楊璐羽，馬敏娟 *，楊永兵，陶向前，王 丹

(1.紅河州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，云南 蒙自 661199；2.彌勒市農(nóng)業(yè)農(nóng)村和科學(xué)技術(shù)局，云南 彌勒 652300)

蘋果是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的常見水果，在種植蘋果期間，為了有效防治病蟲害，使用農(nóng)藥是不可避免的，其中吡蟲啉就是一種使用最為頻繁的殺蟲劑。然而由于我國(guó)果農(nóng)用藥技術(shù)水平參差不齊，部分果農(nóng)在使用吡蟲啉時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)濫用的情況，使得最終流通到市場(chǎng)的蘋果吡蟲啉殘留超標(biāo)。目前檢測(cè)蘋果中吡蟲啉殘留應(yīng)用QuEChERS對(duì)蘋果基質(zhì)的前處理的研究相對(duì)較少。因此，本文基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23379-2009《水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》，應(yīng)用QuEChERS法與固相萃取法進(jìn)行樣品前處理，以期簡(jiǎn)化前處理與儀器分析過程，加快吡蟲啉殘留檢測(cè)速度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑 實(shí)驗(yàn)儀器：超高效液相色譜儀、色譜柱、分液器、移液槍、離心機(jī)、振蕩器、容量瓶、氮吹儀等。

實(shí)驗(yàn)試劑：吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%，100 μg/mL-1)、乙腈、甲酸、乙酸銨、N-丙基乙二胺、純水、氯化鈉、無水硫酸鎂、氫氧化鈉等，所有試劑均選用色譜純。

1.2 實(shí)驗(yàn)樣品概況 本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的蘋果樣品均采購(gòu)于xx市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，購(gòu)買蘋果樣品共10份，每份樣品均取25.0 g，并進(jìn)行編號(hào)備用。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 標(biāo)準(zhǔn)母液取吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mL，并將轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，以乙腈定容后搖勻，即得到了濃度為10 μg/mL的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)母液。

標(biāo)準(zhǔn)工作溶液分別取0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mL的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)母液，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶，并以乙腈定容，搖勻后接得到了濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 取適量蘋果，將其置于食品粉碎機(jī)中，打碎至勻漿；稱取25.0 g的蘋果樣品，并將其轉(zhuǎn)移至50 mL的離心管中；在離心管中加入20 mL的乙腈，并將其放置于震蕩機(jī)中，渦旋震蕩3 min；取出離心管后，在其中加入2 g的氯化鈉和3 g的無水硫酸鈉，再次放置于震蕩機(jī)中，渦旋震蕩2 min；震蕩結(jié)束后，將離心管轉(zhuǎn)移至離心機(jī)中，以4 000 r/min的速度進(jìn)行離心，去上清液進(jìn)行凈化。

1.4.2 固相萃取凈化 在離心管中取4 mL上清液放置于氮吹儀中，于40℃環(huán)境下完全吹干；在吹干后的樣品中再次加入2.5 mL乙腈進(jìn)行復(fù)溶；使用2.5 mL的乙腈淋洗C18色譜柱，并將復(fù)溶后的樣品完全過柱；再次使用5.0 mL的純水進(jìn)行淋洗；使用1.0 mL的乙腈進(jìn)行洗脫；在洗脫后的樣品中加入1.0 mL的純水，進(jìn)行渦旋振蕩30 s；混合均勻后使用0.45 μm的濾膜過濾，過濾后即得到待測(cè)樣品。

1.4.3 QuEChERS凈化 取離心管上清液10.0 mL，并在其中加入0.5 g的氯化鈉與1 g的無水硫酸鎂；將樣品渦旋振蕩30 s，之后靜置5 min；靜置后在樣品中取上清液2 mL，轉(zhuǎn)移至氮吹儀中，40℃濃縮至約0.5 mL；在濃縮后的樣品中加入乙腈，定容至1 mL，再次渦旋震蕩30 s；混合均勻后使用0.22 μm的濾膜過濾，過濾后即得到待測(cè)樣品。

1.5 超高效色譜儀檢測(cè)條件 本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，超高效色譜儀的檢測(cè)條件：色譜柱：ACQUITY UPLCTM BEH C18，50 mm×2.1 mm×1.7 μm；流速：0.30 mL/min；柱溫：35℃；進(jìn)樣體積：1 μL；運(yùn)行時(shí)間：5 min；流動(dòng)相A：0.1%的甲酸與2 mmol/L的乙酸銨等體積混合溶液；流動(dòng)相B：乙腈；洗脫梯度：等度洗脫。

2 結(jié)果與分析

2.1 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)譜圖

空白譜圖(圖1)：

圖1 空白蘋果譜圖

本實(shí)驗(yàn)采用超高效液相色譜儀結(jié)合紫外檢測(cè)器對(duì)標(biāo)準(zhǔn)樣品中的吡蟲啉進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)紫外檢測(cè)器的波長(zhǎng)設(shè)置為270 nm，檢測(cè)分析時(shí)間平均為4.9 min。最終獲得的檢測(cè)色譜圖(圖2)所示。與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比較，本實(shí)驗(yàn)方法的樣品檢測(cè)分析時(shí)間均<10 min，說明本實(shí)驗(yàn)法減小了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法中梯度洗脫的部分時(shí)間消耗。

圖2 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.2 吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照順序分別檢測(cè)0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，超高效液相色譜儀的進(jìn)樣量維持在1 μL，將吡蟲啉的 質(zhì)量濃度作為自變量，同時(shí)以檢測(cè)出的峰面積作為因變量，結(jié)合檢測(cè)數(shù)據(jù)繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示：吡蟲啉濃度在0.05～1.00 μg/mL時(shí)，其線性方程式為Y=412 001.4X+1368.6，R2=0.999 8，說明本實(shí)驗(yàn)獲得的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

2.3 凈化方法 遵循1.4.1中的樣品基礎(chǔ)處理方法制備蘋果檢測(cè)樣品，并分別加入0.04 mg/kg的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，得到待測(cè)樣品A、B。在此之后，分別采用固相萃取法和QuEChERS法對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行凈化，凈化后檢測(cè)樣品得出峰面積與信噪比，其結(jié)果(表1)所示。對(duì)比結(jié)果表明，兩種凈化方法中，固相萃取法凈化后的樣品信噪比檢測(cè)結(jié)果相對(duì)較大，說明這種方法的凈化效果相較于QuEChERS法更好，但與此同時(shí)QuEChERS法檢測(cè)出的吡蟲啉回收率更高。

表1 固相萃取法與QuEChERS法凈化效果比較

2.4 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 在本研究中，我們使用了兩種不同的方法來測(cè)定蘋果中的吡蟲啉殘留量。其中一種是基于液相色譜法的方法，另一種則是基于氣相色譜法的方法。通過對(duì)這兩種方法進(jìn)行比較和對(duì)比，我們可以得到它們的優(yōu)缺點(diǎn)以及適用范圍。定量限度回收率為兩個(gè)方法之間的差異性指標(biāo)之一，它反映了這兩個(gè)方法對(duì)于同一樣品的重復(fù)性和準(zhǔn)確性的表現(xiàn)。回收譜圖(圖3)：

在實(shí)驗(yàn)過程中，我們發(fā)現(xiàn)兩種方法的回收率存在一定的差別。液體相色譜法的回收率相對(duì)較高，達(dá)到了>90%；而氣體相色譜法則較低一些，只有80%左右。按照1.4.1中對(duì)蘋果樣品進(jìn)行基礎(chǔ)處理，并隨機(jī)選取3份蘋果樣品，在其中分別加入0.04、0.06、0.20 mg/kg的吡蟲啉標(biāo)準(zhǔn)品，再按照1.4.3中的QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，凈化后檢測(cè)樣品的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，其結(jié)果(表2)所示。蘋果樣品中吡蟲啉的加標(biāo)回收率范圍為80.2%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.8%～7.5%，符合我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中的相關(guān)要求(回收率在70%～120%內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差≤10%)，說明本實(shí)驗(yàn)?zāi)軌蛴行z測(cè)出蘋果中的吡蟲啉殘留。

表2 蘋果樣品中吡蟲啉的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè) 采集于農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的10份蘋果樣品中均未檢測(cè)出吡蟲啉殘留，說明該農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的蘋果并不存在食品安全問題。

3 結(jié)論與展望

3.1 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)基于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23379-2009《水果、蔬菜及茶葉中吡蟲啉殘留的測(cè)定 高效液相色譜法》，應(yīng)用超高效色譜儀結(jié)合QuEChERS法建立出了一種檢測(cè)時(shí)間更短，檢測(cè)結(jié)果相對(duì)準(zhǔn)確的蘋果中吡蟲啉殘留檢測(cè)方法。與傳統(tǒng)方法相比較，本實(shí)驗(yàn)提出的方法在樣品前處理過程中簡(jiǎn)化了吡蟲啉殘留提取與凈化的過程，同時(shí)通過使用等度洗脫減少了超高效液相色譜儀洗脫的時(shí)間消耗，提升了檢測(cè)方法的靈敏度。檢測(cè)結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)提出的方法能夠?qū)⑦料x啉殘留的檢測(cè)時(shí)間限制在10 min內(nèi)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線在0.05～1.00 μg/mL時(shí)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)>0.999，加標(biāo)回收率范圍為80.2%～91.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.8%～7.5%。本實(shí)驗(yàn)方法具有靈敏度高、操作便捷、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好等多項(xiàng)優(yōu)勢(shì)，適用于檢測(cè)蘋果中的吡蟲啉殘留，為蘋果食品安全質(zhì)量維護(hù)提供一定的技術(shù)支持，具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

3.2 展望 提高農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量，推進(jìn)優(yōu)質(zhì)食品工程是我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向。近年來，我國(guó)消費(fèi)者對(duì)果蔬的品質(zhì)、安全性及其對(duì)消費(fèi)者健康作用的關(guān)注日益提升，蘋果作為最常見的水果之一，其食品安全的維護(hù)至關(guān)重要。本研究通過對(duì)蘋果中吡蟲啉殘留的測(cè)定方法展開研究，探討QuEChERS法對(duì)吡蟲啉殘留檢測(cè)的影響，以期為開展農(nóng)產(chǎn)品中吡蟲啉殘留檢測(cè)方法優(yōu)化提供研究新思路。