止血、傷口修復(fù)以及組織工程等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[49]。纖維蛋白的生物相容性好，降解產(chǎn)物無毒且具有一定促進(jìn)損傷修復(fù)的作用[50]。此外，纖維蛋白表面有很多蛋白質(zhì)、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)，在理化性質(zhì)方面具有很大的改性潛力，為實(shí)現(xiàn)多模態(tài)信號(hào)的生物材料支架構(gòu)建提供了可能[50]?？紤]到纖維蛋白材料在組織損傷修復(fù)中展現(xiàn)的優(yōu)越性，作者課題組[51]在前期研究中利用液態(tài)接收靜電紡絲技術(shù)創(chuàng)新地制備了一種多級(jí)定向納米纖維蛋白水凝膠(hierarchically aligned fibrin nanofiber hydrogel，AFG)生物支架，并將該支架用于神經(jīng)損傷修復(fù)。AFG具有從納米、微米到厘米尺度上的高度定向排列的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，可為軸突的再生提供生物物理信號(hào)引導(dǎo)(圖2)。

同時(shí)，AFG還具有類似天然神經(jīng)組織的軟力學(xué)性能，可通過力學(xué)信號(hào)的傳導(dǎo)影響干細(xì)胞的分化命運(yùn)。作者課題組[51]前期研究中發(fā)現(xiàn)，AFG所提供的定向結(jié)構(gòu)信號(hào)和力學(xué)信號(hào)對(duì)促進(jìn)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的神經(jīng)源性分化具有協(xié)同作用，并可促進(jìn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的快速定向排列延伸。此外，在大鼠T9背側(cè)半切脊髓損傷模型中植入AFG后，觀察到了再生的神經(jīng)軸突沿AFG纖維的定向延伸，表明AFG可有效促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)。

研究表明，血管組織可以為新生神經(jīng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。因此，在前期基礎(chǔ)上，作者課題組[52]聚集“神經(jīng)血管再生微環(huán)境”的仿生構(gòu)建，通過分子自組裝技術(shù)將各類促血管和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的短肽，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子與AFG水凝膠結(jié)合，使該水凝膠進(jìn)一步功能化，得到了可協(xié)同遞送結(jié)構(gòu)信號(hào)、力學(xué)信號(hào)和生物活性信號(hào)的自組裝多肽-纖維蛋白多模態(tài)功能水凝膠支架(aligned fibrin/self-assembling peptide multimodal functionalized hydrogel scaffolds，AFG/fSAP)(圖3)。

圖3 負(fù)載多模態(tài)信號(hào)的定向纖維蛋白/功能化自組裝多肽水凝膠的構(gòu)建及功能示意圖[52]

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，多模態(tài)水凝膠AFG/fSAP與單獨(dú)提供血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子或腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子模擬肽活性信號(hào)的支架相比，能有效促進(jìn)雪旺細(xì)胞的髓鞘化以及血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和增殖[53]。進(jìn)一步的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，免疫熒光染色、定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和生物信息學(xué)分析結(jié)果均表明，多模態(tài)水凝膠AFG/fSAP可通過多模態(tài)信號(hào)的遞送促進(jìn)神經(jīng)軸突和血管的協(xié)同再生，有效實(shí)現(xiàn)了大鼠T9脊髓半橫斷損傷和長(zhǎng)距離周圍神經(jīng)損傷(15 mm)后的神經(jīng)組織再生以及運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[52，54]。

除了“神經(jīng)血管再生微環(huán)境”外，越來越多的研究表明，“干細(xì)胞機(jī)械力學(xué)微環(huán)境”對(duì)于調(diào)控干細(xì)胞的命運(yùn)起到關(guān)鍵作用，這對(duì)于提升基于干細(xì)胞的神經(jīng)損傷組織工程療法的治療效果具有重要意義。N-鈣粘蛋白是一種存在于天然中樞神經(jīng)系統(tǒng)的糖基化跨膜蛋白，是NSC細(xì)胞間粘附的識(shí)別位點(diǎn)，并影響NSC分化譜系。因此，作者課題組[55]聚焦“干細(xì)胞機(jī)械力學(xué)微環(huán)境”，通過生化結(jié)合技術(shù)將N-鈣粘蛋白結(jié)合至AFG水凝膠進(jìn)行功能化，得到N-cadherin-Fc修飾的多模態(tài)纖維蛋白水凝膠(aligned fibrin nanofiber hydrogel modified with N-cadherin-Fc，AFGN)支架，并將該水凝膠支架用于遞送NSC治療脊髓損傷。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與未經(jīng)修飾的AFG支架相比，AFGN支架可通過釋放N-鈣粘蛋白生物活性信號(hào)，增強(qiáng)NSC對(duì)AFGN支架定向納米纖維結(jié)構(gòu)和軟基質(zhì)的機(jī)械力學(xué)感應(yīng)，有效促進(jìn)NSC在AFGN支架上的粘附、沿支架纖維方向的細(xì)胞骨架延伸以及神經(jīng)元方向分化(圖4)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AFGN可通過遞送多模態(tài)協(xié)同調(diào)控信號(hào)為移植的NSC“量身定制”生長(zhǎng)微環(huán)境，精準(zhǔn)調(diào)控移植NSC的命運(yùn)，促進(jìn)移植NSC在脊髓損傷區(qū)域的駐留、長(zhǎng)期存活、免疫調(diào)節(jié)和向神經(jīng)元方向分化并與宿主整合，在大鼠脊髓全橫斷損傷模型中取得了良好的治療效果。

圖4 N-cadherin-Fc修飾的多模態(tài)纖維蛋白水凝膠(AFGN)調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)[55]：(a)AFGN水凝膠的制備，(b)AFGN水凝膠顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞粘附，(c)AFGN水凝膠顯著促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的力學(xué)傳感相關(guān)基因表達(dá)，(d)AFGN水凝膠促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細(xì)胞，(e)AFGN水凝膠顯著上調(diào)神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元相關(guān)基因表達(dá)

設(shè)計(jì)具有多模態(tài)調(diào)控信號(hào)的生物材料可精準(zhǔn)調(diào)控神經(jīng)再生過程，而外部刺激信號(hào)也可以作為多模態(tài)信號(hào)的一部分，與生物材料聯(lián)合應(yīng)用起到“協(xié)同增效”的作用。例如，磁刺激信號(hào)具有無痛、無創(chuàng)和深部穿透的特點(diǎn)，且具有調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞行為、神經(jīng)保護(hù)和促進(jìn)損傷后軸突再生等作用[56]。因此，作者課題組[57]聚焦“磁響應(yīng)再生微環(huán)境”，在靜電紡絲的過程中使AFG內(nèi)部嵌入均勻的磁性納米顆粒，開發(fā)了一種磁響應(yīng)性定向納米纖維水凝膠。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在大鼠脊髓全橫斷損傷區(qū)域移植磁響應(yīng)性定向納米纖維水凝膠并在局部施加外部磁場(chǎng)后，該水凝膠可有效響應(yīng)外部磁場(chǎng)信號(hào)的刺激，促進(jìn)脊髓全橫斷大鼠損傷后的神經(jīng)血管協(xié)同再生及運(yùn)動(dòng)功能重建，證實(shí)了這種多模態(tài)信號(hào)協(xié)同遞送的神經(jīng)組織工程療法的優(yōu)越性。

5 結(jié) 語(yǔ)

隨著生物醫(yī)用材料科學(xué)與工程進(jìn)入“納米”、“生物”和“智能”時(shí)代，組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域正在發(fā)生革命性變化。新一代生物醫(yī)用材料向著功能化、個(gè)性化、智能型和再生型的趨勢(shì)發(fā)展。生物材料在組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用中的核心作用在于為組織/細(xì)胞構(gòu)建適宜的“再生微環(huán)境”，提供必要的指導(dǎo)性細(xì)胞調(diào)控信號(hào)，引導(dǎo)組織的再生重塑過程?；谏锊牧系亩嗄B(tài)組織工程策略可通過遞送多重協(xié)同調(diào)控信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷區(qū)微環(huán)境和再生過程相關(guān)細(xì)胞命運(yùn)的精準(zhǔn)有序調(diào)控，激活組織再生潛能，具有廣闊的應(yīng)用前景。

天然組織/器官的生長(zhǎng)發(fā)育和損傷修復(fù)過程都是一個(gè)多種細(xì)胞參與的、具有鮮明時(shí)空調(diào)制屬性的復(fù)雜過程。因此，在損傷后組織/器官再生的過程中，巧妙利用生物材料復(fù)現(xiàn)組織或器官生長(zhǎng)發(fā)育的動(dòng)態(tài)過程和關(guān)鍵調(diào)控靶點(diǎn)，使損傷組織按照“正確”的方向進(jìn)行修復(fù)，避免無功能或病理性新生組織的形成，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)損傷后組織的精準(zhǔn)再生與功能重建。目前，設(shè)計(jì)并優(yōu)化生物材料，使該材料負(fù)載具有時(shí)間和空間雙重異質(zhì)性的調(diào)控信號(hào)，從全周期組織再生修復(fù)的視角精準(zhǔn)調(diào)控細(xì)胞的動(dòng)態(tài)行為，進(jìn)而促進(jìn)組織重塑，是未來組織工程和再生醫(yī)學(xué)研究的重要方向，仍存在巨大挑戰(zhàn)。

近年來，基于對(duì)天然組織細(xì)胞微環(huán)境和發(fā)育生物學(xué)理解的不斷深入，解析并仿生組織形成過程中細(xì)胞所處環(huán)境的關(guān)鍵信息，可以為多模態(tài)組織工程材料的設(shè)計(jì)提供靈感。生物材料為組織再生修復(fù)營(yíng)造“多功能集成式的再生微環(huán)境”，例如神經(jīng)血管營(yíng)養(yǎng)微環(huán)境、免疫微環(huán)境、抗衰微環(huán)境、力學(xué)微環(huán)境等。顯而易見，新的策略勢(shì)必增加了生物材料設(shè)計(jì)的“復(fù)雜性”，因此解析并篩選出關(guān)鍵的再生調(diào)控信號(hào)，并揭示單一調(diào)控信號(hào)的作用機(jī)制尤為重要。不僅如此，實(shí)現(xiàn)多模態(tài)再生調(diào)控信號(hào)在生物支架材料上的有效整合和協(xié)同作用，也是研究的重要內(nèi)容。

除此以外，生物3D打印技術(shù)在多模態(tài)組織工程支架的制造中展示了不可比擬的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛力。3D打印技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)異質(zhì)性成分和結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)控制，更好地實(shí)現(xiàn)多模態(tài)信號(hào)的集成，有望構(gòu)建高度仿生智能化生物材料，并推動(dòng)組織工程技術(shù)向著更高效、更先進(jìn)、更智能的方向發(fā)展。同時(shí)，載細(xì)胞打印有助實(shí)現(xiàn)仿“生活”組織的制造，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)“細(xì)胞微環(huán)境”和“非細(xì)胞微環(huán)境”的協(xié)同。

總之，基于生物材料的多模態(tài)組織工程策略將充分發(fā)揮生物材料的生物學(xué)效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)生物材料對(duì)干細(xì)胞、免疫細(xì)胞、組織特異性細(xì)胞的功能調(diào)控，協(xié)同促進(jìn)組織再生修復(fù)和功能重建。未來有望在諸如神經(jīng)等復(fù)雜組織的再生修復(fù)中發(fā)揮積極作用，甚至復(fù)雜器官的重建也將成為可能。