李秀花，王容燕，高波，馬娟，高占林，趙惟，萬(wàn)艷爭(zhēng)，陳書龍

（河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所/ 河北省農(nóng)業(yè)有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/ 農(nóng)業(yè)部華北北部作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000）

大豆孢囊線蟲（soybean cyst nematode，SCN；Heterodera glycines，Ichinohe） 屬于一種土傳的定居性內(nèi)寄生線蟲，分布遍及世界主要大豆生產(chǎn)國(guó)[1]，嚴(yán)重威脅著大豆的安全生產(chǎn)。SCN 引起的大豆孢囊線蟲病是世界上為害大豆嚴(yán)重的病害之一，在美國(guó)每年造成的經(jīng)濟(jì)損失超過(guò)10 億美元[2]。目前，SCN 在我國(guó)黑龍江、吉林、遼寧、山東、江蘇、河北等22 個(gè)?。ㄖ陛犑?、自治區(qū)）均有發(fā)生[3]，每年造成的大豆受害面積超過(guò)150 萬(wàn)hm2，嚴(yán)重發(fā)病地塊大豆減產(chǎn)30%以上，甚至絕收[4]。

SCN 是專性寄生物，具有明顯的遺傳多樣性。1970 年Golden 等提出用“生理小種”來(lái)表示SCN 的種內(nèi)致病性變異，并且用Pickett、Peking、PI88788 和PI90763 這4 個(gè)大豆品種作為SCN 生理分化的鑒別寄主，用感病大豆品種Lee 68 作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照[5]。1988 年美國(guó)線蟲學(xué)家Riggs 等利用SCN 在4 個(gè)鑒別寄主上的可能反應(yīng)，理論上把SCN 劃分成16 個(gè)生理小種[6]，稱之為Race 鑒定體系。但由于該鑒定體系包含的抗病基因較少，并不能完全把攜帶不同致病基因的SCN 群體區(qū)分開來(lái)，因此，Niblack 等在2002年又建立了一個(gè)新的SCN 基因多樣性分類系統(tǒng)——HG 型分類鑒定體系[7]，以感病寄主對(duì)應(yīng)的寄主序號(hào)來(lái)命名HG 型的類型。截至目前，采用Race 鑒定體系我國(guó)已報(bào)道有1、2、3、4、5、6、7、9、13、14號(hào)共計(jì)10個(gè)生理小種[8～18]。通過(guò)HG 鑒定體系已發(fā)現(xiàn)12 個(gè)HG 型，分別是0、7、2.7、5.7、1.3.7、2.5.7、1.2.5.7、1.2.3.5.7、1.2.3.4.5.6.7、1.2.3.5.6.7、1.3 和2.5.7[19～21]。使用這2 種鑒定體系對(duì)SCN 群體進(jìn)行鑒定[20]，得到的結(jié)果并不完全對(duì)應(yīng)。HG 型鑒定體系更能體現(xiàn)出SCN 不同毒力表型的多樣性，但使用鑒別寄主過(guò)多，且鑒定所需的孢囊線蟲群體數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于Race 鑒定體系，因而，對(duì)于數(shù)量較少的SCN群體就無(wú)法進(jìn)行有效的HG 型鑒定。

20 世紀(jì)90 年代河北省大豆種植面積最高達(dá)到52萬(wàn)hm2左右，之后逐年下滑。自2018 年國(guó)家實(shí)施大豆振興計(jì)劃以來(lái)，河北省大豆種植面積又開始出現(xiàn)恢復(fù)性增長(zhǎng)，2022 年純大豆種植面積達(dá)9 萬(wàn)hm2、大豆/玉米帶狀復(fù)合種植新模式面積約7 萬(wàn)hm2，大豆孢囊線蟲病呈嚴(yán)重上升趨勢(shì)。種植抗病品種是防治大豆孢囊線蟲病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，而深入了解SCN 的生理小種或HG 型是開展大豆抗孢囊線蟲品種選育以及品種合理布局利用的重要前提。早在2006 年，河北省SCN群體已報(bào)道有1、2、5 號(hào)生理小種，無(wú)HG 型鑒定報(bào)道。SCN 的致病型變異與品種的更迭密切相關(guān)。截至目前，大豆種植面積銳減后的迅速擴(kuò)張以及感病品種的大面積種植是否會(huì)引起河北省SCN 群體的毒性變異尚不明確。基于此，在河北省近幾年大豆種植面積大且SCN發(fā)生重的地市采集土樣，對(duì)其SCN 群體均采用Race和HG 型2 種鑒定體系進(jìn)行鑒定，旨為大豆抗孢囊線蟲品種選育以及大豆孢囊線蟲的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

大豆孢囊線蟲致病型鑒別寄主共9 個(gè)，分別為L(zhǎng)ee、Peking（PI548402）、PI88788、PI90763、Pickett、PI437654、PI209332、PI89772 和PI548316，其中Lee為感病對(duì)照。均由沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)，并在河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所隔離繁育后使用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大豆孢囊線蟲病土采集 2020 年10 月大豆收獲后，在河北省大豆主產(chǎn)區(qū)的邯鄲市磁縣、保定市安國(guó)市北揚(yáng)城鄉(xiāng)、唐山市豐臺(tái)區(qū)岳龍鎮(zhèn)、滄州市滄縣周莊子和承德市灤平區(qū)平坊村大豆孢囊線蟲病重病田，用軍用鐵鏟在根圍取土樣，裝入塑料袋，置于室外陰涼處。翌年4 月使用。

1.2.2 大豆鑒別寄主種子催芽 將9 個(gè)大豆鑒別寄主的種子，先用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的NaClO 溶液表面消毒3 min，而后用無(wú)菌水沖洗干凈，置于25 ℃左右的溫水中浸泡6～7 h。將浸泡好的大豆種子置于內(nèi)墊2 層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，向?yàn)V紙上滴加無(wú)菌水2 mL，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中催芽。經(jīng)過(guò)3～4 d，待種子幼苗根長(zhǎng)2 cm、芽長(zhǎng)1 cm 左右時(shí)播入花盆。

1.2.3 大豆孢囊線蟲病土配制 2021 年4 月下旬將采集的大豆孢囊線蟲病土過(guò)篩，混合均勻后取200 mL，采用漂浮法[16]分離土樣中的孢囊，統(tǒng)計(jì)飽滿孢囊的數(shù)量。重復(fù)3 次取樣。

為了減少試驗(yàn)誤差，使各鑒別土壤中含有的線蟲數(shù)量差別不是太大，對(duì)含有孢囊數(shù)量較多的土壤摻入一定量的滅菌細(xì)沙土（土、細(xì)沙體積比為1∶3），將各地區(qū)病土中的飽滿孢囊數(shù)量調(diào)整至300～600 個(gè)/L（土樣）。再次分離混合土樣中的孢囊，確定孢囊數(shù)量。

1.2.4 大豆栽種與管理 用燒杯量取混合好的病土500mL 裝入花盆（上口直徑11cm、下口直徑10.5cm），栽種1 株已催芽的鑒別寄主，覆土后澆水使土壤濕透，置于陽(yáng)光溫室（溫度18～28 ℃）內(nèi)，正常管理。每處理重復(fù)8 盆。

1.2.5 大豆病害調(diào)查 大豆生長(zhǎng)42 d 后，在雌蟲集中出現(xiàn)時(shí)進(jìn)行調(diào)查。首先統(tǒng)計(jì)根系上的雌蟲數(shù)量；然后利用漂浮法分離土壤中的孢囊[16]，在體式顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢囊數(shù)量。將根系上的雌蟲數(shù)量與土壤中的孢囊數(shù)量之和，計(jì)為大豆孢囊線蟲在大豆播種后42 d 內(nèi)為害大豆并在大豆根系上所形成的雌蟲總數(shù)。

1.2.6 致病性鑒定 主要依據(jù)孢囊線蟲在不同鑒別寄主上的繁殖能力，即每個(gè)鑒別寄主的平均雌蟲指數(shù)（female index，F(xiàn)I），對(duì)大豆孢囊線蟲的生理小種類型[6]和HG 型[7]進(jìn)行鑒定。FI計(jì)算公式為：

FI=鑒別品種每株根系上的平均雌蟲數(shù)/感病對(duì)照品種每株根系上的平均雌蟲數(shù)×100

其中，F(xiàn)I≥10 時(shí)為感??；FI＜10 時(shí)為抗病。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地區(qū)土壤中的孢囊數(shù)量

測(cè)定結(jié)果（表1）顯示，5 個(gè)地區(qū)根圍土樣中含有的大豆孢囊線蟲孢囊數(shù)量為340～2 763 個(gè)/L，均滿足盆栽試驗(yàn)鑒別所需的發(fā)病條件。其中，滄州市土壤中的孢囊數(shù)量最高，承德市土壤中的孢囊數(shù)量最低，土壤中含有孢囊數(shù)量最多量是最少量的8 倍以上。

不同地區(qū)原有土樣中的孢囊數(shù)量差異較大，為了減少試驗(yàn)誤差，對(duì)含有孢囊數(shù)量較多的土壤摻入一定量的滅菌細(xì)沙土進(jìn)行調(diào)整。調(diào)整后各鑒別土壤中的孢囊數(shù)量為340～603 個(gè)/L。

2.2 大豆孢囊線蟲群體的生理小種鑒定

鑒定結(jié)果（表2） 顯示，感病品種Lee 對(duì)5 個(gè)SCN 群體均表現(xiàn)為高度感病，平均雌蟲數(shù)為195.9～295.5 個(gè)/株；5 個(gè)SCN 群體在4 個(gè)鑒別寄主上形成的雌蟲數(shù)均較少，F(xiàn)I均＜10，鑒別寄主均表現(xiàn)為抗病，參照大豆孢囊線蟲Race 鑒定體系生理小種劃分標(biāo)準(zhǔn)[4]，滄州滄縣群體、唐山豐臺(tái)區(qū)群體、保定安國(guó)市群體、邯鄲磁縣群體和承德灤平區(qū)群體的生理小種均屬于3號(hào)。

表2 河北省5 個(gè)市大豆孢囊線蟲群體的生理小種鑒定結(jié)果Table 2 Identification of races of 5 SCN populations in Hebei Province

2.3 大豆孢囊線蟲群體的HG 型鑒定

鑒定結(jié)果（表3） 顯示，感病品種Lee 對(duì)5 個(gè)SCN 群體均表現(xiàn)為高度感病，平均雌蟲數(shù)為181.9～275.3 個(gè)/株；5 個(gè)SCN 群體在7 個(gè)鑒別寄主上形成的雌蟲數(shù)量均較少，F(xiàn)I均＜10，鑒別寄主反應(yīng)均表現(xiàn)為抗病，參照Niblack 的HG 型鑒定體系劃分標(biāo)準(zhǔn)[5]，滄州滄縣群體、唐山豐臺(tái)區(qū)群體、保定安國(guó)市區(qū)群體、邯鄲磁縣群體和承德灤平區(qū)群體的HG 型均屬于0 型。

3 結(jié)論與討論

3.1 討論

大豆孢囊線蟲不同群體間具有明顯的寄生性分化，目前有生理小種[5，6]和HG 型[7]2 套鑒定體系。根據(jù)生理小種鑒定體系，截至目前，世界上報(bào)道SCN 生理小種類別最多的國(guó)家是美國(guó)，已報(bào)道有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15 號(hào)共計(jì)14 個(gè)生理小種，其中3 號(hào)和6 號(hào)為其優(yōu)勢(shì)小種[22]。我國(guó)已報(bào)道有1、2、3、4、5、6、7、9、13、14 號(hào)共計(jì)10 個(gè)生理小種，其中3 號(hào)小種分布于9 個(gè)省、4 號(hào)小種分布于8 個(gè)省、1 號(hào)小種分布于5 個(gè)省。此前河北省已報(bào)道有1、2、5 號(hào)生理小種[18]存在，分別分布在邯鄲、藁城和滄縣。本研究在邯鄲市磁縣、滄州市滄縣、保定市安國(guó)市、唐山市豐臺(tái)區(qū)和承德市灤平區(qū)又發(fā)現(xiàn)了3 號(hào)小種，至此，河北省已有1、2、3、5 號(hào)4 個(gè)生理小種的存在。根據(jù)HG 型鑒定體系，目前在我國(guó)已報(bào)道SCN 有12 個(gè)HG 型，分別為0、7、2.7、5.7、1.3.7、2.5.7、 1.2.5.7、 1.2.3.5.7、 1.2.3.4.5.6.7、 1.2.3.5.6.7、1.3、2.5.7[19～21]。本項(xiàng)目5 個(gè)SCN 群體的HG 型均鑒定為0 型。不同省份或者同一省份不同區(qū)域存在的生理小種或HG 型類型不同，可能與當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件、種植方式和栽培品種不同有關(guān)。

同一田塊發(fā)生的SCN 群體通常是幾個(gè)生理小種的混合體，很少存在單一的生理小種，通過(guò)鑒別寄主反應(yīng)鑒別出來(lái)的只是某個(gè)占優(yōu)勢(shì)的生理小種[11]。在連年種植抗性寄主的選擇壓力下，SCN 生理小種的變異也常有發(fā)生[23]，如在黑龍江大慶市和安達(dá)市大豆孢囊線蟲重病地連續(xù)種植抗病品種，導(dǎo)致這兩地生理小種發(fā)生變異[11，24]，黑龍江省大慶市3 號(hào)小種分化為1 號(hào)或14 號(hào)小種[24，25]，安達(dá)市3 號(hào)小種分化為4 號(hào)、6 號(hào)或14 號(hào)小種[26，27]。本研究結(jié)果表明，河北省的SCN 出現(xiàn)了毒性最弱的3 號(hào)小種。而以前滄縣是5 號(hào)小種，邯鄲市是1 號(hào)小種[18]。探究原因，可能是本研究樣品采集地點(diǎn)與原有采集地點(diǎn)不同；也有可能是近幾年種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，大豆種植規(guī)模變??；還有可能是農(nóng)民選擇種植一些缺乏抗性的農(nóng)家品種，對(duì)SCN 造成的選擇壓力變小而使其毒性減弱。同樣在HG 型鑒定體系中，同一地塊SCN 群體通常存在幾個(gè)HG 型。如，美國(guó)愛荷華州立大學(xué)2008 年對(duì)同一地塊的4 個(gè)不同區(qū)域分別進(jìn)行取樣獲得4 個(gè)樣，對(duì)混合樣品的HG 型測(cè)定結(jié)果為1.2.5.6.7，但其中2 個(gè)區(qū)域?yàn)?.2.5.7 HG 型，另2 個(gè)區(qū)域?yàn)?.2.3.5.6.7 HG 型[28]。這也說(shuō)明，無(wú)論采用哪種鑒定體系，得到的鑒定結(jié)果均僅是SCN 群體的特征表現(xiàn)，而非某個(gè)個(gè)體線蟲的特征表現(xiàn)。同時(shí)也說(shuō)明，田間SCN 群體的復(fù)雜性[6]。同一塊地SCN 致病型分化是動(dòng)態(tài)的，常隨著作物品種的變化而變化，因此，應(yīng)加強(qiáng)SCN 致病型分化監(jiān)測(cè)，為抗病品種選育與合理布局提供依據(jù)。

3.2 結(jié)論

對(duì)河北省5 個(gè)市的大豆孢囊線蟲群體，通過(guò)2 套鑒別寄主，分別測(cè)定了每個(gè)鑒別寄主在鑒定體系中的FI；根據(jù)鑒定體系中每個(gè)寄主的FI劃分所屬的生理小種類型或HG 型。結(jié)果表明，河北省滄州滄縣群體、唐山豐臺(tái)區(qū)群體、保定安國(guó)市區(qū)群體、邯鄲磁縣群體和承德灤平區(qū)群體的生理小種均屬于3 號(hào)小種，HG型均屬于0 型。