程 婷,楊毅玲,李 琪,甘南琴

(1:中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430072) (2:中國(guó)科學(xué)院大學(xué),北京 100049)

病毒在海洋和淡水系統(tǒng)中的含量超過(guò)每毫升107個(gè)[1],作為特異性感染藍(lán)藻的病毒,噬藻體數(shù)量豐富且種類(lèi)繁多,是水生微生物群落的重要組成部分。研究發(fā)現(xiàn),噬藻體主要通過(guò)裂解來(lái)調(diào)控宿主藍(lán)藻的密度及種群結(jié)構(gòu)[2-4]。據(jù)統(tǒng)計(jì)海洋中每天約有1.5%～6%的聚球藻被噬藻體裂解[5]。同樣淡水水體中噬藻體也能大量裂解藻細(xì)胞,Yoshida等[6]在聚球藻藻華爆發(fā)期間對(duì)日本Mikata湖的研究發(fā)現(xiàn),每天有0.0055%～2.1%的宿主種群被噬藻體裂解。Coulombe等[7]在1981年發(fā)現(xiàn)束絲藻(Aphanizomenonflos-aquae)水華消退時(shí)藻細(xì)胞中存在病毒樣顆粒,因此推測(cè)噬藻體可能參與了該水華的消亡。Weinbauer等[8]在1997年3月到1998年1月監(jiān)測(cè)一個(gè)超富營(yíng)養(yǎng)化池塘發(fā)現(xiàn),噬藻體濃度較高時(shí),銅綠微囊藻密度急劇下降,且產(chǎn)毒微囊藻在所有微囊藻生物量中由47.1%下降到0.5%,表明噬藻體還會(huì)影響產(chǎn)毒和不產(chǎn)毒藍(lán)藻種群結(jié)構(gòu)變化。

上述發(fā)現(xiàn)使噬藻體控藻的應(yīng)用潛力得到關(guān)注,Desjardins等[9]于1983年在發(fā)生Leptolyngbyaboryanum藻華的池塘中添加噬藻體LPP-1,發(fā)現(xiàn)其可以影響藻細(xì)胞的豐度和分布。1988年,Martin等[10]在80 L微宇宙實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),加入噬藻體SM-2使藍(lán)藻生物量顯著下降。隨著越來(lái)越多的噬藻體從水體中被分離,人們逐漸發(fā)現(xiàn)噬藻體控制藍(lán)藻水華的潛力。2006年,Yoshida等[11]在日本分離得到一株可以裂解銅綠微囊藻的噬藻體,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明它可以有效控制銅綠微囊藻水華。此外,2020年,Lin等[12]以華美微囊藻(Microcystiselabens)為宿主分離出一株廣譜噬藻體Me-ZS1,該噬藻體將藍(lán)藻的相對(duì)豐度從33.25%下降到20.63%,而對(duì)照組中藍(lán)藻的相對(duì)豐度為52.77%。張珊珊[13]2022年以銅綠微囊藻FACHB-905藻株為宿主分離出了一株新型廣譜烈性噬藻體Min S1,該噬藻體可以感染幾種不同目的藻類(lèi),包括色球藻目、念珠藻目、顫藻目、段殖藻目和聚球藻目,表明該噬藻體宿主范圍廣泛,在藍(lán)藻水華治理中具有較大的應(yīng)用潛力。

噬藻體在適宜的條件下可快速裂解藍(lán)藻細(xì)胞,其中光照、溫度和MOI(感染復(fù)數(shù),Multiplicity of Infection,噬藻體效價(jià)與藻細(xì)胞數(shù)量比值)是影響噬藻體裂解藍(lán)藻最重要的條件。廖湘勇等[14]發(fā)現(xiàn)在光照周期L∶D=14 h∶10 h條件下,噬藻體A-4(L)在平板上感染PCC 7120藻苔出現(xiàn)同心圓噬藻斑,而持續(xù)光照條件下未出現(xiàn),進(jìn)一步推測(cè)周期光照影響了A-4(L)對(duì)藻細(xì)胞的吸附或子代A-4(L)的釋放,使A-4(L)感染過(guò)程變緩或感染力變?nèi)?。溫度是影響噬藻體感染的另一個(gè)重要因素,有研究發(fā)現(xiàn)溫度升高會(huì)提高噬藻體PP的吸附率[15]。MOI也會(huì)對(duì)噬藻體侵染造成影響,程凱等[16]發(fā)現(xiàn)隨著MOI的增大,鮑氏織線藻被噬藻體PP侵染后藻絲開(kāi)始斷裂的時(shí)間明顯提前,當(dāng)MOI為1∶2時(shí),藻絲從3 h開(kāi)始斷裂,而當(dāng)MOI為10∶1時(shí),藻絲則從2 h開(kāi)始斷裂。

1976-1977年間,Koz’yakov等[17]在蘇聯(lián)列寧格勒通過(guò)篩選約2000份樣品,分離出包括A-4(L)在內(nèi)的共9個(gè)魚(yú)腥藻病毒亞型。在負(fù)染電鏡下觀察,A-4(L)具有一個(gè)長(zhǎng)度約為10 nm的尾部[14],因此被劃分為短尾病毒。A-4(L)侵染宿主細(xì)胞潛伏期很短,在28～30℃條件下只需0.5～2 h[18]。本文以A-4(L)裂解絲狀藍(lán)藻魚(yú)腥藻PCC 7120為例,探究光照、溫度和MOI對(duì)A-4(L)裂解宿主細(xì)胞的影響,探索A-4(L)裂解藻細(xì)胞的最佳投加時(shí)間和投加劑量,并利用室內(nèi)探究的條件開(kāi)展室外噬藻體裂解藻細(xì)胞驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 噬藻體與藍(lán)藻

噬藻體A-4(L)和魚(yú)腥藻PCC 7120均由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所徐旭東研究員惠贈(zèng)。魚(yú)腥藻 PCC 7120 是一種絲狀藍(lán)藻,能夠被A-4(L)裂解。使用BG11液體培養(yǎng)基,在30℃、50 μmol/(m2·s)連續(xù)光照條件下振蕩培養(yǎng)PCC 7120。

1.2 新鮮噬藻體裂解液的制備

培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PCC 7120(OD750為0.5左右)經(jīng)5000轉(zhuǎn)/min(離心機(jī)Eppendorf Centrifuge 5810 R,轉(zhuǎn)頭型號(hào)F34-6-38)離心5 min后用BG11培養(yǎng)基洗滌一次,重懸在等體積的新鮮BG11培養(yǎng)基中。在200 mL藻液中加入1 mL效價(jià)約為107PFU/mL(PFU,Plaque Forming Unit)的A-4(L),將其置于30℃,50 μmol/(m2·s)連續(xù)光照條件下培養(yǎng)2～3 d,至藻細(xì)胞裂解液澄清透明。將裂解液經(jīng)5000 轉(zhuǎn)/min離心5 min,取其上清液。為了盡量去除藻細(xì)胞碎片,再使用10 mL一次性塑料無(wú)菌注射器安裝孔徑0.22 μm無(wú)菌濾膜(Millipore Express PES Membrane Filter Unit)過(guò)濾,過(guò)濾后得到的裂解液置于4℃冰箱保存。每次實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前制備新鮮的裂解液,并用噬藻斑法測(cè)其效價(jià)約為107PFU/mL。

1.3 噬藻體效價(jià)的測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)中用噬藻斑法測(cè)定A-4(L)的效價(jià),將A-4(L)用BG11培養(yǎng)基按10-1,10-2…10-10(900 μL BG11+100 μL A-4(L))梯度稀釋。再?gòu)拿總€(gè)梯度中取100 μL混液與1 mL離心濃縮之后的藻液(OD750為0.5的藻液濃縮10倍)混合,30℃下靜置30 min使噬藻體更好地吸附到藻細(xì)胞后,與等體積的1.5%瓊脂BG11培養(yǎng)基混勻,迅速平鋪在底層瓊脂BG11平板上,每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行。待平板凝固后,將其放在30℃,50 μmol/(m2·s)連續(xù)光照條件下靜置培養(yǎng)2 d,記錄各個(gè)稀釋梯度的噬藻斑個(gè)數(shù)。噬藻體效價(jià)的計(jì)算為,計(jì)數(shù)平板上清晰可數(shù)的噬藻斑個(gè)數(shù),乘稀釋倍數(shù),再乘10即為噬藻體的效價(jià)PFU/mL。

1.4 噬藻體侵染藻株的OD750曲線

將PCC 7120培養(yǎng)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,再經(jīng)5000轉(zhuǎn)/min離心5 min收集藻細(xì)胞用BG11培養(yǎng)基洗滌一次,重懸在等體積的新鮮BG11培養(yǎng)基中。根據(jù)每次實(shí)驗(yàn)要求實(shí)驗(yàn)組加入合適體積的A-4(L),對(duì)照組加入等體積的BG11,每隔一定時(shí)間取樣測(cè)OD750。以侵染時(shí)間為橫坐標(biāo),OD750為縱坐標(biāo),繪制PCC 7120的OD750曲線。

1.5 PCC 7120光照適應(yīng)

Arhel-Goren等[19]研究發(fā)現(xiàn),PCC 7120具有生物鐘特征:12 h的光暗循環(huán)培養(yǎng)兩天后置于連續(xù)的光照條件下,PCC 7120仍能保持在光暗循環(huán)下的晝夜節(jié)律。為了探究PCC 7120的晝夜節(jié)律是否影響A-4(L)對(duì)其裂解,本研究將PCC 7120置于30℃,50 μmol/(m2·s)周期光照(L∶D=12 h∶12 h)下培養(yǎng)。按照給光時(shí)間將PCC 7120分為兩組,甲組7:00-19:00給光,乙組則19:00—7:00給光,培養(yǎng)14 d,使兩組藻分別適應(yīng)各自光暗周期的變化。14 d后早上7:00(為第0 h)甲、乙實(shí)驗(yàn)組開(kāi)始添加A-4(L)侵染(MOI為0.01)時(shí),甲組藻株處于光周期的狀態(tài),乙組藻株處于暗周期的狀態(tài),侵染時(shí)都給予連續(xù)光照。

1.6 不同光強(qiáng)下噬藻體吸附率測(cè)定

為了探究光照強(qiáng)度對(duì)于噬藻體吸附的影響,本研究在30℃條件下,設(shè)置光強(qiáng)分別為200、80、0 μmol/(m2·s),藻細(xì)胞密度為1.5×107cells/mL,藻細(xì)胞OD750為0.5左右,MOI為0.01,測(cè)定A-4(L)吸附率。取A-4(L)侵染藻細(xì)胞的樣品1 mL,10000 轉(zhuǎn)/min離心5 min,采用最大可能數(shù)法(Most Probable Number,MPN)測(cè)定上清液中未被吸附的A-4(L)效價(jià),從而間接地測(cè)定已被吸附的A-4(L),計(jì)算A-4(L)吸附率。將上清中待測(cè)A-4(L)按10倍梯度稀釋,然后將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且經(jīng)過(guò)新鮮BG11培養(yǎng)基重懸后的藻細(xì)胞接入無(wú)菌96孔板,每孔加150 μL。再加入不同的A-4(L)稀釋液50 μL,每個(gè)稀釋梯度接4個(gè)孔,空白組加入等量BG11培養(yǎng)基。將96孔板置于30℃,50 μmol/(m2·s)連續(xù)光照條件下培養(yǎng)2 d,記錄各稀釋度下的藻細(xì)胞侵染孔數(shù)。將出現(xiàn)侵染的稀釋梯度和平行樣品數(shù)作為數(shù)量指標(biāo),在最大或然數(shù)表上查出近似值,再乘數(shù)量指標(biāo)第一位數(shù)的稀釋倍數(shù),即為原始樣品中的噬藻體效價(jià)[20]:吸附率(%) =(1-上清中的A-4(L)效價(jià)÷A-4(L)的初始效價(jià))×100%。

1.7 qPCR測(cè)定A-4(L)DNA pol基因拷貝數(shù)

Lindell等[21]通過(guò)qPCR絕對(duì)定量的方法測(cè)定在原綠球藻MED4胞內(nèi)和胞外噬藻體P-SSP7 DNApol基因的拷貝數(shù),且qPCR絕對(duì)定量的方法與傳統(tǒng)的MPN法和電鏡法定量噬藻體有很強(qiáng)的正線性相關(guān)關(guān)系,可以準(zhǔn)確定量噬藻體。本研究以A-4(L) DNApol為目的基因,將其導(dǎo)入pET28H質(zhì)粒,構(gòu)建載體,繪制qPCR絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線,通過(guò)實(shí)時(shí)定量 PCR SYBR Green法來(lái)檢測(cè)A-4(L)DNApol拷貝數(shù)。PCC 7120胞內(nèi)和胞外的 A-4(L) DNApol基因拷貝數(shù),分別表征A-4(L)在胞內(nèi)的復(fù)制以及胞外的釋放。qPCR反應(yīng)總體系為10 μL,各體系體積為:SYBR Green Realtime PCR Master Mix 5 μL,正向、反向引物各0.25 μL,A-4(L) DNA 2 μL,最后用無(wú)菌水補(bǔ)齊至10 μL。qPCR上機(jī)程序?yàn)?95℃預(yù)變性3 min,隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán):95℃,20 s;60℃下退火30 s;72℃,30 s。該實(shí)驗(yàn)中,初始OD750為0.5左右的藻細(xì)胞中加入A-4(L)使MOI為0.01左右,整個(gè)侵染過(guò)程在30℃,光強(qiáng)為50 μmol/(m2·s)的全光照下進(jìn)行。采集的藻樣樣品立即進(jìn)行如下前處理:先經(jīng)8000 轉(zhuǎn)/min 離心5 min后,獲得上清待用于胞外A-4(L) DNA的提取,沉淀藻細(xì)胞先加入少量BG11培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)8000 轉(zhuǎn)/min,5 min離心棄上清。前處理完的樣品立即置于4℃冰箱,待樣品采集完沉淀藻細(xì)胞進(jìn)行以下處理:先經(jīng)過(guò)95℃加熱15 min,裂解藻細(xì)胞,再提取胞內(nèi)A-4(L) DNA。A-4(L) DNA提取使用TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0試劑盒,具體操作詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)。該實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示,表中所示引物除了用于線性化pET28H和單克隆的引物來(lái)自張承才老師實(shí)驗(yàn)室,其余引物均為本人針對(duì)A-4(L)所設(shè)計(jì),qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期長(zhǎng)度為200 bp。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.8 不同光照時(shí)長(zhǎng)的侵染

探究不同光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)于噬藻體A-4(L)裂解PCC 7120藻細(xì)胞的影響:在30℃,光強(qiáng)50 μmol/(m2·s)條件下,將培養(yǎng)箱光照設(shè)置為7:00-19:00給光(L∶D=12 h∶12 h),分別在一天中的早上7:00、中午12:00、下午15:00和晚上19:00 4組不同時(shí)間添加A-4(L),MOI為0.01左右,每隔一定時(shí)間測(cè)藻細(xì)胞OD750。

1.9 不同溫度的侵染

探究不同溫度對(duì)于噬藻體A-4(L)裂解PCC 7120藻細(xì)胞的影響:分別在15、20、25及30℃下添加A-4(L) 侵染PCC 7120,MOI為0.01左右,4組溫度下給予全光照,光強(qiáng)均為50 μmol/(m2·s),每隔一定時(shí)間測(cè)藻細(xì)胞OD750以及用噬藻斑法測(cè)定侵染第24 h胞外A-4(L)效價(jià)。

1.10 不同MOI的侵染

為了探究不同MOI對(duì)A-4(L)裂解藻細(xì)胞的影響,在30℃且光強(qiáng)為50 μmol/(m2·s)的全光照條件下,分別在PCC 7120中添加不同濃度的A-4(L)使MOI為1.13、1.13×10-2、1.13×10-4和1.13×10-6,實(shí)驗(yàn)藻細(xì)胞密度為1.8×107cells/mL左右,不同MOI下200 mL實(shí)驗(yàn)體系中A-4(L)濃度分別為107、105、103、10 PFU/mL左右,每隔一定時(shí)間測(cè)藻細(xì)胞OD750。對(duì)于MOI=1.13中的A-4(L)采用超濾離心法對(duì)其濃縮,選擇截留分子量為100 KD、Amicon Ultra-15離心超濾管,每個(gè)超濾管中加入15 mL新鮮A-4(L)裂解液,在4℃+3000 轉(zhuǎn)/min+10 min的條件下進(jìn)行離心。離心后收集截留在濾膜內(nèi)約500 μL濃縮 A-4(L)裂解液,再用噬藻斑法檢驗(yàn)其效價(jià),約為108～109PFU/mL。

1.11 室外侵染

室外侵染實(shí)驗(yàn)于2022年5月7-8日在日光光照條件下進(jìn)行,室外溫度為19～28℃,晴天。本研究從武漢東湖采集湖水,為了減少湖水中微生物、懸浮顆粒和浮游動(dòng)物對(duì)藻細(xì)胞的影響,將湖水經(jīng)過(guò)0.45 μm濾膜抽濾。BG11培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的PCC 7120經(jīng)5000 轉(zhuǎn)/min離心5 min后重懸到抽濾的湖水中用于室外侵染實(shí)驗(yàn)。1 L大燒杯中加500 mL藻液,設(shè)置三組平行。早上7:00添加A-4(L)使MOI為0.01左右,空白組添加等量BG11,每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定OD750。由于正午光照過(guò)強(qiáng)達(dá)到1500 μmol/(m2·s),故12:00-14:00 短暫轉(zhuǎn)移至陰涼處,使正午光強(qiáng)約為500 μmol/(m2·s)。

1.12 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)繪圖采用Origin 2018,數(shù)據(jù)分析采用IBM SPSS Statistics 25 One-way ANOVA(LSD)進(jìn)行方差分析和多重比較,P<0.05差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 光照對(duì)A-4(L)侵染的影響

全光照條件下且MOI=0.01時(shí),A-4(L)在8 h后裂解藻細(xì)胞(圖1A),但是黑暗條件下PCC 7120的OD750曲線與未加A-4(L)的對(duì)照曲線(圖1B)類(lèi)似,說(shuō)明幾乎沒(méi)有裂解發(fā)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明A-4(L)裂解藻細(xì)胞依賴光照,黑暗條件下A-4(L)無(wú)法裂解藻細(xì)胞。

圖1 不同光照條件下A-4(L)侵染PCC 7120的OD750曲線(A. 光照和黑暗下侵染藻株;B. 侵染不同晝夜節(jié)律下藻株)Fig.1 OD750 curves of PCC 7120 infected by A-4(L) under different light conditions(A. PCC 7120 infected in the light and dark; B. PCC 7120 with different circadian rhythms)

兩組顛倒光照時(shí)間培養(yǎng)14 d的PCC 7120在連續(xù)光照下被A-4(L)侵染(圖1B),第0 h開(kāi)始添加A-4(L)侵染時(shí),甲組藻株處于光周期的狀態(tài),乙組藻株處于暗周期的狀態(tài)。若A-4(L)對(duì)PCC 7120的裂解與PCC 7120的晝夜節(jié)律有關(guān),則甲組藻株OD750在早上7:00光照8 h后下降,而乙組藻株應(yīng)該在晚上19:00光照8 h后下降,但是兩組OD750均在給光8 h后開(kāi)始下降,說(shuō)明A-4(L)對(duì)PCC 7120的裂解不依賴PCC 7120的晝夜節(jié)律,而依賴光照。有文獻(xiàn)也指出,噬藻體AS-1對(duì)細(xì)長(zhǎng)聚球藻Synechococcuselongatus的侵染不受宿主晝夜節(jié)律的影響,而光照對(duì)AS-1侵染影響更大[22]。

2.1.1 光照強(qiáng)度對(duì)A-4(L)吸附的影響 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,5 min之后A-4(L)在光照條件下對(duì)PCC 7120的吸附率顯著高于黑暗下(P<0.05)(圖2),80 μmol/(m2·s)和200 μmol/(m2·s)光強(qiáng)下吸附率無(wú)顯著性差異(P>0.05)。無(wú)論光照還是黑暗條件下,噬藻體的吸附過(guò)程十分迅速。即使在黑暗條件下仍有超過(guò)50%的A-4(L)吸附到藻細(xì)胞上,表明A-4(L)對(duì)宿主細(xì)胞的吸附不依賴光照。

圖2 不同光強(qiáng)下A-4(L) 對(duì)PCC 7120的吸附率Fig.2 Adsorption ratios of A-4(L) to PCC 7120 under various intensities of light

2.1.2 光照有無(wú)對(duì)A-4(L)DNA的復(fù)制和子代A-4(L)釋放的影響 光照條件下A-4(L)在胞內(nèi)大量復(fù)制并釋放到胞外,而黑暗下只有極少量的復(fù)制(圖3A)。胞內(nèi)A-4(L)復(fù)制在光照8 h達(dá)到最大,DNApol拷貝數(shù)為1.1×107copies/mL,8 h后胞內(nèi)復(fù)制隨著大量的藻細(xì)胞被裂解而逐漸減少。A-4(L)侵染PCC 7120 (MOI=0.01)OD750在8 h 后顯著下降,可知A-4(L)在大量復(fù)制完成之后便開(kāi)始裂解藻細(xì)胞。對(duì)比胞內(nèi)和胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù),可以發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)DNApol拷貝數(shù)高于胞外。胞外A-4(L)釋放量在光照12 h最大(圖3B),DNApol拷貝數(shù)為2.6×106copies/mL,而第12 h黑暗下胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù)為2.1×105copies/mL,說(shuō)明光照下的胞外A-4(L)釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑暗下。胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù)在0～2 h內(nèi)由于A-4(L)吸附到藻細(xì)胞上而減少,在2 h后大幅度增加,可知A-4(L)的潛伏期為2 h左右,經(jīng)過(guò)潛伏期之后,A-4(L)開(kāi)始釋放到胞外。在2～12 h內(nèi),胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù)大幅度增加,表明此時(shí)A-4(L)的裂解期為10 h左右。但是A-4(L)侵染PCC 7120的OD750在8 h后才下降(圖1A),說(shuō)明在大幅度裂解藻細(xì)胞之前,A-4(L)已經(jīng)進(jìn)行胞外釋放了。因此A-4(L) DNApol拷貝數(shù)比藻細(xì)胞OD750能更準(zhǔn)確地了解侵染過(guò)程,估算A-4(L) DNA復(fù)制時(shí)間,潛伏期以及釋放量。

圖3 胞內(nèi)(A)和胞外(B)A-4(L) DNA pol基因拷貝數(shù)Fig.3 Intracellular (A) and extracellular (B) A-4(L) DNA pol gene copies

2.1.3 光照時(shí)長(zhǎng)對(duì)A-4(L)裂解的影響 A-4(L)在連續(xù)光照下8 h后就可裂解藻細(xì)胞(MOI為0.01),7:00(圖4A)和12:00(圖4B)添加A-4(L)的兩組均在8 h后藻細(xì)胞大量裂解。15:00(圖4C)一組由于只有4 h的光照時(shí)長(zhǎng),8 h時(shí)OD750沒(méi)有大幅度下降,而第二天白天給光后OD750才快速下降。19:00(圖4D)一組在黑暗下12 h藻細(xì)胞均未裂解,第二天白天給光后OD750才快速下降。由圖4C和4D結(jié)果對(duì)比可知,A-4(L)只經(jīng)過(guò)光照4 h無(wú)法正常裂解藻細(xì)胞,只有經(jīng)過(guò)6 h及以上的光照,A-4(L)才能裂解藻細(xì)胞。A-4(L)成功裂解PCC 7120所需光照時(shí)長(zhǎng)可能與侵染中某一關(guān)鍵進(jìn)程有關(guān),這一關(guān)鍵進(jìn)程是強(qiáng)烈依賴光照的,在光照下完成了這一過(guò)程后,則裂解宿主的剩余進(jìn)程可以在黑暗下發(fā)生(圖4B)。

圖4 不同光照時(shí)長(zhǎng)下A-4(L)侵染PCC 7120 OD750曲線(A. 7:00添加;B. 12:00添加;C. 15:00添加;D. 19:00添加; 陰影部分表示無(wú)光照)Fig.4 OD750 curves of PCC 7120 infected by A-4(L) during different light periods(Adding A-4(L) at 7:00(A), 12:00(B); 15:00(C) and 19:00(D); Shadows indicate dark)

2.2 溫度對(duì)A-4(L)侵染的影響

15℃時(shí),藻細(xì)胞28 h內(nèi)未見(jiàn)裂解;20℃時(shí),14 h后藻細(xì)胞裂解;在25℃和30℃時(shí),8 h后藻細(xì)胞即可被A-4(L)快速裂解(圖5A);表明溫度升高,A-4(L)裂解藻細(xì)胞時(shí)間明顯提前。在15～25℃溫度范圍內(nèi),隨著溫度的升高,A-4(L)裂解越快且胞外A-4(L)效價(jià)明顯提高(圖5B),且15℃和20℃下的胞外A-4(L)顯著低于25℃下的胞外A-4(L)(P<0.05)。而25℃和30℃條件下的侵染,藻細(xì)胞OD750變化以及第24 h胞外 A-4(L)效價(jià)沒(méi)有明顯區(qū)別。

圖5 溫度對(duì)A-4(L)侵染PCC 7120的影響(A: 不同溫度下A-4(L)侵染PCC 7120 OD750曲線; B: 不同溫度下胞外A-4(L)效價(jià)) Fig.5 Effect of temperature on infection of PCC 7120 by A-4(L)(A: OD750 curves of PCC 7120 infected by A-4(L) at different temperature; B: Extracellular A-4(L) titer at different temperature)

2.3 MOI對(duì)A-4(L)侵染的影響

當(dāng)MOI=1.13時(shí),A-4(L)侵染4 h后藻細(xì)胞開(kāi)始被裂解;當(dāng)MOI=1.13×10-2時(shí),藻細(xì)胞被大量裂解的啟動(dòng)時(shí)間被延后至第8 h;當(dāng)MOI=1.13×10-4時(shí),延后至第12 h后;當(dāng)MOI=1.13×10-6時(shí),持續(xù)延后至第16 h后。MOI提高兩個(gè)數(shù)量級(jí),藻細(xì)胞裂解則提前4 h。以A-4(L)侵染宿主24 h為限,當(dāng)MOI為1.13、1.13×10-2、1.13×10-4和1.13×10-6時(shí),宿主細(xì)胞的OD750分別下降了76%、59%、58%和41%(圖6)。表明MOI越大,噬藻體裂解宿主細(xì)胞越快。

圖6 不同MOI下A-4(L)侵染PCC 7120 OD750曲線Fig.6 OD750 curves for PCC 7120 infected by A-4(L) at different MOI

2.4 室外侵染驗(yàn)證

室外侵染驗(yàn)證結(jié)果如圖7所示,投加A-4(L)的實(shí)驗(yàn)組藻細(xì)胞密度在8 h后開(kāi)始迅速下降,細(xì)胞裂解,侵染28 h OD750下降至0.1。對(duì)照組中藻細(xì)胞密度在8 h后略有下降,后期保持穩(wěn)定(OD750約為0.45)。證明A-4(L) 在日光照射的湖水樣品中仍然可以高效裂解藻細(xì)胞。

圖7 抽濾的湖水中A-4(L)侵染PCC 7120 OD750曲線Fig.7 OD750 curve for PCC 7120 infected by A-4(L) in the filtered lake water

3 討論

3.1光照對(duì)侵染的影響

3.1.1 光照有無(wú) 根據(jù)全光照30℃條件下胞外A-4(L) DNApol基因的拷貝數(shù)在0～2 h內(nèi)下降,可知A-4(L)

的潛伏期為2 h左右,而牛曉瑩[15]發(fā)現(xiàn)噬藻體PP在29℃條件下的潛伏期為200 min左右,表明A-4(L)的潛伏期較短,可快速裂解藻細(xì)胞。根據(jù)圖3B以及OD750曲線結(jié)果,A-4(L)在大幅度裂解藻細(xì)胞之前已經(jīng)進(jìn)行胞外釋放了。因?yàn)镸OI為0.01左右,起始A-4(L)只能裂解約1%的極少量藻細(xì)胞并釋放子代A-4(L),同時(shí)未侵染的藻細(xì)胞可分裂產(chǎn)生新的細(xì)胞,所以此時(shí)藻細(xì)胞未被大量裂解,而隨著A-4(L)在胞內(nèi)復(fù)制的進(jìn)行達(dá)到頂峰后,這時(shí)藻細(xì)胞才能被大量的A-4(L)大幅度裂解。在連續(xù)光照且MOI=0.01條件下,A-4(L)在8 h后即可快速裂解PCC 7120藻細(xì)胞,而在黑暗條件下無(wú)法裂解。類(lèi)似地,噬藻體Pav-LD在光照條件下感染阿氏浮絲藻2天后便開(kāi)始裂解,而在黑暗條件下一周也未裂解[23]。噬藻體在黑暗下無(wú)法裂解藻細(xì)胞,是侵染的哪一過(guò)程依賴光照呢?本研究表明,A-4(L)的吸附不依賴光照,因?yàn)樵诤诎迪氯匀挥谐^(guò)50%吸附率。姜紅[24]在探究噬藻體PP感染野生宿主的增殖動(dòng)力學(xué)中,發(fā)現(xiàn)光照不是噬藻體吸附到宿主上的必要條件,這與本研究結(jié)論一致。而胞內(nèi)和胞外A-4(L) DNApol基因的拷貝數(shù)結(jié)果表明,黑暗抑制了胞內(nèi)A-4(L)復(fù)制,且在黑暗下胞外噬藻體釋放量遠(yuǎn)低于光照條件下,說(shuō)明胞內(nèi)A-4(L)復(fù)制和胞外釋放高度依賴光照。所以本研究表明黑暗條件下A-4(L)的復(fù)制以及子代A-4(L)的釋放受到抑制,導(dǎo)致其無(wú)法裂解藻細(xì)胞。Borbély等[25]發(fā)現(xiàn)在黑暗條件下絲狀藍(lán)藻的噬藻體復(fù)制增殖會(huì)完全停止,因?yàn)槭稍弩w復(fù)制需要宿主細(xì)胞的ATP[26],而ATP主要由宿主光合作用產(chǎn)生。通過(guò)比較胞內(nèi)和胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù),可以發(fā)現(xiàn)光照組的胞內(nèi)A-4(L) DNApol拷貝數(shù)高于胞外A-4(L) DNApol拷貝數(shù),主要原因在于,當(dāng)A-4(L)釋放到胞外后,會(huì)被吸附到未裂解的藻細(xì)胞上,導(dǎo)致胞外測(cè)定的A-4(L) DNApol拷貝數(shù)低于胞內(nèi)。

3.1.2 光照強(qiáng)度 Puxty等[27]發(fā)現(xiàn)聚球藻噬藻體S-PM2d在高光照條件(210 μmol /(m2·s))下的潛伏期比低光照條件(15 μmol/(m2·s))下縮短了5 h。光照強(qiáng)度不僅會(huì)影響噬藻體的潛伏周期,還會(huì)影響噬藻體吸附率和子代噬藻體釋放量。Kao等[22]在不同光強(qiáng)下測(cè)定了噬藻體AS-1子代釋放量,發(fā)現(xiàn)光照強(qiáng)度的增加導(dǎo)致子代AS-1釋放量的相應(yīng)增加;他還發(fā)現(xiàn)在光強(qiáng)為45 μmol/(m2·s)時(shí),侵染樣品上清中未被吸附的噬藻體效價(jià)比光強(qiáng)為3 μmol/(m2·s)要低4～6倍,說(shuō)明光強(qiáng)越高,噬藻體吸附率也越高。本研究中光強(qiáng)200 μmol/(m2·s)和80 μmol/(m2·s)時(shí)的噬藻體吸附率均顯著高于光強(qiáng)0 μmol/(m2·s),但是光強(qiáng)200 μmol/(m2·s)的吸附率并未比光強(qiáng)80 μmol/(m2·s)高,可能是80 μmol/(m2·s)的光強(qiáng)太高,該光強(qiáng)條件下,噬藻體的吸附率已經(jīng)達(dá)到最大。此外,本研究中吸附率是利用MPN法測(cè)定上清中未吸附的A-4(L)效價(jià),其中MPN法采用了4管平行,平行數(shù)較少,可能是導(dǎo)致圖2中有些誤差線較大的原因之一。

3.1.3 光照時(shí)長(zhǎng) A-4(L)在黑暗下連續(xù)24 h都無(wú)法裂解藻細(xì)胞,而在有光時(shí)連續(xù)光照7 h(MOI為0.01時(shí))便可在黑暗下裂解藻細(xì)胞(圖4B),說(shuō)明充足的光照對(duì)于噬藻體裂解藻細(xì)胞是必需的。噬藻體侵染需要充足的光照,我們推測(cè)是因?yàn)榍秩镜那捌谀骋贿^(guò)程需要光照的參與。A-4(L)吸附不需要光照,但是 DNA復(fù)制高度依賴光照。且光照條件下A-4(L) DNA復(fù)制在8 h達(dá)到頂峰,A-4(L)在給光7 h后可在黑暗下裂解藻細(xì)胞,表明依賴光照的大量復(fù)制完成后,A-4(L)可以在黑暗下裂解藻細(xì)胞。噬藻體AS-1侵染物光照培養(yǎng)0.5～1 h后移到黑暗下時(shí),AS-1無(wú)法產(chǎn)生正常的子代噬藻體,而在光照下培養(yǎng)3 h后移到黑暗下時(shí),AS-1能夠釋放大量的子代噬藻體[22],AS-1成功感染所需的光照時(shí)長(zhǎng)可能與感染時(shí)的具體過(guò)程有關(guān)[28-29]。這些結(jié)果均表明噬藻體需要充足的光照來(lái)助其完成某一侵染過(guò)程,一旦完成之后,剩余的裂解進(jìn)程就可以在黑暗下發(fā)生。少量A-4(L) DNA復(fù)制可在黑暗下進(jìn)行,可能是因?yàn)锳-4(L)可以借助藻細(xì)胞氧化磷酸化獲得的能量進(jìn)行復(fù)制[30]。然而相比于黑暗條件下的胞內(nèi)A-4(L) DNA復(fù)制,胞外A-4(L)釋放量極少,即少量復(fù)制完成的A-4(L)幾乎無(wú)法進(jìn)行胞外釋放,可能是 A-4(L)在黑暗條件下無(wú)法完成衣殼蛋白合成或衣殼蛋白與基因組包裝的過(guò)程。

3.2 溫度對(duì)侵染的影響

本研究表明,在15～25℃區(qū)間內(nèi),隨著溫度升高,A-4(L)的裂解時(shí)間提前,而25℃和30℃時(shí)A-4(L)裂解藻細(xì)胞的時(shí)間一致。牛曉瑩等[15]在探究CO2濃度和溫度升高對(duì)噬藻體 PP增殖的聯(lián)合作用時(shí),發(fā)現(xiàn)溫度升高大幅度提高了PP的裂解周期和子代PP釋放量。因?yàn)槭稍弩w依靠宿主細(xì)胞增殖,所以感染成功與否很大程度上取決于宿主細(xì)胞的生理狀態(tài)[31],即有利于宿主生長(zhǎng)的條件能促進(jìn)噬藻體的感染。本研究中,PCC 7120在25～30℃這個(gè)溫度區(qū)間生理狀態(tài)好,導(dǎo)致A-4(L)對(duì)其裂解速度快。但是牛曉瑩等[15]指出溫度升高對(duì)宿主的生長(zhǎng)沒(méi)有影響,但是仍能促進(jìn)PP的感染?？赡艿脑蚴?牛曉瑩設(shè)置的溫度為25℃和29℃,此時(shí)宿主已經(jīng)達(dá)到最佳的生理狀態(tài),所以從25℃升到29℃,宿主的生理狀態(tài)并不會(huì)改變。但是由于噬藻體的核衣殼由結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組成[32],溫度升高能夠增強(qiáng)宿主細(xì)胞內(nèi)某些酶的活性,提高病毒大分子合成與核衣殼裝配的效率[33],從而提高子代噬藻體釋放量。

3.3 MOI對(duì)侵染的影響

Tucker等[34]發(fā)現(xiàn)在Baroon湖泊中的噬藻體Ma-LBP的效價(jià)與銅綠微囊藻細(xì)胞去除率呈正相關(guān),添加的Ma-LBP效價(jià)越高,藻細(xì)胞生物量下降的越多。本研究中以A-4(L)侵染后24 h為限,當(dāng)MOI為1.13、1.13×10-2、1.13×10-4和1.13×10-6時(shí),藻細(xì)胞的OD750分別下降了76%、59%、58%和41%。即MOI越大,噬藻體裂解宿主細(xì)胞效果越好,且裂解時(shí)間提前。此外,Fuhrman等[35]估計(jì)每毫升宿主和噬藻體數(shù)量的乘積為1012時(shí),噬藻體才裂解藻細(xì)胞。本研究中,當(dāng)MOI為10-6時(shí),每毫升藻細(xì)胞和A-4(L)數(shù)量乘積在1010左右,但是A-4(L)仍可裂解藻細(xì)胞。同樣,Tucker等[34]在實(shí)驗(yàn)室探究噬藻體和銅綠微囊藻裂解感染時(shí),兩者數(shù)量乘積在1010～1014之間,藻細(xì)胞仍然可以裂解,推測(cè)是因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)室的藻細(xì)胞培養(yǎng)條件和噬藻體侵染條件適宜。

3.4 室外實(shí)驗(yàn)

光照對(duì)A-4(L)侵染影響的結(jié)果表明,噬藻體裂解藻細(xì)胞依賴光照且需要6 h及以上的光照時(shí)長(zhǎng),基于此,建議上午7:00-12:00投加噬藻體。溫度對(duì)A-4(L)侵染的影響研究中發(fā)現(xiàn),20℃時(shí)噬藻體光照14 h后才能大量裂解藻細(xì)胞,而25℃和30℃時(shí)噬藻體光照8 h(MOI為0.01)后便可大量裂解藻細(xì)胞,可知在環(huán)境溫度為25～30℃時(shí),噬藻體可以利用白天光照裂解藻細(xì)胞。針對(duì)噬藻體投放劑量問(wèn)題,綜合考慮成本以及充分利用白天光照完成裂解,建議投放劑量MOI為0.01。從室外驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可以看出,A-4(L)在日光照射的湖水樣品中可以高效裂解藻細(xì)胞。當(dāng)然,此室外驗(yàn)證使用的藍(lán)藻是室內(nèi)純培養(yǎng)模式株,針對(duì)野外不同種類(lèi)藍(lán)藻的控制還難以實(shí)現(xiàn)。姜紅等[36]以武漢東湖水體中存在的絲狀藍(lán)藻作為噬藻體PP的野生宿主時(shí),發(fā)現(xiàn)PP感染效率遠(yuǎn)低于其對(duì)室內(nèi)純培養(yǎng)鮑氏織線藻的效率。野外環(huán)境復(fù)雜,藍(lán)藻種類(lèi)繁多,分離更多的噬藻體將使其更好地應(yīng)用于藍(lán)藻水華的控制中。

4 結(jié)論

本研究探究光照、溫度和MOI對(duì)于A-4(L)侵染PCC 7120的影響,從而推定了應(yīng)用噬藻體裂解藻細(xì)胞的最佳投加時(shí)間和投加劑量。即在環(huán)境溫度為25～30℃時(shí),上午7:00-12:00投加噬藻體使MOI約為0.01,可在24 h內(nèi)將藻細(xì)胞裂解,且室外日光光照下的實(shí)驗(yàn)證明上述條件適用于在抽濾的湖水中高效裂解藻細(xì)胞,為噬藻體應(yīng)用于藍(lán)藻水華的控制提供一定的基礎(chǔ)。但是噬藻體應(yīng)用存在特異性較強(qiáng)、野生藻株與實(shí)驗(yàn)室馴化的藻株有很大差異、以及感染后出現(xiàn)抗性藻株等問(wèn)題,在將來(lái)的天然水體實(shí)際應(yīng)用中還需要進(jìn)一步的研究。