宋成祺，于立權(quán)，崔玉東，

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）又稱乳鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Lactotransferrin，LTF），是一種分子量約為80 kDa 的鐵結(jié)合糖蛋白，屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族[1]。LF 廣泛分布于人和哺乳動(dòng)物乳汁、其他多種組織及其分泌液中，但乳汁中含量較高[2]，其中牛初乳中乳鐵蛋白含量最高。血液中LF 主要由多形核細(xì)胞分泌，骨髓、唾液腺及子宮內(nèi)膜等也能分泌少量乳鐵蛋白[3]。LF 不僅對(duì)維持體內(nèi)細(xì)胞鐵水平發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時(shí)還對(duì)多種病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲表現(xiàn)出強(qiáng)大的抗微生物活性，而且還具有抗炎和抗癌活性，也具有多種酶功能，是先天防御系統(tǒng)的關(guān)鍵組成成分[4]。

牛乳鐵素（Bovine Lactoferricin，Lfcin B）是牛乳鐵蛋白（Bovine Lactoferrin，LFB）在酸性條件下經(jīng)胃蛋白酶水解后，從N 端釋放產(chǎn)生的一種由25 個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）[5-6]。Lfcin B 由牛乳鐵蛋白（LFB）的第17～41 位氨基酸殘基組成，序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中包括5 個(gè)色氨酸（Trp）、3 個(gè)賴氨酸（Lys）和多個(gè)芳香族氨基酸殘基。序列中的2 個(gè)半胱氨酸（Cys）通過(guò)形成分子內(nèi)二硫鍵使Lfcin B 形成不完全的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[7]。Lfcin B 除不能結(jié)合鐵離子外，其他功能則與LFB 基本一致，同樣具有抗微生物、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)以及抗氧化等多重生物學(xué)功能，它的抗菌活性甚至是LFB 的400 多倍[8]。Lfcin B 具有廣譜抗菌作用（包括G+菌、G-菌和真菌），如金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及白色念珠菌（Canidia Albicans）等，但對(duì)腸道細(xì)菌的抑制作用具有選擇性，而對(duì)腸道中的益生菌（如雙歧桿菌、熒光假單胞菌以及乳酸菌等）的抑制效果較差或無(wú)抑制作用[8]；甚至，Lfcin B 在一定濃度范圍內(nèi)能夠劑量依賴性地促進(jìn)益生菌嗜酸乳桿菌的生長(zhǎng)繁殖[9]。

對(duì)于Lfcin B 的抗菌機(jī)制，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者普遍認(rèn)為是Lfcin B 與細(xì)胞膜相互作用有關(guān)。原核細(xì)胞膜含有大量帶負(fù)電的磷脂酰甘油，使細(xì)胞膜帶有凈負(fù)電荷，故帶正電荷的Lfcin B 可與細(xì)胞膜表面的負(fù)電荷基團(tuán)通過(guò)靜電吸引相結(jié)合。研究表明，Lfcin B 氨基酸序列中的第4～9 位氨基酸殘基（RRWQWR）是Lfcin B 發(fā)揮抗菌作用的活性中心[10-11]，其中，3 個(gè)精氨酸（Arg）殘基側(cè)鏈與細(xì)胞膜成分通過(guò)正負(fù)電荷吸引，而Trp 的芳香環(huán)結(jié)構(gòu)與磷脂頭部的甘油相互作用，通過(guò)疏水作用附著于外膜表面，利用疏水結(jié)構(gòu)使Lfcin B 通過(guò)跨膜進(jìn)入細(xì)胞，或者將多個(gè)Lfcin B 聚集到細(xì)胞膜上形成跨膜的離子通道，破壞了膜的完整性，使細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，導(dǎo)致細(xì)胞膜裂解，胞內(nèi)容物外泄，最終死亡[8]。LfcinB 抗真菌的機(jī)制有兩種，一種是對(duì)真菌的直接殺滅作用，Lfcin B 可與真菌細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生相互作用，并影響其細(xì)胞質(zhì)；另一種是通過(guò)提高宿主防御反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)的。來(lái)源于Lfcin B N 端區(qū)域的十肽（FKCRRWQWRM）可通過(guò)提高蛋白酪氨酸激酶（Protein-Tyr Kinase，PTK）活性和激活NADPH氧化酶復(fù)合體來(lái)誘導(dǎo)活性氧簇分子產(chǎn)生而提高多形核白細(xì)胞（polymorphocuclear leukocytes，PMNs）吞噬活性和對(duì)念珠菌屬的殺菌作用[12]。

Ueta 等[12]將Lfcin B 氨基酸序列的第11～25 位氨基酸殘基去除，得到第1～10 位氨基酸殘基構(gòu)成的寡肽，命名為L(zhǎng)fcin B1-10，其序列為FKCRRWQWRM，并證明具有良好的抗菌和激活嗜中性粒細(xì)胞活性。但作為一種來(lái)源于Lfcin B 的新型小分子抗菌肽，對(duì)Lfcin B1-10的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及跨膜區(qū)等尚不清楚，進(jìn)而影響了對(duì)Lfcin B1-10的構(gòu)效關(guān)系及抗菌機(jī)制的認(rèn)識(shí)。因此，研究利用在線生物信息學(xué)工具對(duì)Lfcin B1-10的氨基酸組成、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽及酶切位點(diǎn)等特征進(jìn)行了分析，同時(shí)與Lfcin B 進(jìn)行比較、預(yù)測(cè)，為L(zhǎng)fcin B1-10的深入研究及其構(gòu)效關(guān)系、抗菌作用機(jī)制和實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以牛乳鐵素Lfcin B1-10為研究對(duì)象，氨基酸序列為FKCRRWQWRM；以牛乳鐵素（Lfcin B）作為參照，其氨基酸序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。

1.2 方法

利用在線生物信息學(xué)分析工具對(duì)牛乳鐵素Lfcin B1-10及牛乳鐵素（Lfcin B）的氨基酸組成、理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)、跨膜區(qū)、信號(hào)肽及酶切位點(diǎn)等特征進(jìn)行分析，所用分析工具如表1 所示。

表1 用于生物信息學(xué)分析的工具Table 1 Software for bioinformatic analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸組成

Lfcin B1-10含有10 個(gè)氨基酸殘基，由7 種基本氨基酸組成；Lfcin B 含有25 個(gè)氨基酸殘基，由15 種基本氨基酸組成。Lfcin B1-10與Lfcin B 所含氨基酸殘基數(shù)目和占比如表2 所示。

表2 Lfcin B1-10 和Lfcin B 的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Lfcin B1-10 and Lfcin B

結(jié)果顯示，Lfcin B1-10包含1 個(gè)極微殘基（C）、1個(gè)小側(cè)鏈殘基（C）、3 個(gè)芳香族殘基（F+W）、5 個(gè)非極性（疏水性）殘基（F+C+W+M）、5 個(gè)極性（親水性）殘基（K+R+Q）以及4 個(gè)帶正電荷（堿性）殘基（K+R，占?xì)埢倲?shù)的40%），不含脂肪族殘基和帶負(fù)電荷（酸性）殘基；Lfcin B 則包含7 個(gè)極微殘基（C+G+A+S+T）、9 個(gè)小側(cè)鏈殘基（C+G+A+P+S+T+V）、3 個(gè)脂肪族殘基（L+I+V）、4 個(gè)芳香族殘基（F+W）、14 個(gè)非極性（疏水性）殘基（F+C+W+M+L+G+A+P+I+V）、11 個(gè)極性（親水性）殘基（K+R+Q+S+T）以及8 個(gè)帶正電荷（堿性）殘基（K+R，占?xì)埢倲?shù)的32%），同樣也不含帶負(fù)電荷（酸性）殘基。

以上結(jié)果可以看出，Lfcin B1-10的熱穩(wěn)定性要低于Lfcin B（前者無(wú)脂肪族殘基，而后者含有3 個(gè)），更易于降解，這提示其在相對(duì)高溫的環(huán)境中（如機(jī)體內(nèi)）的抗菌作用可能弱于Lfcin B。因Lfcin B1-10的極性與非極性殘基數(shù)相等（各占?xì)埢倲?shù)的50%），而Lfcin B 的極性殘基數(shù)少于非極性（分別占?xì)埢倲?shù)的44%和56%），故推測(cè)其疏水性弱于Lfcin B。AMPs的抗菌活性與其所含正電荷數(shù)密切相關(guān)，一般認(rèn)為正電荷數(shù)越高則抗菌活性越強(qiáng)，而Lfcin B1-10的正電荷殘基數(shù)僅為L(zhǎng)fcin B 的1/2，且二者均無(wú)負(fù)電荷殘基，這表明Lfcin B1-10的抗菌活性可能弱于Lfcin B。

2.2 理化性質(zhì)

經(jīng)ProtParam 分析，Lfcin B1-10及Lfcin B 的分子式、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、帶電荷氨基酸數(shù)目、半衰期、穩(wěn)定性、脂溶性及親水性等理化性質(zhì)如表3 所示。

表3 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的理化性質(zhì)Table 3 Physicochemical properties of Lfcin B1-10and Lfcin B

結(jié)果顯示，Lfcin B1-10的理論等電點(diǎn)與Lfcin B 基本相同，且均大于11，這可能是它們只含堿性氨基酸，而不含酸性氨基酸的原因。Lfcin B1-10與Lfcin B均可被紫外分光光度計(jì)（280 nm）檢測(cè)。Lfcin B1-10的不穩(wěn)定指數(shù)達(dá)到了108.53，Lfcin B 的不穩(wěn)定指數(shù)則為77.92，表明二者均屬于不穩(wěn)定多肽，且相較于Lfcin B，Lfcin B1-10則更不穩(wěn)定；同時(shí)，Lfcin B1-10的脂肪族指數(shù)為0.00，Lfcin B 的脂肪族指數(shù)為50.80，表明二者熱穩(wěn)定性均較差，且Lfcin B1-10次于Lfcin B，這與氨基酸組成分析的結(jié)果一致，預(yù)示其在實(shí)際應(yīng)用中有一定局限性；親水性平均系數(shù)反映多肽的親水性強(qiáng)弱，其值范圍在-2～2 之間，負(fù)值越大表示親水性越強(qiáng)，正值越大表示疏水性越強(qiáng)，Lfcin B1-10和Lfcin B 的親水性平均系數(shù)分別為-1.550 和-0.576。雖然Lfcin B1-10的疏水性殘基數(shù)與親水性殘基數(shù)相等，且Lfcin B 的疏水性殘基數(shù)還大于親水性殘基數(shù)，但分析結(jié)果卻表明Lfcin B1-10和Lfcin B 均為親水性多肽，且Lfcin B1-10的親水性強(qiáng)于Lfcin B，推測(cè)這可能與氨基酸殘基的排列順序有關(guān)。同時(shí)，這也應(yīng)證了氨基酸組成分析的結(jié)果。

以上結(jié)果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均為不穩(wěn)定的、親水性的陽(yáng)離子型（Lfcin B1-10的凈電荷數(shù)為+4，Lfcin B 的凈電荷數(shù)為+8）小分子抗菌肽。

2.3 二級(jí)結(jié)構(gòu)

如圖1 所示，經(jīng)SOPMA 分析（運(yùn)行參數(shù)：視窗寬度為17，相似度閾值為8，構(gòu)象狀態(tài)數(shù)目為4），Lfcin B1-10的二級(jí)結(jié)構(gòu)僅有無(wú)規(guī)則卷曲（10 個(gè)氨基酸殘基均參與），表明無(wú)規(guī)則卷曲可能是Lfcin B1-10發(fā)揮抗菌作用的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)；Lfcin B 的二級(jí)結(jié)構(gòu)較Lfcin B1-10復(fù)雜，主要為α 螺旋。其中，α 螺旋占44.00%（11 個(gè)氨基酸殘基參與），延伸鏈占16.00%（4 個(gè)氨基酸殘基參與），β 轉(zhuǎn)角占20.00%（5 個(gè)氨基酸殘基參與），無(wú)規(guī)則卷曲占20.00%（5 個(gè)氨基酸殘基參與），推測(cè)α 螺旋可能是其發(fā)揮抗菌作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

圖1 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.1 Secondary structure prediction of Lfcin B1-10 and Lfcin B

2.4 跨膜區(qū)

跨膜區(qū)（transmembrane domain，TMD）是跨膜蛋白的疏水性氨基酸（跨越膜兩側(cè)）區(qū)域，通常為α 螺旋結(jié)構(gòu)。Lfcin B1-10及Lfcin B 均來(lái)源于LFB，而LFB并非跨膜蛋白，理論上不存在跨膜區(qū)，但Lfcin B1-10及Lfcin B 的殺菌作用又與使病原菌細(xì)胞膜裂解現(xiàn)象密切相關(guān)，為了探究其殺菌機(jī)制是否與跨膜作用有關(guān)，使用分析工具TMHMM-2.0 對(duì)Lfcin B1-10、Lfcin B 及LFB 的跨膜區(qū)存在與否進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果顯示，LFB 全序列均不存在跨膜區(qū)，這表明Lfcin B1-10及Lfcin B 的殺菌機(jī)制與跨膜作用無(wú)關(guān)，推測(cè)Lfcin B1-10和Lfcin B 在與病原菌作用過(guò)程中，首先通過(guò)靜電相互作用吸附、聚集在病原菌表面，然后其疏水氨基酸通過(guò)疏水作用插入磷脂雙分子層中，最終導(dǎo)致病原菌細(xì)胞膜通透性增加，直至裂解死亡。

2.5 信號(hào)肽

信號(hào)肽（signal peptides，SPs）是一種引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移（定位）的N-末端的疏水性氨基酸序列（有時(shí)不一定在N 端）。經(jīng)SignalP-6.0 預(yù)測(cè)分析的結(jié)果顯示，LFB 的第1～22 位氨基酸中可能存在信號(hào)肽，而Lfcin B1-10與Lfcin B的氨基酸序列中均不含信號(hào)肽。

有研究認(rèn)為，AMPs 的無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)除了作用于病原菌胞膜，改變胞膜的通透性外，還有助于在病原菌胞膜上形成孔洞，然后進(jìn)入病原菌細(xì)胞，與胞內(nèi)核苷酸或酶作用，干擾其正常代謝，最終抑制或殺死病原菌，這也與研究學(xué)者普遍認(rèn)同的Lfcin B 的抗菌機(jī)制類似。但研究結(jié)果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均無(wú)信號(hào)肽，這表明其自身并不能實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)移，理論上無(wú)法進(jìn)入病原菌胞內(nèi)，故其殺菌機(jī)制可能并非與穿膜作用有關(guān)。

2.6 酶切位點(diǎn)

如表4 所示，經(jīng)Peptide Culter 分析，Lfcin B1-10和Lfcin B 可同被11 種蛋白酶剪切。

對(duì)于Lfcin B1-10，Arg-C 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（高特異性）、糜蛋白酶（低特異性）、梭菌蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶均有多個(gè)剪切位點(diǎn)（≥3），胃蛋白酶（pH＞2）有2 個(gè)剪切位點(diǎn)，LysC、LysN、胃蛋白酶（pH 1.3）和嗜熱菌蛋白酶僅有1 個(gè)剪切位點(diǎn)；對(duì)于Lfcin B，胃蛋白酶（pH 1.3）有2 個(gè)剪切位點(diǎn)，而除胃蛋白酶（pH 1.3）外，其余10 種酶均有多個(gè)剪切位點(diǎn)（≥3）。同時(shí)，Lfcin B1-10序列中僅第3 和第7 位氨基酸殘基為非酶切位點(diǎn)。而Lfcin B 序列中也僅第3、7、14 和16 位氨基酸殘基為非酶切位點(diǎn)。同時(shí)，Lfcin B的酶切位點(diǎn)包含了Lfcin B1-10的所有位點(diǎn)。此外，二者均存在同一位點(diǎn)可被多種酶剪切的特點(diǎn)。

穩(wěn)定性是衡量AMPs 能否投入實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的重要指標(biāo)，而以上結(jié)果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 在機(jī)體內(nèi)均易降解，預(yù)示它們?cè)跈C(jī)體內(nèi)的環(huán)境穩(wěn)定性較差，這也與ProtParam 分析的理化性質(zhì)結(jié)果一致。這雖不利于Lfcin B1-10和Lfcin B 的生物表達(dá)與開發(fā)應(yīng)用，但通過(guò)蛋白酶的酶解作用有助于Lfcin B1-10和Lfcin B 被降解轉(zhuǎn)化為易被機(jī)體吸收利用的小分子氨基酸類物質(zhì)。因此，Lfcin B1-10和Lfcin B 不僅具有良好的生物安全性，同時(shí)還有一定的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

3 討論

1992 年，Bellamy 等[6，13]首次發(fā)現(xiàn)LFB 的抗菌結(jié)構(gòu)域的一級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)于其氨基酸序列N-末端的第17～41 位殘基，他們從LFB 的胃蛋白酶體外酶解物中分離得到這段序列，并將其命名為L(zhǎng)fcin B。而Lfcin B1-10則是通過(guò)順序去除Lfcin B 氨基酸序列的C-末端殘基來(lái)設(shè)計(jì)的，其保留了Lfcin B 中具有抗菌活性的最小基序RRWQWR，即Lfcin B 氨基酸序列中發(fā)揮抗菌作用的優(yōu)勢(shì)片段[14-16]。Lfcin B1-10的生物學(xué)功能與其結(jié)構(gòu)有關(guān)，通過(guò)對(duì)Lfcin B1-10的生物信息學(xué)分析，可以為進(jìn)一步探究其構(gòu)效關(guān)系與抗菌機(jī)制提供參考。

有研究表明，疏水性氨基酸有助于AMPs 選擇性靶向病原菌胞膜，從而抑制或殺滅病原菌[17]。國(guó)內(nèi)外對(duì)Lfcin B 抗菌活性作用機(jī)制的普遍觀點(diǎn)認(rèn)為，Lfcin B 靠其本身所帶有的正電荷與G+菌細(xì)胞膜上的磷壁酸或G-菌細(xì)胞膜上的脂多糖產(chǎn)生靜電相互吸引，使Lfcin B 附著于膜的表面，然后靠其疏水氨基酸造成細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，并進(jìn)一步引發(fā)形成離子通道，或直接插入細(xì)胞膜使膜裂解，導(dǎo)致胞內(nèi)容物外瀉，使細(xì)菌死亡[18]。故Lfcin B1-10和Lfcin B 的疏水性殘基可能在一定程度上增強(qiáng)了它們的抗菌活性。

一般來(lái)說(shuō)，陽(yáng)離子型AMPs 的抗菌活性較強(qiáng)，且通常帶有2～9 個(gè)正電荷氨基酸殘基（主要為賴氨酸、精氨酸和組氨酸等）。研究結(jié)果顯示，Lfcin B1-10和Lfcin B 的氨基酸序列中分別含有4 和8 個(gè)正電荷殘基（K+R），無(wú)負(fù)電荷氨基酸，凈電荷數(shù)分別為+4 和+8，說(shuō)明二者均為強(qiáng)陽(yáng)離子型AMPs，這可能是它們發(fā)揮抗菌作用的重要基礎(chǔ)[19]。同時(shí)，Lfcin B1-10的凈正電荷數(shù)僅為L(zhǎng)fcin B 的1/2，推測(cè)Lfcin B 的抗菌作用可能強(qiáng)于Lfcin B1-10。但有研究表明，Lfcin B 擁有最強(qiáng)抗菌活性時(shí)所需的最低凈正電荷為+4[20]，故理論上Lfcin B1-10本身即可發(fā)揮與Lfcin B 達(dá)到最強(qiáng)抗菌活性時(shí)同等的抗菌作用。

研究表明，Lfcin B 并不會(huì)使病原菌細(xì)胞膜裂解，但能夠穿透細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，由于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)含有大量多聚陰離子，這些多聚陰離子可作為L(zhǎng)fcin B的作用位點(diǎn)，從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂質(zhì)體融合[21]。也有研究發(fā)現(xiàn)核苷酸可能是Lfcin B 在細(xì)胞內(nèi)的潛在靶點(diǎn)之，Lfcin B 可以穿透核膜[22]。一般認(rèn)為，蛋白若形成跨膜通道需要包含至少18 個(gè)氨基酸殘基[23]。但本研究對(duì)Lfcin B1-10和Lfcin B 的跨膜區(qū)及信號(hào)肽的預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示，無(wú)論是僅含有10 個(gè)氨基酸殘基的Lfcin B1-10還是含有25 個(gè)氨基酸殘基的Lfcin B，均不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，表明Lfcin B1-10和Lfcin B的抗菌作用機(jī)制似乎與跨膜作用及穿膜作用均無(wú)關(guān)，其具體的抗菌作用機(jī)制較為復(fù)雜，有待進(jìn)一步研究。通過(guò)對(duì)Lfcin B1-10和Lfcin B 的酶切位點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，兩種多肽可被多種蛋白酶酶解，在機(jī)體內(nèi)穩(wěn)定性較差。

4 結(jié)論

利用生物信息學(xué)方法對(duì)牛乳鐵素Lfcin B1-10和Lfcin B 進(jìn)行了比較分析。研究發(fā)現(xiàn)二者均為不穩(wěn)定的強(qiáng)陽(yáng)離子型親水性抗菌肽，均沒(méi)有跨膜區(qū)和信號(hào)肽，均可被機(jī)體內(nèi)多種酶降解，生物安全性較高。與Lfcin B 相比，Lfcin B1-10保留了Lfcin B 的最大抗菌活性，二級(jí)結(jié)構(gòu)僅含有無(wú)規(guī)卷曲，較為簡(jiǎn)單。為進(jìn)一步研究牛乳鐵素Lfcin B1-10的構(gòu)效關(guān)系、抗菌機(jī)制提供了理論參考，也為發(fā)現(xiàn)和臨床開發(fā)牛乳鐵素衍生抗菌肽提供了有價(jià)值的實(shí)際應(yīng)用信息。