左璐瑩, 吳繼來, 初 楚, 陳欣渝, 陳安良*,

(1.浙江農林大學 林業(yè)與生物技術學院，杭州 311300；2.浙江省杭州市臨安區(qū)植物檢疫站，杭州 311300)

植物抗病激活劑被稱為植物疫苗，在離體條件下沒有抑菌能力，但在活體條件下可表現出良好的防治效果[1]。水楊酸 (SA) 是誘導植物抗病性的信號分子，可通過誘導植物產生病程相關蛋白(PR 蛋白)、調節(jié)相關保護酶活性等途徑使植物體產生系統(tǒng)獲得性抗性 (SAR)[2]。目前利用水楊酸防治冬瓜枯萎病[3]、番木瓜環(huán)斑病[4]、草莓白粉病[5]等的效果已被證實，但其在林業(yè)中的實際應用尚未見報道。

油茶炭疽病是油茶Camellia oleifera上最重要的病害之一，可危害油茶果、葉、枝梢和花蕾等部位，引起落果、落蕾、落葉、枝梢枯死、枝干潰瘍，甚至整株衰亡[6]。其病原菌主要為膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides[7]，生產上常采用多菌靈、甲基硫菌靈等苯并咪唑類殺菌劑進行防治[8]，但單一化學農藥長期使用易導致病原菌產生抗藥性[9]，且大量使用殺菌劑對油茶產品質量安全也具有不利影響。將化學殺菌劑與植物抗病激活劑混合使用，可在保證防治效果的同時減少化學藥劑的使用，以減輕化學藥劑帶來的環(huán)境壓力、抗性及農產品殘留污染等問題，對促進綠色防控、推進可持續(xù)農業(yè)生態(tài)發(fā)展具有重要意義[10]。

本研究團隊前期室內試驗發(fā)現，抗病激活劑水楊酸可誘導油茶產生抵御炭疽病的能力，其與咪鮮胺混用對抑制離體炭疽病菌還具有一定的增效作用[11]，但該結論尚未在活體和田間得到證實，目前水楊酸也還未進行單獨的農藥品種登記。本研究采用水楊酸原藥，在油茶苗上針對炭疽病進行了咪鮮胺與水楊酸混配的防治效果試驗，繼而進行了田間藥效試驗驗證，以期在減少殺菌劑咪鮮胺用量的同時，獲得理想的田間防效，達到減藥增效的目的，為植物抗病激活劑的實際應用和油茶炭疽病防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 油茶植株、菌株和藥劑 油茶品種為長林53 號，來源于浙江省建德市油茶苗圃。膠孢炭疽菌C.gloeosporioides菌株由浙江農林大學生物農藥高效制備技術浙江省工程實驗室保存并提供。99.5%水楊酸 (salicylic acid) 原藥，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；450 g/L 咪鮮胺水乳劑 (prochloraz 450 g/L EW)，青島翰生生物科技股份有限公司。

3WBD-16 型背負式電動噴霧器，北京中保綠農科技集團。

母液配制：將750 mg 水楊酸原藥加入4 mL無水乙醇中，再加入1 mL OP-10 乳化劑，混勻，配制為150 mg/mL 的水楊酸母液；將4 g 咪鮮胺EW 加入18 mL 無菌水中，配制為100 mg/mL 的咪鮮胺母液。試驗時用清水稀釋母液，分別配制成以下系列質量濃度藥液：150 mg/L 水楊酸(SA)、100 mg/L 咪鮮胺 (P1)、200 mg/L 咪鮮胺(P2)、300 mg/L 咪鮮胺 (P3)、150 mg/L 水楊酸 +100 mg/L 咪鮮胺 (C1)、150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L咪鮮胺 (C2)、150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺(C3)，同時設清水對照 (CK)，共8 個處理。每組藥劑配制1 L。

1.2 試驗方法

1.2.1 油茶苗施藥及葉片接菌 將供試膠孢炭疽菌菌株接種于經高溫滅菌的PDA 平板上，置于25 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)5 d，備用。選擇長勢良好且大小一致的兩年生油茶苗40 株，分為8 組，對應8 個處理，每組5 株油茶苗，相當于每處理重復5 次。將配制好的藥液分別噴施于各組油茶苗上，至葉片完全潤濕止，并于首次噴藥5 d 后噴施第2 次藥液。于滅菌條件下，在預培養(yǎng)5 d 后的膠孢炭疽菌菌落邊緣打取直徑5 mm 的菌餅。于首次噴藥后5 d (第2 次噴藥前) 以及第2 次噴藥后5、10、15、20、25 d 分別從每株油茶苗上取3 片新葉，進行刺傷后接種菌餅，置于37 ℃、相對濕度80%、遮光的培養(yǎng)室中培養(yǎng)，5 d 后按如下方法測量病斑面積。

將接菌葉片置于45 cm × 45 cm × 45 cm 小型黑色燈棚底部，在15 cm × 15 cm 玻璃片上標記出1 cm × 1 cm 標準面積，用玻璃片將葉片壓展，在燈棚上端進行定焦距拍攝。將照片導入Autodesk Computer Aided Design (CAD)，利用CAD 軟件選取病斑，計量病斑面積。采用Abbott 法[12]評價水楊酸與咪鮮胺混用對防治油茶炭疽病的增效作用。按照式 (1)、式 (2) 和式 (3) 分別計算防治效果 (Cobs，%)、理論防效 (Cexp，%) 和增效系數(SR)。

式 (1)～(3) 中：Lac為對照組病斑面積，cm2；Lat為處理組病斑面積，cm2；C1、C2分別為2 種單劑的實際防效，%。

SR＞1 為增效作用，SR＜1 為拮抗作用，SR=1 為相加作用[12]。

1.2.2 田間藥效試驗 試驗在浙江省杭州市桐廬縣分水鎮(zhèn)油茶基地進行，3 年生白花油茶。

1.2.2.1 藥劑配比及小區(qū)劃分 試驗共設6 個質量濃度處理，分別對應1.1.1 節(jié)中的SA、P1、P2、C1、C2 及對照 CK。每處理3 個小區(qū)，各小區(qū)隨機區(qū)組排列，小區(qū)之間設保護行加以隔離。

1.2.2.2 施藥時間和施藥方法 田間試驗方法參考江西省地方標準DB36∕T1128.4 - 2019 進行[13]。

采用3WBD-16 型背負式電動噴霧器 (單個空心圓錐噴頭，噴孔直徑1.3 mm，操作壓力0.2～0.4 MPa，流量0.65～0.88 L/min)均勻噴霧施藥，用藥液量為2400 L/hm2。于2022 年6 月22 日油茶樹炭疽病發(fā)生初期第1 次施藥，7 d 后 (6 月29 日) 第2 次施藥，全期共施藥2 次。試驗期間不采用任何其他防治措施。

1.2.2.3 藥效調查 每小區(qū)隨機調查5 株油茶樹，每株調查3 枝油茶樹梢的全部葉片，記錄葉片總數、各級病葉數。按發(fā)病程度進行病情分級[13]：0 級，無病斑；1 級，病斑面積占整個葉面積的5%以下；3 級，病斑面積占6%～15%；5 級，病斑面積占16%～25%；7 級，病斑面積占26%～50%；9 級，病斑面積占51%以上。本研究于油茶炭疽病發(fā)生初期進行，施藥前調查病情基數，于第1 次藥后7 d (第2 次藥前，6 月28 日) 及第2 次藥后28 d (7 月26 日) 各調查1 次發(fā)病情況，共調查3 次。按照公式 (4) 和 (5) 分別計算病情指數 (Di) 及防治效果 (E，%)，部分小區(qū)因初始病情基數為0，按照公式 (6) 進行計算。

當初始病情基數不為0 時：

當初始病情基數為0 時：

式 (4)～(6) 中：Na為病級葉片數；a為該病級代表數值 (a= 1，2，3...，9)；N為調查葉片數；Dic0為空白對照區(qū)藥前病情指數；Dic1為空白對照區(qū)藥后病情指數；Dit0為藥劑處理區(qū)藥前病情指數；Dit1為藥劑處理區(qū)藥后病情指數。

1.3 數據處理

運用IBM SPSS Statistics 25.0 對病斑面積和防治效果進行差異顯著性分析，并通過GraphPad 8.0 和Excel 2013 繪制結果圖表。

2 結果與分析

2.1 室內增效作用測定

離體葉片接菌測定結果 (圖1) 表明：第2 次藥后5 d 和10 d，150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺 (C2)處理組的防治效果顯著高于200 mg/L 咪鮮胺單獨處理 (P2)，增效系數分別達到1.38 和1.42 (P＜ 0.05) (表1)，但與300 mg/L 咪鮮胺單獨處理組 (P3) 之間卻無顯著性差異；第2 次藥后5 d，150 mg/L 水楊酸 + 100 mg/L 咪鮮胺 (C1) 處理組防治效果顯著高于100 mg/L 咪鮮胺單獨處理(P1)，增效系數達到1.42，但與P2 組之間則無顯著性差異；表明水楊酸與咪鮮胺混用后具有增效作用。第2 次藥后20 d，C2 組防效為57.26%，150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺 (C3) 組防效為53.29%，顯著高于P2 和P3 組，說明水楊酸與咪鮮胺混用可以有效延長防治持效期至首次施藥后25 d。同時，C3 組當咪鮮胺質量濃度升高至300 mg/L 后，與水楊酸混用并未出現明顯的增效作用，甚至在第2 次藥后10 、15 和20 d，增效系數小于1，說明與水楊酸混用時，咪鮮胺濃度過高反而會降低防治效果。

表1 水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病防治效果的增效作用Table 1 Synergistic effect of the mixture of salicylic acid and prochloraz on the control of anthracnose of C.oleifera

圖1 離體葉片法測定水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病的防治效果Fig.1 Relative control efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera determined by detached leaf inoculation test

此外，第1 次施藥后5 d，水楊酸與咪鮮胺混用的增效效果并不明顯，第2 次藥后5 d 才逐漸表現出二者的增效作用，第2 次藥后15 d，水楊酸與咪鮮胺混用處理組的防治效果顯著高于咪鮮胺單獨處理，說明水楊酸激活油茶的抗病性需要一定時間過程，當油茶被誘導產生抗病性后則可以保持較長時間，從而使得咪鮮胺的持效期延長。

2.2 田間防治效果

田間防治效果見表2。第1 次施藥后7 d，150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺 (C2) 和150 mg/L 水楊酸 + 100 mg/L 咪鮮胺 (C1) 處理組的平均防治效果均顯著高于200 mg/L 咪鮮胺 (P2)、150 mg/L 水楊酸 (SA) 和100 mg/L 咪鮮胺 (P1) 單獨處理組；第2 次藥后7 d，C2 組的防效顯著高于P2，C1 組的防效顯著高于P1 (P＜ 0.05)。即水楊酸與咪鮮胺混用的防治效果均高于單劑單獨使用，說明將2 種藥劑混合施用可以達到增強防效的目的。第2 次藥后28 d，C1 和C2 組的防效均顯著高于P1 和P2 組，表明將水楊酸與咪鮮胺混合施用延長了防治持效期。田間防效結果與室內試驗結果一致。

表2 水楊酸與咪鮮胺混用對油茶炭疽病的田間防治效果Table 2 Field efficacy of the mixture of salicylic acid and prochloraz on anthracnose of C.oleifera

試驗期間，觀察發(fā)現各處理小區(qū)油茶樹長勢、株高、葉片形狀和顏色等均與空白對照區(qū)無明顯差異，表明在試驗期間無藥害現象發(fā)生。

3 小結與討論

本研究通過在油茶苗上施藥后再于離體葉片上接菌的方式，初步篩選出150 mg/L 水楊酸 +200 mg/L 咪鮮胺、150 mg/L 水楊酸 + 300 mg/L 咪鮮胺2 組防治效果顯著的混用處理，證明了2 種藥劑混用存在協(xié)同增效作用，并通過田間藥效試驗，確定了150 mg/L 水楊酸 + 200 mg/L 咪鮮胺混用時對油茶炭疽病的防治效果最佳，與室內生測結果一致。研究表明，水楊酸與咪鮮胺混用可提高對油茶炭疽病的防治效果并延長持效期，在田間應用后有望減少殺菌劑施藥次數和降低施藥濃度，從而減少殺菌劑的用量。

有報道表明，施用外源性水楊酸可以通過提高超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD) 和降低過氧化氫酶 (CAT) 活性，減少脂質過氧化，有效防治芒果炭疽病[14]、甜櫻桃青霉病[15]及山茶灰斑病[16]；可調控月季細胞壁中的防御系統(tǒng)，提高其抗黑斑病的能力[17]，并可有效延長月季切花瓶插壽命達6 倍[18]。王翠蘭等[11]進行了水楊酸和咪鮮胺聯(lián)合施用對油茶炭疽病防治的室內試驗，發(fā)現水楊酸和咪鮮胺混用具有顯著的增效作用，本研究結果與之一致。Takayoshi 等[19]利用噻菌靈(thiabendazole) 結合水楊酸誘導水稻產生系統(tǒng)獲得性抗病能力，提高了藥劑對水稻稻瘟病的防治效果，本研究結果與該報道也相似。有研究者對水楊酸的誘導抗病性進行了歸納，闡述了水楊酸與具有CAT 活性的水楊酸受體蛋白結合，抑制其CAT 活性，導致細胞內過氧化氫濃度升高，從而激活植物體內抗性基因表達的作用機理[1,20-22]，但目前聚焦到外源水楊酸對油茶誘導抗病性的研究還較少。后續(xù)我們還將針對不同階段油茶葉片的抗病性相關生理指標進行測定，以探究其內在機理。

植物免疫誘抗劑通過提高植物自身抗逆性來抵御病蟲害和不良環(huán)境條件的侵害，對解決化學農藥過量使用造成的有害生物抗藥性上升、農業(yè)生態(tài)環(huán)境污染和農產品質量安全等問題均有重要意義[20]。本研究明確了水楊酸和咪鮮胺混合施用可達到減藥增效、延長持效期的目的，并篩選出了其最優(yōu)配比為水楊酸150 mg/L + 咪鮮胺200 mg/L，結果可為油茶炭疽病防控新型綠色農藥產品的研發(fā)生產提供新的思路和依據。