賈瑋瑋, 張 慶, 王 冰

(鄭州大學第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科, 河南 鄭州, 450014)

隨著產(chǎn)前篩查及診斷技術(shù)的快速發(fā)展,無創(chuàng)、直觀、無致畸作用、可重復(fù)的超聲檢查不僅可以檢出明顯的結(jié)構(gòu)異常,還可檢出微小的、一過性非特異性改變的超聲軟指標[1]。頸項透明層(NT)厚度測量是妊娠11～13+6周胎兒超聲檢查的常規(guī)項目。NT增厚被認為是一種與遺傳學異常、結(jié)構(gòu)異常及其他病理狀況有關(guān)的超聲標記物[2]。隨著產(chǎn)前遺傳學技術(shù)研究的不斷發(fā)展,與胎兒NT增厚有關(guān)的產(chǎn)前診斷方法也在不斷進步。本文就胎兒NT增厚的產(chǎn)前診斷的研究進展予以綜述。

1 NT的定義及生理機制

NT指妊娠早期(11～13+6周)檢測出的胎兒頸后皮下積液,超聲表現(xiàn)為頸后檢出無回聲區(qū)。由于此時期胚胎的淋巴系統(tǒng)發(fā)育尚不完善,頸項部的淋巴管內(nèi)會一過性地積聚少量的淋巴液,形成暫時的頸項透明層。而妊娠14周以后,胎兒淋巴系統(tǒng)的迅速發(fā)育會使頸部淋巴管與頸靜脈竇之間相通,將積聚的淋巴液疏散至血液系統(tǒng),頸后積液也會逐漸消散[3]。

2 NT測量的異常范圍

在妊娠11～13+6周期間, NT厚度會因胎兒頭臀長(45～84 mm)的變化而變化。既往研究[4]認為當頭臀長分別為45 mm與84 mm時, NT厚度的中位數(shù)分別為1.2 mm與1.9 mm, 第95百分位則分別為2.1 mm及2.7 mm, 而第99百分位數(shù)為3.5 mm并未隨頭臀長變化。然而HUI L S等[5]近年來對超過8萬名NT增厚胎兒的研究表示, 3.5 mm與第99百分位、3.0 mm與第95百分位之間的關(guān)系并不明確,提出中位數(shù)的1.9倍是更合適的閾值。相關(guān)研究[4]顯示,與將NT增厚的截斷值定義為2.5 mm相比,定義為3.0 mm、3.5 mm時致病性染色體異常的漏診率分別為2.26%及4.52%。

目前國內(nèi)外各產(chǎn)前診斷中心對于NT異常范圍的具體截斷值仍存在爭議。國際婦產(chǎn)科超聲學會并沒有明確NT增厚范圍的嚴格定義,英國胎兒醫(yī)學基金會采用第95百分位數(shù)作為標準,美國婦產(chǎn)科醫(yī)師學會(ACOG)和母胎醫(yī)學學會則認同3.0 mm或第99百分位的閾值[6-7], 方法并不統(tǒng)一。當前中國臨床上大多將固定的數(shù)值如NT≥2.5 mm或3.0 mm作為截斷值[4, 7], 也有部分機構(gòu)采用高于第95百分位為異常標準[8]。因各地區(qū)及人群的特異性與差異性,中國尚未有與NT最佳界值有關(guān)的權(quán)威數(shù)據(jù)研究。毋庸置疑的是在孕早期的不同時期應(yīng)使用不同的截斷值來判斷NT是否異常才更具有特異性以及敏感性。

3 NT增厚的形成機制

3.1 頭頸部淋巴管發(fā)育障礙

正常胎兒在14周后頸項透明層應(yīng)消退,如果胎兒淋巴系統(tǒng)發(fā)育不良,積聚在頸部的淋巴液不能及時連通頸部靜脈竇的進行引流,導致NT增厚顯著[3]。

3.2 心臟系統(tǒng)異常

研究發(fā)現(xiàn),當共同參與心臟及淋巴系統(tǒng)發(fā)育的基因(如血管內(nèi)皮生長因-A, 活化T細胞因子等)發(fā)生突變時可能會引起頸部積液及多種胎兒心臟異常。相關(guān)基因主要編碼內(nèi)皮細胞, BEKKER M N等[9]認為內(nèi)皮損傷會導致先天性心臟畸形的胎兒NT增厚。

3.3 細胞外間質(zhì)成分改變

與染色體異常胎兒皮膚免疫組織化學的相關(guān)研究[8]顯示,編碼組成蛋白的21、18及13號染色體基因數(shù)量的變化,會特異性地增加細胞外間質(zhì)中的透明基質(zhì)成分,可將大量的細胞外液吸附至頸部皮膚發(fā)生海綿狀的改變。

3.4 其他

頭頸部血管過度充盈導致靜脈回流障礙時同樣可導致淋巴液積聚于頸項部,如橫膈膜缺損時腹腔臟器進入胸腔使胸腔壓力增高導致頭頸部靜脈充血[10]; 高動力血流循環(huán)(如低蛋白血癥胎兒)也可導致胎兒水腫引起NT增厚[11]。同時相關(guān)研究[12]提出先天性感染可能會導致心肌功能或造血功能異常,從而引起NT增厚。

目前,頸項透明層增厚的病理生理基礎(chǔ)尚不完全清楚,NT增厚可能由一種或多種機制共同作用形成。

4 NT增厚的臨床意義

4.1 與遺傳學異常的關(guān)系

自20世紀90年代 NICOLAIDES K H等[3]提出NT增厚在提示染色體異常方面的遺傳學價值,近年來相關(guān)研究逐漸深入,與NT增厚相關(guān)的染色體異常種類被不斷完善,而隨NT值的增加染色體異常的發(fā)生率也隨之上升,袁小波等[13]指出,在NT厚度分別為<2.0 mm、2.0～<2.5 mm、2.5～<3.5 mm以及≥3.5 mm的不同分組中,胎兒染色體異常的檢出率分別為5.2%、40%、48%、66.67%。

4.1.1 染色體數(shù)目異常: 與NT增厚最密切的染色體數(shù)目異常為21-三體綜合征,此外, 13-三體、18-三體、性染色體數(shù)目異常、多倍體等也可與NT增厚有關(guān)。MINNELLA G P等[14]肯定了NT增厚與胎兒染色體非整倍體數(shù)目異常之間相關(guān)性及臨床意義,尤其是當NT增厚合并系統(tǒng)結(jié)構(gòu)畸形、生長發(fā)育異常以及靜脈導管a波倒置等其他超聲異常時。

4.1.2 染色體結(jié)構(gòu)異常: 染色體結(jié)構(gòu)異常包括染色體部分缺失、重復(fù)、易位、倒位、插入、等臂以及環(huán)形染色體等。染色體結(jié)構(gòu)異常同樣與胎兒NT增厚密切相關(guān)。由于早期技術(shù)的局限性,產(chǎn)前診斷僅可檢出較大片段的染色體結(jié)構(gòu)異常且無法精準定義其來源及致病性質(zhì)。對NT增厚而染色體核型正常胎兒的深入研究[15]發(fā)現(xiàn),由于長度低至1 kb以上的染色體拷貝數(shù)變異(CNVs)引起的染色體微缺失或微重復(fù)結(jié)構(gòu)異常,部分胎兒在發(fā)育過程中同樣會出現(xiàn)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常或生長發(fā)育異常。CNVs結(jié)果一般參照美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)和臨床基因組資源進行解讀,目前分為5類: 致病性CNVs、可能致病性CNVs、臨床意義不明性(VUS)CNVs、可能良性CNVs和良性CNVs。相關(guān)研究[16]在NT增厚胎兒中利用CNVs檢測技術(shù)可檢出腭心面綜合征、Williams-Beuren綜合征等已知綜合征,這些綜合征可能出現(xiàn)智力低下、心臟畸形、特殊面容等不同臨床癥狀。

4.1.3 單基因疾病: 近年來,隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的迅速發(fā)展,NT與單基因疾病的相關(guān)性研究也逐漸深入。許多遺傳綜合征如Noonan綜合征、脊髓性萎縮癥以及先天性腎上腺增殖癥等與胎兒NT增厚有著密切的關(guān)系[17]。與其他罕見遺傳綜合征相比,與NT增厚有關(guān)的相當一部分單基因疾病與RASopathy家族密切相關(guān),這組遺傳疾病被統(tǒng)稱為RAS病,是由RAS/絲裂原活化蛋白激酶信號通路的失調(diào)引起的,通路中包含有超過20個相關(guān)基因,包括Noonan綜合征等,會出現(xiàn)較為典型的產(chǎn)前超聲表型,包括NT增厚、皮下積液、心臟異常等[18], 通常需要使用帶有定制基因面板的下一代測序或帶有目標數(shù)據(jù)分析的外顯子組或基因組測序進行診斷檢測,如果不合并重大的結(jié)構(gòu)異常,部分異常胎兒無法在產(chǎn)前得以發(fā)現(xiàn)[19]。

4.2 與胎兒結(jié)構(gòu)異常的關(guān)系

NT增厚與胎兒結(jié)構(gòu)畸形密切相關(guān),與心血管系統(tǒng)及骨骼系統(tǒng)關(guān)系最為密切。即使有些相關(guān)遺傳學檢查正常,NT增厚也可能會增加結(jié)構(gòu)異常的風險。相關(guān)研究[20]認為當排除胎兒染色體非整倍體異常時, NT增厚可能會導致更高的結(jié)構(gòu)異常風險。由于NT厚度的截斷值、人群年齡及家族史等不同,不同研究所得到的主要畸形的發(fā)生率存在差異。BOUTOT M等[2]、謝思培等[21]研究發(fā)現(xiàn)排除整倍體異常后NT增厚胎兒的結(jié)構(gòu)畸形發(fā)生率分別為28.7%、28.25%。相關(guān)研究[22]顯示當NT值分別為3.5～<4.5 mm、4.5～<5.5 mm、5.5～<6.5 mm以及≥6.5 mm時,胎兒結(jié)構(gòu)畸形的發(fā)生率分別為15.2%、23.4%、34.5%以及43.0%。

4.2.1 心臟系統(tǒng): NT增厚是預(yù)測胎兒先天性心臟異常的敏感指標,可以在早孕期就篩查出胎兒重大異常及相關(guān)并發(fā)癥[8]。染色體正常胎兒發(fā)生NT增厚的常見原因即包括先天性心臟結(jié)構(gòu)異常。同時NT厚度的增加也會導致先天性心臟病的風險上升。

4.2.2 心外結(jié)構(gòu)異常: NT增厚同樣與一些心外結(jié)構(gòu)異常相關(guān),包括四肢骨骼系統(tǒng)異常如致死性骨骼畸形、成骨不全癥、多指(趾)等; 頭面頸部系統(tǒng)如露腦畸形、無腦兒、顏面裂、頸部淋巴水囊瘤等; 胸腹部異常如膈疝、臍膨出等; 雙胎異常如連體雙胎、雙胎輸血綜合征等[22-24]。

4.3 與胎兒生長發(fā)育的關(guān)系

NT與胎兒生長發(fā)育的關(guān)系主要與巨大兒、體質(zhì)量異常及宮內(nèi)發(fā)育不良有關(guān)。相關(guān)研究[25-26]顯示NT增厚增加了生育巨大兒的風險。KALEM Z等[26]研究發(fā)現(xiàn),隨著NT厚度增加,新生兒出生后1 min Apgar評分降低。

5 NT增厚的產(chǎn)前診斷

5.1 超聲檢查

超聲檢查既可在診斷染色體異常胎兒方面起重要的篩查作用,也可作為無創(chuàng)產(chǎn)前診斷方法對于胎兒的重大器官或結(jié)構(gòu)畸形直接進行診斷。妊娠早期胎兒NT測量聯(lián)合系統(tǒng)結(jié)構(gòu)超聲檢查可以提高出生缺陷的總檢出率。染色體正常及異常的胎兒均可發(fā)生超聲異常。故發(fā)現(xiàn)NT增厚后應(yīng)及時行系統(tǒng)超聲檢查,特別是重點篩查心臟、骨骼系統(tǒng)等結(jié)構(gòu)異常,同時應(yīng)行胎兒超聲心動圖,以評估是否存在其他結(jié)構(gòu)性心臟畸形,可以提供關(guān)于出生缺陷的相關(guān)診斷信息,對后續(xù)進行基因檢測也有參考意義。目前中國已經(jīng)采用NT聯(lián)合三尖瓣血流以及靜脈導管血流頻譜進行先天性心臟病的產(chǎn)前檢查。

5.2 介入性遺傳學檢查

由于NT增厚與遺傳學異常密切相關(guān), 2020年ACOG在關(guān)于胎兒染色體異常篩查的指南中指出,應(yīng)對NT增厚病例常規(guī)行產(chǎn)前遺傳學檢測[7]。常見的介入性檢查包括絨毛、羊水或臍血穿刺等方法,將得到的樣本進行遺傳學相關(guān)檢測。

5.2.1 染色體核型分析: NT增厚與染色體非整倍體異常密切相關(guān)。染色體核型分析技術(shù)需細胞培養(yǎng)且通過光學顯微鏡來判斷是否存在染色體數(shù)目以及較大的結(jié)構(gòu)異常(>5～10 Mb), 故周期較長且分辨率有限,但成本相對較低[7]。如今,染色體核型分析仍是產(chǎn)前診斷最常用的方法之一,是檢測染色體數(shù)目異常的“金標準”。

5.2.2 熒光原位雜交(FISH)及多重連接依賴的探針擴增(MLPA): FISH技術(shù)能特異性識別目的核酸序列,可用于對21、18、13-三體、性染色體非整倍體以及多倍體疾病進行檢測,但其依賴探針的特異性,不能全面發(fā)現(xiàn)染色體倒位復(fù)制等其他異常。如今, FISH仍被用于常見染色體非整倍體的快速初步檢測,以及評估與疾病相關(guān)的特定區(qū)域的缺失或重復(fù)[27]。MLPA是一種基于多重聚合酶鏈式反應(yīng)的檢測技術(shù),可以快速高效地檢測從完整的染色體到單個外顯子的拷貝數(shù)變化,但是需要提取樣本細胞而不是單個細胞的基因組DNA, 且因探針限制只能夠檢測臨床表型的已知變異。因此,高效篩選致病變異仍是目前產(chǎn)前診斷中需要解決的關(guān)鍵問題。

5.2.3 拷貝數(shù)變異測序技術(shù)(CNV-seq): CNV-seq是基于下二代測序基礎(chǔ)的一種對目標DNA進行低深度全基因組測序的方法,可以將得到的測序結(jié)構(gòu)與參考基因組堿基序列比對后進行信息分析發(fā)現(xiàn)異常CNVs。2019年中國專家共識表示此技術(shù)在一定程度上可以彌補染色體核型分析和染色體微陣列分析(CMA)技術(shù)的不足[28]。然而CNV-seq技術(shù)無法檢測出三倍體、多倍體、染色體結(jié)構(gòu)重排以及單親二倍體等雜合性缺失,但可以在平衡易位斷裂點處檢出是否存在微缺失微重復(fù)以及致病性的CNVs。臨床實踐中,在存在產(chǎn)前診斷需求的孕婦中可將此技術(shù)作為一線產(chǎn)前診斷方法[28]。

5.2.4 CMA: CMA作為一項高分辨率檢測技術(shù),可在全基因組水平檢出亞顯微染色體異常以及染色體雜合性缺失。加拿大醫(yī)學遺傳學家學會聯(lián)合加拿大婦產(chǎn)科醫(yī)生協(xié)會于2018年提出對于NT增厚胎兒推薦使用CMA進行產(chǎn)前診斷[29]。楊丹等[30]關(guān)于815例NT增厚胎兒的研究發(fā)現(xiàn)核型正常胎兒的致病性CNVs檢出率為2.3%。因檢測原理以及基因芯片的不同, CMA分為基因組雜交技術(shù)以及單核苷酸多態(tài)性微陣列技術(shù)兩大類。前者主要發(fā)現(xiàn)相對稍大的重復(fù)或者缺失的CNVs; 而后者除檢出CNVs外,還可以檢測出大多數(shù)的單親二倍體、三倍體以及低水平的嵌合體。但CMA僅能檢測芯片探針所覆蓋區(qū)域的拷貝數(shù)情況,不能檢出如著絲粒、隨體等無法檢測的區(qū)域,無法檢出倒位及低比例嵌合體、平衡異位重排信息以及特定綜合征相關(guān)的所有相關(guān)基因位點異常。當提示胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常、宮內(nèi)生長受限、無法排除胎兒存在單親二倍體變異等情況時建議首選CMA檢測[31]。

另外, CMA及CNV-seq中VUS的結(jié)果解讀仍存在困難。VUS指檢出的CNVs在目前已知的數(shù)據(jù)庫和相關(guān)資料中無對應(yīng)片段,且基因功能及與臨床表型的相關(guān)性尚不明確的判讀類型,可加重當事者的焦慮,甚至可能會造成錯誤的妊娠結(jié)局。因為進一步行父母驗證的病例數(shù)偏少、數(shù)據(jù)庫完善不足、數(shù)據(jù)判讀標準差異以及芯片檢測平臺等因素,目前對于VUS的檢出及判讀能力還需不斷積累,以進一步提高數(shù)據(jù)的可信度[7]。

5.2.5 全外顯子組基因檢測(WES): 部分NT增厚胎兒的核型及拷貝數(shù)檢測未見異常時,仍存在單基因遺傳病的發(fā)生風險。雖然外顯子只約占人類基因組的1%,而已知的大部分致病突變都位于外顯子中。WES是一種基于下一代測序技術(shù)的全外顯子組基因分析方法,能夠捕捉全基因組外顯子區(qū)域中的DNA,將其富集后進行高通量測序[32]。WES可進行單基因遺傳病的檢測,具有檢測范圍廣、檢出率高等優(yōu)點。除此之外, WES可能會發(fā)現(xiàn)新的致病基因突變位點,創(chuàng)造較高的科研價值,也能幫助臨床醫(yī)生更好地判斷預(yù)后。由于傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷遺傳學方法的局限性以及WES在兒科中的成功實踐,目前WES已被逐漸應(yīng)用于產(chǎn)前診斷。2020年ACMG發(fā)布相關(guān)指南,認為對于超聲發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常且CMA檢測結(jié)果正常的病例,應(yīng)推薦進一步行產(chǎn)前外顯子組檢測以排除胎兒單基因變異[33]。GIROLAMO R D等[34]和PETROVSKI S等[35]進行了規(guī)模較大的相關(guān)研究均提示W(wǎng)ES可進一步提高產(chǎn)前診斷胎兒遺傳學異常的檢出率。目前認為適用于WES產(chǎn)前診斷的指征限于影像學篩查的胎兒結(jié)構(gòu)畸形,包括多發(fā)畸形、心血管畸形、骨骼發(fā)育異常等。除NT增厚外,提示染色體非整倍體的大多數(shù)超聲軟指標異常如脈絡(luò)叢囊腫、腸管回聲增強等不作為推薦檢測項目[36]。

在臨床實踐中,大多采用將胎兒及父母的樣本同時檢測的家系測試模式,這種模式可以在節(jié)省后續(xù)父母驗證環(huán)節(jié)時間的同時得到更準確的結(jié)果,但是成本也較高,時間較傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法長。WES可以發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)產(chǎn)前檢查無法發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因位點異常,能更好地解釋胎兒的影像學表型。但是WES檢測是基于臨床表型導向的一種檢測方法,當影像學結(jié)果不足或者出現(xiàn)胎兒期無法檢出的智力、語言、運動等功能異常時,產(chǎn)前的WES可能導致對相關(guān)基因的覆蓋并不完全從而出現(xiàn)遺漏或誤差[37]。另外, WES獲得的大量數(shù)據(jù)解讀存在困難。現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫尚不完善,除了與表性相關(guān)變異外,可能存在新變異、意義不明以及次要偶然發(fā)現(xiàn)等難以解釋的情況。另外,除不能檢測非編碼區(qū)變異外, WES并不能夠檢出其他所有類型的變異,包括拷貝數(shù)變異、染色體倒位結(jié)構(gòu)重排等[38], 故仍應(yīng)該與傳統(tǒng)的遺傳學檢查聯(lián)合使用。

目前產(chǎn)前診斷中遺傳學診斷方法以細胞學核型分析檢測為主,并逐漸發(fā)展向CNVs檢查。目前被廣泛應(yīng)用于臨床實踐的CNVs檢測技術(shù)為CNV-seq或CMA,可以明確判斷片段大小、來源以及涉及基因。一項有關(guān)1 658例NT增厚胎兒的大樣本研究[39]指出胎兒染色體數(shù)目異常的檢出率為15.8%, 行CNVs檢測將致病性變異的檢出率提高了3.7%, 并提出無論是否孤立存在的NT增厚(≥2.5 mm)胎兒均需接受介入性產(chǎn)前診斷。當前中國臨床上已普遍將染色體核型分析技術(shù)聯(lián)合CMA或CNV-seq應(yīng)用于NT增厚胎兒的遺傳學產(chǎn)前診斷以降低染色體異常胎兒的漏診率,但是也存在一定的局限性。WES可以檢測至單基因疾病范圍,有著其他傳統(tǒng)產(chǎn)前診斷方法無法比擬的范圍及深度,但其依賴于胎兒表型且結(jié)果解讀困難。2022年中國發(fā)布相關(guān)專家指南指出,由于大量研究表明NT增厚、尤其是>4 mm的胎兒與單基因疾病特別是Noonan綜合征的相關(guān)風險較高,提出常規(guī)產(chǎn)前檢查胎兒核型分析+染色體拷貝數(shù)變異分析+WES檢測的建議[36]。2022年中國相關(guān)專家組發(fā)表建議指出若NT增厚持續(xù)不消退或發(fā)展為水腫、孕中期頸部皮膚皺褶增厚等時,可考慮應(yīng)用WES進行進一步精準檢測[40]。XUE S Y等[41]指出在染色體核型分析及CMA均為陰性結(jié)果的情況下,約13%的NT增厚胎兒應(yīng)用WES得到了異常遺傳學結(jié)果診斷。MELLIS R等[42]研究則提出早孕期孤立性與非孤立性NT增厚胎兒的單基因微小致病性變異檢出率分別為1.8%及22.2%, 而早孕期孤立性NT增厚伴中晚孕超聲異常胎兒的單基因致病性變異檢出率為32.4%, 且檢出率隨NT厚度增加而升高。故對于NT增厚合并有中晚孕期超聲異常的胎兒應(yīng)適時采用WES進一步提高異常胎兒的檢出率,降低出生缺陷率。

6 NT增厚胎兒的預(yù)后

相關(guān)研究[43-44]顯示不良妊娠結(jié)局的風險隨著NT增厚而增大,包括遺傳學異常、重大結(jié)構(gòu)畸形、神經(jīng)發(fā)育遲緩、流產(chǎn)及宮內(nèi)死亡等,需要密切監(jiān)測胎兒發(fā)展進程并早期采取措施。即使NT增厚與許多胎兒異常有關(guān),但也可見于正常胎兒。在臨床咨詢時,醫(yī)師應(yīng)詳細客觀地給予孕婦及家屬個體化指導,避免盲目引產(chǎn)。TEKESIN I[45]回顧分析了近年來NT增厚胎兒相關(guān)數(shù)據(jù),經(jīng)產(chǎn)前診斷排除染色體異常后,健康新生兒活產(chǎn)率為83.7%。PASQUINI L等[44]研究發(fā)現(xiàn),在無系統(tǒng)結(jié)構(gòu)異常、染色體異常以及兒科基礎(chǔ)評估異常的情況下, NT增厚胎兒出現(xiàn)神經(jīng)發(fā)育遲緩的概率與正常人群相當。

綜上所述, NT超聲檢查是篩查胎兒染色體異常、結(jié)構(gòu)異常等的敏感指標,在產(chǎn)前診斷中發(fā)揮著極為重要的作用。對胎兒NT增厚的孕婦,應(yīng)盡早行系統(tǒng)超聲檢查以及侵入性產(chǎn)前診斷排查胎兒結(jié)構(gòu)及遺傳學異常。即使傳統(tǒng)遺傳學檢查(核型+CMA/CNV-seq)陰性,仍然可根據(jù)系統(tǒng)超聲結(jié)果及家族史等綜合考慮行WES, 提高罕見病的檢出率,為NT增厚胎兒的產(chǎn)前診斷及遺傳咨詢提供更準確的信息。