韓志陽 賈子苗 梁秋菊 王軻 唐華麗 葉興國 張雙喜

（1. 寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，銀川 750021；2. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；3. 寧夏農(nóng)林科學(xué)院農(nóng)作物研究所，銀川 750101；4. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

小麥?zhǔn)俏覈饕募Z食作物之一，種植面積僅次于玉米和水稻［1]。新中國成立以來，小麥生產(chǎn)取得了長足進(jìn)步，從1950年的660 kg/hm2到2012年的4487 kg/hm2，年均增產(chǎn)1.9%，總產(chǎn)量增加了6倍多［2]。但是由于過去對小麥產(chǎn)量的過度重視，導(dǎo)致目前小麥品質(zhì)改良的研究進(jìn)展相對緩慢。我國小麥品質(zhì)改良主要集中在中筋和中強(qiáng)筋品種培育，籽粒蛋白質(zhì)含量與歐美相當(dāng)，但蛋白質(zhì)品質(zhì)不理想，導(dǎo)致加工品質(zhì)較差［3-4]。另外，隨著灌溉農(nóng)業(yè)的發(fā)展以及化肥、農(nóng)藥的大量施用，小麥生產(chǎn)區(qū)土壤鹽漬化和土壤污染等問題頻發(fā)［5]，迫切需要培育高抗、優(yōu)質(zhì)的小麥新品種［6]。

長期以來，小麥的遺傳改良主要依賴于小麥種內(nèi)遺傳變異和優(yōu)良基因的隨機(jī)組合，可用基因資源的減少直接降低了小麥育種效率和突破性品種的持續(xù)培育［7]。將小麥近緣物種中蘊(yùn)含的優(yōu)良基因引入小麥，是突破當(dāng)下小麥育種瓶頸的重要措施。研究表明，黑麥屬［8]、山羊草屬［9]、簇毛麥屬［10]、偃麥草屬［11]為小麥銹病和白粉病提供重要抗病基因。除了抗病性之外，小麥野生資源在長期的生存和競爭過程中對各種非生物脅迫也表現(xiàn)出較強(qiáng)的適應(yīng)能力。黏果山羊草耐熱、抗旱和耐鹽性較強(qiáng)，粗山羊草耐極端寒冷的性能突出，冰草屬中的多數(shù)變種對干旱、寒冷和鹽堿環(huán)境具有適度的耐受性［12-13]。

在所有非生物脅迫中，鹽脅迫最為典型，對作物產(chǎn)量的影響最大。通過瞬間鹽脅迫和逐步鹽脅迫分別鑒定小麥-長穗偃麥草附加系和代換系耐鹽性，發(fā)現(xiàn)染色體3E、5E與瞬間鹽脅迫引起的耐受性相關(guān)，染色體3E、4E和5E則與逐步性鹽脅迫造成的耐受性相關(guān)［14]。單雷等［15]采用體細(xì)胞雜交的方式將小麥原生質(zhì)體與高冰草原生質(zhì)融合，培育了小麥體細(xì)胞雜交品種山融3號，該品種在鹽脅迫下產(chǎn)量比對照高22.58%。劉旭等［16]利用小麥與黑麥、延安賴草雜交，從回交后代中選育出小賴麥98-160、小黑麥98-113等6份強(qiáng)耐鹽材料。魏景芳等［17]對小麥與多枝賴草雜交后代進(jìn)行不同生育期耐鹽性鑒定，培育出耐鹽性較為突出的新品系L88。目前小麥的耐鹽基因資源還很缺乏，對小麥近緣植物中耐鹽性的挖掘和利用還不夠，需要對更多小麥與其近緣種屬遠(yuǎn)緣雜交中間材料進(jìn)行耐鹽性鑒定。

另外，山羊草屬籽粒中含有與胚乳硬度有關(guān)的蛋白質(zhì)，可以用于改良小麥的面包烘焙品質(zhì)；小黑麥籽粒蛋白質(zhì)含量高達(dá)20%，且Zn和Fe的含量較高［18-20]。硒和葉酸作為人體必須營養(yǎng)元素，與人類生命活動和健康息息相關(guān)，硒元素和葉酸缺乏會引起許多重大疾病的產(chǎn)生［21]。Fox等［22]和Hawkesford等［23]利用同位素對小麥、大蒜和魚類進(jìn)行硒元素標(biāo)記發(fā)現(xiàn)，硒在小麥、大蒜、魚類中的生物利用率分別為81%、78%和56%，因此小麥?zhǔn)翘岣呷梭w硒元素利用的最佳選擇。但我國富硒小麥研究起步較晚，小麥籽粒硒含量總體較低。據(jù)鑒定，河北省120個小麥品種平均硒含量為7.00 μg/100 g［24]，四川省62個小麥品種平均硒含量為3.50 μg/100 g［25]。Riaz等［26]對我國360個小麥品種葉酸含量進(jìn)行分析，認(rèn)為基因型和環(huán)境條件對葉酸的積累有顯著影響，建議根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r篩選葉酸含量較高的小麥品種作為育種親本。目前為止，還沒有對小麥與近緣種屬遠(yuǎn)緣雜交中間材料進(jìn)行硒元素和葉酸含量研究的報道。

簇毛麥作為栽培小麥的近緣物種，可以在惡劣潮濕的環(huán)境中生長，表現(xiàn)出植株長勢強(qiáng)、籽粒多、植株分蘗能力強(qiáng)等生長發(fā)育特點(diǎn)［27]，對條銹病、稈銹病、白粉病和條狀花葉病毒?。?8]均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性，還擁有耐鹽、耐寒、抗旱［29-30]等優(yōu)良性狀，是小麥改良的重要基因資源。迄今為止，國際上共收集了300多份不同來源的簇毛麥種質(zhì)資源，將多個簇毛麥優(yōu)良基因引入小麥遺傳背景中［31-32]，創(chuàng)制了高抗白粉病的小麥-簇毛麥6AL·6V#2S和6DL·6V#4S等易位系，培育了農(nóng)藝性狀優(yōu)良的揚(yáng)麥22、金禾1號、寧春66號等抗白粉病小麥新品種［33]，以及農(nóng)藝性狀優(yōu)良、高抗白粉病、再生能力和轉(zhuǎn)化能力強(qiáng)的Fielder改良系WT48和FL347等［34]，對小麥遺傳改良、產(chǎn)業(yè)發(fā)展、轉(zhuǎn)基因育種和功能基因組研究等具有重要作用。迄今為止，關(guān)于利用簇毛麥改良小麥的研究都集中在增強(qiáng)抗病性方面，很少涉及利用簇毛麥改良小麥抗鹽性和營養(yǎng)品質(zhì)。

本研究擬以實(shí)驗(yàn)室保存的2套小麥-簇毛麥附加系為材料，進(jìn)行苗期耐鹽性鑒定，以及籽粒中硒元素、葉酸含量分析，明確簇毛麥相關(guān)染色體是否攜帶與耐鹽、硒元素含量和葉酸含量有關(guān)的基因，為進(jìn)一步利用染色體工程和分子標(biāo)記技術(shù)將簇毛麥中含有的這些優(yōu)良基因?qū)胄←?，改良小麥耐鹽性及提高小麥籽粒葉酸和硒含量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥-簇毛麥#2二體附加系DA（1-7）V#2由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王秀娥教授提供，該套材料中的外源染色體來自簇毛麥#2；小麥-簇毛麥#3二體附加系DA（1-7）V#3為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉文軒教授提供，該套材料中的外源染色體來自簇毛麥#3。以上2套材料的遺傳背景均為中國春（CS）。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽鑒定 在超凈工作臺內(nèi)，將小麥成熟種子用70%乙醇滅菌15 min，25%次氯酸鈉滅菌25 min，無菌水清洗4-5次；加入適量無菌水，4℃過夜，用25%次氯酸鈉滅菌15 min，無菌水沖洗后剝?nèi)〕墒炫?，胚芽朝上，接種在含有NaCl的培養(yǎng)基（1/2 MS+20 g/L蔗糖+2.4 g/L植物凝膠+200 mmol/L NaCl，pH 6.0）上，每個材料接種10個成熟胚，重復(fù)3次，共30個成熟胚，置于培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗）中培養(yǎng)3 d；在光照下培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計鹽脅迫下各個小麥-簇毛麥附加系和對照材料的萌發(fā)率，30 d后統(tǒng)計幼苗存活率，測定成活幼苗的株高和根長。

1.2.2 硒含量測定 在裝有鋼球的離心管中放入2 g小麥成熟種子，在磨樣機(jī)充分上磨碎，每個材料取0.5 g粉末放入試管中，加入2 mL硝酸溶液，120℃消解30 min，加入去離子水至終體積為15 mL。采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定參試材料的硒含量，計算公式為：樣品硒含量（μg/g）=（C×V×F）/M，其中，C表示樣品濃度，V表示樣品定容體積，F(xiàn)表示樣品稀釋倍數(shù)，M表示樣品質(zhì)量。

1.2.3 葉酸提取和含量測定 每個小麥材料取20粒種子，研磨后，取50 mg粉末于1.5 mL離心管中，加入1 mL提取液（含NaH2PO418.96 mg、NaHPO4H2O 60.85 mg和抗壞血酸鈉0.5 g，混合過濾后加入200 μL β-巰基乙醇），混勻，先沸水浴10 min，再立即冰浴10 min。在遮光條件下加入大鼠血清30 μL，混勻后置于37℃烘箱中處理4 h，再次進(jìn)行沸水浴10 min，冰浴10 min。然后4℃ 13000 r/min離心10 min，取400 μL上清液于新離心管中，4℃ 13000 r/min離心20 min。最后取90 μL底液加入到測樣管中，再加入10 μL甲氨蝶呤（methotrexate），進(jìn)行葉酸含量測定。葉酸衍生物濃度依次記為C1、C2、C3...Cn，單位為ng/mL。樣品質(zhì)量為M，單位為mg，葉酸含量計算公式為：F=F［（C1+C2+C3+C4+ ...Cn）/M]×100，單位為μg/100 g。

2 結(jié)果

2.1 鹽脅迫對小麥-簇毛麥附加系成熟胚萌發(fā)率的影響

將2套小麥-簇毛麥附加系的成熟胚接種在含有NaCl的培養(yǎng)基上，生長10 d后，對不同材料的萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計（表1）。在鹽脅迫條件下，小麥-簇毛麥#2附加系成熟胚的萌發(fā)率為16.67%-43.33%，其中，DA5V#2的萌發(fā)率最高，其次是DA6V#2（33.33%），DA1V#2的萌發(fā)率最低，但小麥-簇毛麥#2附加系的萌發(fā)率均高于對照中國春（6.66%）；小麥-簇毛麥#3附加系的萌發(fā)率為26.67%-70.00%，其中，DA3V#3的萌發(fā)率最高，其次是DA7V#3（56.67%），DA5V#3最低（26.67%），均顯著高于中國春。相對而言，小麥-簇毛麥#2在鹽脅迫下的萌發(fā)率低于小麥-簇毛麥#3，小麥-簇毛麥#3附加系DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3的萌發(fā)率均在50.00%以上，表現(xiàn)出較好的苗期耐鹽性。

表1 小麥-簇毛麥附加系成熟胚在鹽脅迫下的萌發(fā)情況Table 1 Germination situation of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.2 鹽脅迫對小麥-簇毛麥附加系成熟胚幼苗生長狀況的影響

小麥-簇毛麥附加系成熟胚在含有NaCl的培養(yǎng)基上生長30 d后，測定各材料的存活株數(shù)、株高和根長。結(jié)果（表2）表明，2套小麥-簇毛麥附加系植株存活率均顯著高于對照中國春；小麥-簇毛麥#2二體附加系DA（1-7）V#2的平均株高為8.1-15.2 cm（表2，圖1-a），其中，DA4V#2的平均株高最高，DA4V#2、DA7V#2、DA3V#2和DA5V#2平均根長均大于對照中國春（8.6 cm）（表2和圖1-a）；小麥-簇毛麥#3二體附加系DA（1-7）V#3的平均株高為9.9-16.1 cm（表2和圖1-b），DA2V#3最大，DA5V#3最小，只有DA5V#3株高低于對照中國春（表2和圖1-b）；DA 2V#3平均根長最大，為3.4 cm。綜合2套小麥-簇毛麥附加系的鑒定結(jié)果，認(rèn)為DA2V#3、DA4V#2表現(xiàn)出較好的苗期耐鹽性，可以作為小麥耐鹽育種的潛在資源。

圖1 小麥-簇毛麥附加系在鹽脅迫下的生長狀況Fig. 1 Growing status of wheat-Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

表2 小麥-簇毛麥附加系在鹽脅迫下的生長情況Table 2 Growth status of mature embryos of wheat- Dasypyrum villosum additional lines under salt stress conditions

2.3 不同小麥-簇毛麥附加系籽粒硒含量測定分析

7個小麥-簇毛麥#3附加系中，DV2#3的籽粒硒含量為7.60 μg/100 g，高于對照（7.54 μg/100 g），其他6個附加系籽粒硒含量均低于對照，其中，DV7#3最低（6.35 μg/100 g）。小麥-簇毛麥#2附加系籽粒硒含量為6.29-8.47 μg/100 g（圖2-a），其中，DV3#2和DV2#2（8.23 μg/100 g）高于對照，DV4#2最低（6.29 μg/100 g）。結(jié)果表明，導(dǎo)入簇毛麥染色體后總體上引起小麥籽粒硒含量降低，但附加系DV2#2和DV2#3高于對照中國春，認(rèn)為簇毛麥2V染色體可能攜帶籽粒富含硒元素的相關(guān)基因。

圖2 小麥-簇毛麥附加系籽粒中硒含量的測定Fig. 2 Selenium content analysis in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

2.4 不同小麥-簇毛麥附加系籽粒葉酸含量測定分析

通過測量籽粒葉酸，小麥-簇毛麥附加系#2附加系中，DA6V#2籽粒葉酸含量最高，為26.10 μg/100 g，其次是DA4V#2（20.23 μg/100 g），均顯著高于對照中國春（10.98 μg/100 g）；DA7V#2葉酸含量為9.00 μg/100 g，低于中國春（圖3-a）。小麥-簇毛麥附加系#3附加系中，DA5V#3最高（16.08 μg/100 g），其次是DA1V#3（14.02 μg/100 g），均高于對照中國春（10.98 μg/100 g），DA3V#3最低（圖3-b）。與小麥-簇毛麥#2附加系相比，小麥-簇毛麥#3附加系葉酸含量變化范圍較小。差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，小麥-簇毛麥附加系DA4V#2、DA6V#2葉酸含量與對照中國春的差異達(dá)極顯著水平，DA3V#2、DA5V#2、DA5V#3與中國春的差異達(dá)顯著水平?？傊?，小麥-簇毛麥#3附加系籽粒中的葉酸含量低于小麥-簇毛麥#2附加系，DA6V#2附加系的葉酸含量最高，推測6V#2染色體可能攜帶促進(jìn)籽粒葉酸合成的相關(guān)基因。

圖3 小麥-簇毛麥附加系籽粒中葉酸含量測定結(jié)果Fig. 3 Folic acid content results in the grains of wheat-Dasypyrum villosun addition lines

3 討論

我國鹽堿地分布范圍廣泛，對小麥生產(chǎn)影響較大，需要篩選耐鹽性小麥種質(zhì)資源，培育耐鹽性強(qiáng)的小麥品種［35]。由于小麥的耐鹽性在成熟期鑒定需要很長時間，因此鑒定小麥耐鹽性的研究主要集中在芽期和苗期。趙旭等［36]對4個冬小麥品種進(jìn)行耐鹽性鑒定發(fā)現(xiàn)，小麥種子萌發(fā)的臨界鹽濃度為150-200 mmol/L。彭志等［37]、王萌萌等［38]分別對多個小麥品種進(jìn)行了室內(nèi)耐鹽性鑒定，篩選出一些萌發(fā)期耐鹽性較好的品種。本研究首次利用成熟胚離體培養(yǎng)對2套小麥-簇毛麥附加系材料進(jìn)行了萌發(fā)期和苗期耐鹽性鑒定，與其他鑒定方法相比，組織培養(yǎng)鑒定方式確保一致的環(huán)境條件。結(jié)果表明，在小麥的遺傳背景中引入簇毛麥染色體后，萌芽期對鹽脅迫的耐性增強(qiáng)，附加系萌發(fā)率均高于對照中國春，尤其DA5V#2、DA3V#3、DA7V#3和DA2V#3等附加系耐鹽能力較強(qiáng)，初步認(rèn)為簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體上可能存在耐鹽相關(guān)基因。

目前對籽粒中硒元素含量的研究和富硒小麥資源的鑒定較少。劉慧等［39]對655個小麥品種的硒元素含量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，平均含量為6.46 μg/100 g，春小麥和冬小麥平均硒含量分別為6.75和 6.42 μg/100 g，不同年份間春小麥和冬小麥差異較大。Lyons等［40]對同一小麥品種連續(xù)3年進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，不同年份硒元素含量不同，差異較為明顯，可能是因?yàn)樗?、土壤、光照等環(huán)境條件對小麥籽粒中硒元素含量有影響。此外發(fā)現(xiàn)，外源施用無機(jī)硒鹽也能引起小麥硒元素含量的變化［41]。迄今為止，我國依然缺乏富硒小麥品種，需要從小麥近緣種屬中挖掘富硒基因資源，促進(jìn)富硒小麥品種培育。本研究對14個小麥-簇毛麥附加系分別進(jìn)行籽粒硒含量測定發(fā)現(xiàn)，附加系DA2V#2、DA2V#3和DA1V#2籽粒中硒含量顯著高于對照中國春，推測簇毛麥2V染色體可能攜帶與籽粒硒元素積累的相關(guān)基因。

小麥籽粒中葉酸含量主要受到基因型的影響。Riaz等［26]對360個小麥品種籽粒中的葉酸含量進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，冬小麥和春小麥葉酸含量具有差異，平均含量分別為36.08和43.98 μg/100 g，并且篩選出幾個葉酸含量較高的小麥基因型。小麥籽粒中葉酸含量還受到其他因素的影響，其中，貯藏和加工對小麥籽粒葉酸含量的影響較大。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因中心小麥實(shí)驗(yàn)室詳細(xì)研究了小麥籽粒和面粉儲藏不同時間，以及面粉不同加工方式（包括面包、饅頭、面條）對葉酸含量的影響。結(jié)果表明，存貯2個月時面粉中的葉酸含量即出現(xiàn)下降，存貯6個月時葉酸損失率平均為28%；葉酸在籽粒中較為穩(wěn)定，存貯4個月時葉酸含量開始出現(xiàn)下降，存貯6個月時葉酸損失率平均為17%；存貯8個月時面粉和籽粒中葉酸含量均顯著下降，分別為30%和26%；在煮后面條、蒸后饅頭和烘焙后面包中葉酸含量分別為1.93-2.29 μg/100 g FW（鮮重）、12.53-19.80和30.01-45.92 μg/100 g FW，分別為面粉中葉酸含量的22%、158%和391%。認(rèn)為饅頭和面包可優(yōu)先作為葉酸攝入來源，其葉酸含量比面粉中提高了1.5-4.0倍。小麥貯藏和加工雖然導(dǎo)致一定程度的葉酸損失，但仍然有較多的葉酸存在，沒有導(dǎo)致存在葉酸的降解［42]。另外，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以提高小麥籽粒中的葉酸含量。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將大豆、番茄中的葉酸合成相關(guān)基因GmGCHI、GmADCS和LeADCS轉(zhuǎn)入小麥，轉(zhuǎn)基因小麥籽粒中的葉酸含量比野生型對照提高了2.3-5.6倍［43]。本研究發(fā)現(xiàn)，小麥-簇毛麥附加系6V#2籽粒中葉酸含量的增加最為明顯，認(rèn)為簇毛麥6V#2染色體上可能攜帶影響葉酸合成的相關(guān)基因。

本研究鑒定到簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體可能攜帶耐鹽相關(guān)基因，2V染色體可能攜帶與籽粒硒元素積累的相關(guān)基因，6V#2染色體可能攜帶籽粒葉酸合成的相關(guān)基因。簇毛麥在全世界有300多種，因?yàn)樗鼈兤鹪吹牡乩憝h(huán)境和生態(tài)環(huán)境的不同，不同來源的簇毛麥在基因組成上存在著多樣性和遺傳歧化。如對小麥白粉病的抗性，并不是所有簇毛麥都具有抗病基因，其中，簇毛麥#2和#4抗白粉病，簇毛麥#5就不抗白粉病。所以，簇毛麥#2和#3在耐鹽及硒和葉酸含量等遺傳控制面也會存在差異［44-45]。本研究鑒定的可能與改良小麥耐鹽及籽粒硒和葉酸含量相關(guān)的簇毛麥染色體以附加系形式存在于小麥遺傳背景中，難以直接用于小麥育種和生產(chǎn)，需要進(jìn)一步培育攜帶目標(biāo)基因染色體的代換系和染色體片段的易位系。染色體特異的分子標(biāo)記可以加速小麥-簇毛麥染色體代換系和易位系的選育。Li等［45]利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)開發(fā)了全套鑒定簇毛麥不同染色體臂的特異分子標(biāo)記，并選育了部分小麥-簇毛麥染色體代換系和易位系，為下一步將簇毛麥不同染色體上攜帶的耐鹽、籽粒硒元素積累和葉酸合成的相關(guān)基因以易位系方式導(dǎo)入小麥奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

附加系DA5V#2、DA3V#3和DA2V#3在鹽脅迫下萌發(fā)、存活和生長狀況較好，DA2V#3和DA2V#2平均硒含量較高，DA6V#2平均葉酸含量較高。簇毛麥5V#2、3V#3和2V#3染色體可能存在耐鹽相關(guān)基因，簇毛麥2V染色體可能存在籽粒富硒相關(guān)基因，6V#2染色體可能攜帶籽粒葉酸合成的相關(guān)基因。