史亞波 周夢娜 劉華兵 殷俊翔 曹振軍 龔帥昌#

（1 南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院 江西 南昌 330006；2 江西省人民醫(yī)院 南昌 330006；3 南昌醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 江西 南昌 330006）

膽管癌是繼肝細(xì)胞癌之后的第二大常見肝臟惡性腫瘤，在過去的40 年中，膽管癌的總體發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐漸增加[1]。手術(shù)是首選治療方案，但大多數(shù)患者處于疾病中晚期，無法根治性治療影響其結(jié)局?？等R特注射液是一種雙相廣譜抗腫瘤藥物，用于治療多種原發(fā)性惡性腫瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌和乳腺癌，其在體外和體內(nèi)腫瘤模型中被證實(shí)對許多腫瘤細(xì)胞系具有抗增殖和促凋亡作用[2]。臨床應(yīng)用證明，康萊特與化療、放療或手術(shù)相結(jié)合，可顯著降低癌癥惡病質(zhì)，提高癌癥患者的生活質(zhì)量，改善預(yù)后[3]。而康萊特注射液是否可用于膽管癌的臨床治療以及作用機(jī)制等方面的相關(guān)研究甚少。本研究采用人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 作為研究對象，探討康萊特注射液可能的抗腫瘤相關(guān)機(jī)制，為膽管癌臨床診斷及藥物治療篩選提供新的理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 材料 人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810（上?？道噬锟萍加邢薰荆?，臨床藥物100 mg/ml 康萊特注射液（國藥準(zhǔn)字Z10970091），RPMI-1640 培養(yǎng)基（美國GIBCO 公司），10%胎牛血清（FBS，美國GIBCO 公司），磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）和胰蛋白酶-EDTA（德國Merck 公司），CCK-8 試劑盒和蛋白提取試劑盒（上海碧云天公司），Transwell 小室（北京萌壯科技有限公司），兔抗人Bcl-2、Bax 和Caspase-3 單克隆抗體（美國CellSignaling 公司），鼠抗人GAPDH 單克隆抗體（美國Abcam 公司），0.1%結(jié)晶紫染色液（廣州和為醫(yī)藥科技有限公司），碘化丙啶（北京奧萊博科技有限公司），4%多聚甲醛溶液（湖北科沃德化工有限公司），辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（美國Santa Cruz 公司），RIPA 細(xì)胞裂解液（北京索萊寶科技有限公司），Annexin V-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（美國BD 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取用人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 分別置于內(nèi)含10%FBS 及1%青霉素鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2和98%相對濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在pH 7.4 下用PBS洗滌，并用胰蛋白酶-EDTA（0.25%）分離傳代后取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 運(yùn)用CCK-8 法檢測康萊特注射液對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 的增殖影響 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810（制備成單細(xì)胞懸液），取對數(shù)生長期的細(xì)胞分別以每孔5×103個細(xì)胞/ml 接種于96 孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)，四周用PBS 填滿，作為實(shí)驗(yàn)組，同時以此方法設(shè)置空白對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）。分別在24 h、48 h、72 h、96 h 4 個時間段檢測每個時間段的細(xì)胞生長狀態(tài)，設(shè)置6 個復(fù)孔，加入10 μl CCK-8 溶液，在37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h 后酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處各孔的吸光度（OD 值），同時繪制生長曲線，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.3 運(yùn)用流式細(xì)胞儀測定人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 的凋亡情況 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810，取對數(shù)生長期的細(xì)胞分別接種5×105個細(xì)胞至6 孔板，置于37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，離心收集上述細(xì)胞，作為實(shí)驗(yàn)組，以同樣的方式進(jìn)行空白對照組處理（康萊特濃度為0 mg/ml）。同時用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞并重懸，將細(xì)胞懸液（400 μl）加入15 μl Annexin V-FITC、10 μl 碘化丙啶（PI）中充分混勻，孵育20 min 后用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，分析細(xì)胞凋亡并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，用FlowJo V10 軟件處理。

1.2.4 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 的遷移能力 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 作為實(shí)驗(yàn)組，并細(xì)胞計(jì)數(shù)，另設(shè)空白對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）。將細(xì)胞沉淀用無FBS 的培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋（1:6），并調(diào)整濃度為1×105個/ml，取80 μl 細(xì)胞懸液接種于上室。在下室中加入含有10%FBS 作為趨化劑的培養(yǎng)基。在37℃、5%CO2和98%相對濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出Transwell 小室，PBS 沖洗，用棉簽拭去上下室的液體，使用4%多聚甲醛溶液固定20 min，后再次PBS 沖洗，并用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，后顯微鏡下觀察、拍照計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Western Blot 檢測人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 信號通路中關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax 的表達(dá) 采用100 mg/ml 康萊特注射液處理48 h 的人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 作為實(shí)驗(yàn)組，以同樣的方式進(jìn)行空白對照組處理（康萊特濃度為0 mg/ml）。后分別用PBS 洗滌細(xì)胞2 次，使用RIPA 緩沖液充分裂解細(xì)胞，于冰上裂解30 min 后離心，取上清，使用二辛可酸法（BCA）法測定蛋白質(zhì)濃度，通過SDS-PAGE 在80 V 電泳下分離1.5 h，并在100 V 電泳下轉(zhuǎn)移到PVDF 膜2 h。5%脫脂奶粉封閉，加入一抗Caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、Bax（1: 2 000）及內(nèi)參GAPDH（1:2 000）在4℃室溫下孵育過夜。然后在室溫下與HRP 綴合的多克隆IgG（1:1 000）（二抗）結(jié)合，孵育2 h，PBST 洗滌5 min×3 次，使用數(shù)字成像儀拍照，并使用Image J 進(jìn)行灰度值比較分析記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Graphpad Prism 8.0 軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 康萊特注射液對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 增殖的影響康萊特注射液（100 mg/ml）處理RBE 和HCCC9810 細(xì)胞后，與對照組（康萊特濃度為0 mg/ml）相比，隨著藥物作用時間的延長，顯著降低了RBE 和HCCC9810 細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞增殖，并且抑制程度存在時間依賴性，隨作用時間的延長而逐步增加，96 h 時最為明顯（P＜0.05）。見圖1、表1 與圖2、表2。

表1 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 增殖的影響（）

注：n=3 是指重復(fù)了3 次實(shí)驗(yàn)。

?

表2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細(xì)胞增殖的影響（）

表2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細(xì)胞增殖的影響（）

注：n=3 是指重復(fù)了3 次實(shí)驗(yàn)。

?

圖1 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 增殖的影響

圖2 康萊特對人膽管癌HCCC9810 細(xì)胞增殖的影響

2.2 康萊特注射液對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 凋亡率的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)計(jì)算細(xì)胞凋亡率，經(jīng)康萊特注射液（100 mg/ml）處理48 h后，與對照組相比（康萊特濃度為0 mg/ml），康萊特注射液能加速RBE 和HCCC9810 細(xì)胞凋亡（P＜0.05）。見圖3、表3 和圖4、表4。

表3 康萊特對人膽管癌RBE 細(xì)胞凋亡的影響（%，）

表3 康萊特對人膽管癌RBE 細(xì)胞凋亡的影響（%，）

注：n=3 是指重復(fù)了3 次實(shí)驗(yàn)。

?

表4 康萊特對人膽管癌細(xì)胞HCCC9810 凋亡的影響（%，）

表4 康萊特對人膽管癌細(xì)胞HCCC9810 凋亡的影響（%，）

注：n=3 是指重復(fù)了3 次實(shí)驗(yàn)。

?

圖3 康萊特對膽管癌RBE 細(xì)胞凋亡的影響

圖4 康萊特對人膽管癌細(xì)胞HCCC9810 凋亡的影響

2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果 人膽管癌細(xì)胞RBE和HCCC9810 經(jīng)100 mg/ml 康萊特注射液處理48 h后，與對照組比較（康萊特濃度為0 mg/ml），凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白Bcl-2、Bax 和Caspase-3 被檢測到。隨著作用時間的延長，Caspase-3 蛋白表達(dá)增加，Bcl-2 逐漸開始減少，Bax 隨藥物作用時間的增加呈現(xiàn)逐漸上調(diào)的趨勢（P＜0.05）。見圖5、圖6。

圖5 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)水平的影響

圖6 康萊特對人膽管癌細(xì)胞HCCC9810 凋亡通路中的關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 及Bax 蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 康萊特注射液對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響 （Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果）觀察顯微鏡單視野下穿過小室的人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 細(xì)胞數(shù)量見圖7、圖8 及表5。結(jié)果顯示，隨著康萊特用藥時間的延長，在顯微鏡單視野下穿過小室的RBE 和HCCC9810 細(xì)胞數(shù)量與對照組相比較，遷移細(xì)胞的數(shù)量明顯減少（P＜0.05）。

表5 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響（個/ 高倍鏡，）

表5 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 遷移能力的影響（個/ 高倍鏡，）

注：n=3 是指重復(fù)了3 次實(shí)驗(yàn)。

?

圖7 康萊特對人膽管癌細(xì)胞RBE 遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色200）

圖8 康萊特對人膽管癌細(xì)胞HCCC9810 遷移能力的影響（結(jié)晶紫染色200）

3 討論

膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤。它是僅次于肝細(xì)胞癌的第二大最常見的原發(fā)性肝惡性腫瘤，約占所有原發(fā)性肝腫瘤的15%和所有胃腸道癌癥的3%[4]。然而，過去幾十年中，膽管癌的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)不斷增加，這對公共衛(wèi)生帶來了巨大的挑戰(zhàn)，其預(yù)后較差。目前，膽管癌的主要治療方案仍是外科手術(shù)切除，輔以化療。但是，即使進(jìn)行根治性手術(shù)，患者的5 年生存率仍然較低，中位生存時間不到12 個月。這主要是由于膽管癌常常在晚期才被發(fā)現(xiàn)，且易于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。近年來中醫(yī)藥制劑在肝膽腫瘤的治療中起到重要的作用，例如能夠提高外科手術(shù)成功率、改善機(jī)體內(nèi)環(huán)境、調(diào)節(jié)患者免疫力等，同時聯(lián)合應(yīng)用化療藥物不僅能降低化療所帶來副反應(yīng)，還能使其抗腫瘤作用增效，從而提高治療效果[5～6]。

抗腫瘤藥物康萊特注射液的有效成分薏苡仁，具有多種抗癌作用，其主要活性成分是含有4 種脂肪酸的甘油三酯化合物，可以作用于腫瘤細(xì)胞的G2/M 期，抑制細(xì)胞的有絲分裂及生長[7]。此外，康萊特注射液還能有效地抑制腫瘤血管的形成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤細(xì)胞增殖[8]。研究表明，康萊特注射液可以通過對Na+/K+-ATP 酶的抑制來調(diào)控腫瘤生長及影響其細(xì)胞周期，進(jìn)而產(chǎn)生抗癌作用[9]。此外，康萊特已被證明通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt/mTOR 信號通路來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制癌細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性[10～11]。康萊特還可激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，如NK 細(xì)胞的活性，增加CD4+/CD8+的比例，使白細(xì)胞介素（IL）-2 水平分泌增多，降低轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)核因子-κB（NF-κB），促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬功能及脾淋巴結(jié)的增殖，通過免疫調(diào)節(jié)作用在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性[12～13]。這些作用在體內(nèi)表現(xiàn)出抗腫瘤活性，使康萊特注射液成為一種重要的抗癌藥物，但康萊特注射液是否能影響人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC98100 生長、凋亡、遷移，相關(guān)報(bào)道不多見。

本研究發(fā)現(xiàn)，康萊特注射液在作用于人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 后，與對照組相比，康萊特注射液能夠抑制人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810的增殖、遷移能力，誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡，機(jī)制可能與凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bax 和Bcl-2 有關(guān)。Bcl-2 家族的促凋亡和抗凋亡因子通過復(fù)雜的相互作用共同決定著細(xì)胞進(jìn)程，抗凋亡蛋白Bcl-2 高表達(dá)時，形成Bcl-2/Bax 異源二聚體，保護(hù)細(xì)胞，抑制凋亡；而促凋亡蛋白Bax 高表達(dá)時形成Bax/Bax 同源二聚體，通過從線粒體中釋放細(xì)胞色素C 和抑制Bcl-2 的抗凋亡作用使細(xì)胞趨向凋亡。所以，Bcl-2 與Bax 比例大小決定著細(xì)胞的最終歸宿[14]。Bax 是最知名的直接影響細(xì)胞凋亡的下游p53 轉(zhuǎn)錄靶標(biāo)之一，同時Bcl-2 和Bax 的表達(dá)均受抑癌基因p53 的調(diào)節(jié)，p53 已被證明可直接激活促凋亡蛋白Bax、Caspase-3，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[15]。Caspase 是程序性細(xì)胞死亡的關(guān)鍵介質(zhì)，凋亡的早期啟動和晚期進(jìn)展與之密切相關(guān)。激活Caspase-3 使其表達(dá)后能夠催化許多關(guān)鍵細(xì)胞蛋白發(fā)生特異性裂解。Caspase-3 通過自身蛋白水解切割、加工、激活組裝核酸內(nèi)切酶，使核體間DNA 斷裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，其第2 個途徑涉及線粒體的參與，線粒體將Caspase 激活蛋白釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而形成凋亡小體。Caspase-3 也可介導(dǎo)PAK2 和凝溶膠蛋白裂解導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[16]。通過本研究，實(shí)驗(yàn)組中康萊特注射液作用于人膽管癌RBE 和HCCC9810 后，Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達(dá)下調(diào)；基于上述研究結(jié)果，康萊特注射液可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bcl-2 和Bax 來抑制膽管癌的惡性生物學(xué)行為。

綜上所述，本研究表明康萊特注射液可能是一種潛在的、治療膽管癌的藥物，可以抑制人膽管癌細(xì)胞RBE 和HCCC9810 的生長和遷移能力，促進(jìn)其凋亡，機(jī)制可能與其能上調(diào)凋亡信號通路關(guān)鍵蛋白Caspase-3、Bax 和下調(diào)Bcl-2 蛋白表達(dá)有關(guān)。未來的研究還應(yīng)進(jìn)一步探討康萊特注射液在膽管癌治療中的具體作用機(jī)制，以及其與其他治療方法的聯(lián)合應(yīng)用是否可以提高治療效果。