石佳鑫 劉凱 朱金潔 祁顯濤 謝傳曉 劉昌林

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京 100081；2. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米研究所，成都 611130）

玉米（Zea mays L.）是遍布世界的重要農(nóng)作物之一。我國(guó)的玉米種植面積大，產(chǎn)量占比超過(guò)糧食總產(chǎn)量的40%，對(duì)保障我國(guó)的糧食安全至關(guān)重要［1]。作為天然的C4植物，玉米具有更高的光合潛力［2]。如何更好地發(fā)揮玉米的光合潛力，提高玉米產(chǎn)量是當(dāng)下研究的熱點(diǎn)之一。國(guó)內(nèi)外研究表明，密植能夠通過(guò)改善玉米群體冠層結(jié)構(gòu)，協(xié)調(diào)單株與群體關(guān)系而有效地增加玉米單位面積的產(chǎn)量［3-5]。玉米群體的種植密度能否增加，受限于玉米株型結(jié)構(gòu)分布是否理想［6]，超過(guò)適宜密度的栽培措施會(huì)造成玉米倒伏、空桿和禿尖增長(zhǎng)等負(fù)面性狀出現(xiàn)［7-8]，最終影響產(chǎn)量。因此創(chuàng)制株型結(jié)構(gòu)分布合理的“理想株型”玉米，能夠通過(guò)增加栽培密度的上限實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)。玉米的“理想株型”表現(xiàn)為上部葉片緊湊、節(jié)間長(zhǎng)，且穗上平均葉面積指數(shù)較大等［6]。從個(gè)體來(lái)看，葉夾角小且緊湊的“理想株型”玉米，由于整株能夠更加均勻的接受光照，在高水平的光合光子通量密度下，其截獲輻照度的利用效率更高［9]；從群體來(lái)看，“理想株型”玉米能通過(guò)優(yōu)化單株光合效率、穗三葉的葉向值與有效光合面積等方面提高光能利用率而促進(jìn)干物質(zhì)積累和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終提高產(chǎn)量［10-11]。為創(chuàng)制“理想株型”玉米，可通過(guò)雜交育種的方式對(duì)玉米雙親選擇和組配。玉米株型相關(guān)性狀的研究表明，在不同背景的雜交組合中，雜交種的葉夾角與雙親的葉夾角顯著正相關(guān)［12]。選擇葉夾角適當(dāng)?shù)挠H本能夠通過(guò)雜種優(yōu)勢(shì)創(chuàng)制株型和產(chǎn)量?jī)?yōu)于雙親的F1植株。例如在油菜中，Li等［13]利用生長(zhǎng)素信號(hào)基因BnaA3.IAA7配制雜合型突變體，獲得株型改良的雜交種，實(shí)現(xiàn)油菜的密植增產(chǎn)。傳統(tǒng)方法通過(guò)回交改良雜種親本，這一過(guò)程在導(dǎo)入目標(biāo)位點(diǎn)時(shí)，因?yàn)檫B鎖累贅引入非目標(biāo)性狀［14]。為解決這一難題，基因編輯技術(shù)精確地靶向目的基因能夠打破基因連鎖，創(chuàng)制基因精確編輯的突變材料，這種策略被稱為DTM（desire targeted mutation）策略［15]。通過(guò)這種策略突變?nèi)~夾角大小調(diào)控基因，精確的改變玉米株型在理論上是可能的。在葉夾角的眾多調(diào)控基因中，ZmLG1（Zm00001d002005）可能通過(guò)參與葉發(fā)育早期葉片-葉鞘邊界線的形成，影響葉耳和葉舌的發(fā)育［16]調(diào)控葉夾角的大小。研究發(fā)現(xiàn)天然的Zmlg1隱性突變體表現(xiàn)為葉耳和葉舌的缺失，致使植株葉夾角減小。該基因的調(diào)控模式，先后在玉米［17]、水稻［18]、小麥［19]、大麥［20]等作物中被發(fā)現(xiàn)，說(shuō)明LG1基因在作物中的功能具有保守性。對(duì)不同物種LG1結(jié)構(gòu)域的研究表明，該基因涉及的調(diào)控通路可能僅影響葉夾角和抗逆響應(yīng)，而不參與到花期等其他性狀的調(diào)控過(guò)程［21]，對(duì)葉夾角無(wú)關(guān)性狀影響較小。因此選取ZmLG1基因作為靶標(biāo)，更傾向于獲得精準(zhǔn)減小葉夾角的植株。考慮到玉米Zmlg1純合突變有影響散粉的潛在風(fēng)險(xiǎn)［22]，本研究編輯Zmlg1獲得Zmlg1純合基因型的母本，再與相應(yīng)的父本雜交獲得ZmLG1Zmlg1型的雜交種。通過(guò)觀察分析，選擇抗性較好且無(wú)明顯缺陷的中單88母本自交系CX1為改良對(duì)象。本研究以改良母本CX1為設(shè)計(jì)出發(fā)點(diǎn)開展了相關(guān)實(shí)驗(yàn)。將ZmLG1編輯為Zmlg1的CX1命名為CX1-lg1，評(píng)估了其制種效率，并配制基因型為ZmLG1Zmlg1的改良雜交種中單88M開展多環(huán)境下增密栽培試驗(yàn)，評(píng)估了Zmlg1基因的應(yīng)用價(jià)值，也對(duì)基因編輯技術(shù)在雜交育種中的應(yīng)用進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 材料

本次試驗(yàn)所用編輯誘導(dǎo)材料CF13-1［15]由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所玉米基因編輯育種創(chuàng)新研究組提供，以改良材料中單88M和其母本CX1-lg1為試驗(yàn)材料，未改良中單88和其母本CX1為對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 改良母本CX1-lg1和中單88M的創(chuàng)制 分析親本自交系CX1的ZmLG1序列，挑選符合CRISPR/Cas9系統(tǒng)的sgRNA序列，構(gòu)建編輯載體遺傳轉(zhuǎn)化，獲得ZmLG1的編輯誘導(dǎo)材料CF13-1［15]。將CX1與CF13-1雜交，對(duì)F1進(jìn)行Cas9元件的PCR檢測(cè)，所用引物為Cas9JC-F（5'-AGCTGGTTGTAGGTCTGCAC-3'）和Cas9JC-R（5'-TTCAAGGTGCTGGGCAAC-3'）。挑選編輯元件陽(yáng)性個(gè)體，用于回交。以后每一代以此方法挑選Cas9元件陽(yáng)性材料作為回交中間材料，作為父本，CX1為母本回交四代，獲得BC4F1代材料。對(duì)BC4F1個(gè)體以相同的方式檢測(cè)，挑選編輯元件陰性個(gè)體自交獲得BC4F2，從中挑選到完全無(wú)葉舌葉耳個(gè)體3株，Sanger測(cè)序檢測(cè)ZmLG1靶點(diǎn)突變情況，所用引物為L(zhǎng)G1-F（5'-GCGTGGGAAGATGATGAACC-3'）和LG1-R（5'-GTACGTGTAGCCTCCTCTGG-3'）。3株材料均為同一類型編輯事件。我們將這一材料命名為CX1-lg1，對(duì)其擴(kuò)繁并與CX2組配，獲得改良的雜交種F1，命名為中單88M。

1.2.2 田間管理 播種前撒施底肥復(fù)合肥（N∶P∶K=18∶12∶10），用量600 kg/hm2。翻耕整地后采用雙粒播種，確保出苗。株距為16-24 cm，行距為50 cm（順義、通遼、南口）或60 cm（海南）。播種后次日進(jìn)行鎮(zhèn)壓、灌溉；播種后3-4 d采用乙草胺作為封閉除草劑，每公頃用量2-2.5 kg。播種兩周后統(tǒng)計(jì)出苗情況，對(duì)缺苗穴位補(bǔ)苗。玉米4-6葉期降苗，每穴留壯苗一株。苗期根據(jù)天氣情況適當(dāng)澆水，拔節(jié)后期到抽穗期注意保證充足水分。根據(jù)實(shí)際情況噴施除草劑或殺蟲劑。拔節(jié)期追肥一次，采用高氮磷復(fù)合肥，用量為基肥的1/3。R6期以小區(qū)為單位收獲。

1.2.3 制種試驗(yàn)設(shè)計(jì) 2020年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院海南南繁生物育種試驗(yàn)基地開展制種試驗(yàn)。試驗(yàn)采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，設(shè)置株距為24 cm，行距為50 cm，4 m為一行。制種行配比為母本∶父本=4∶1，5行為一組，每6個(gè)組為單個(gè)小區(qū)重復(fù)，共設(shè)計(jì)兩個(gè)小區(qū)重復(fù)。其中，CX1（母本）與CX2（父本）組配獲得雜交種中單88，CX1-lg1（母本）與CX2（父本）組配獲得雜交種中單88M。田間管理增加母本人工去雄的操作，在拔節(jié)末期和抽穗前期進(jìn)行。

1.2.4 改良雜交種密度試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，以改良雜交種中單88M為材料，中單88為對(duì)照，安排5000、6000、7000株/667 m23個(gè)密度水平，每個(gè)小區(qū)為4 m×48 m，兩組重復(fù)。2021年在通遼試驗(yàn)基地和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所順義試驗(yàn)基地，2022年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院南口中試基地，3個(gè)環(huán)境條件下開展試驗(yàn)。

1.2.5 表型測(cè)定 株高和穗位高用塔尺（量程0-300 cm，精確度1 cm）直接測(cè)量。葉夾角表型測(cè)量穗上葉夾角、穗位葉夾角、穗下葉夾角。其中，穗上葉夾角和穗下葉夾角是穗上和穗下三片葉的均值。通過(guò)測(cè)量葉片基部20 cm處葉中脈和莖稈距離（量程0.0-50.0 cm，精確度0.1 cm）的間接法換算為角度值。

穗數(shù)以小區(qū)為統(tǒng)計(jì)單元，計(jì)有效穗（籽粒數(shù)＞30粒）個(gè)數(shù)。含水量通過(guò)KETT牌谷物水分測(cè)量?jī)x（型號(hào)PM8188A），測(cè)量3次取平均值，記為小區(qū)籽粒含水量。收獲量為小區(qū)收獲所有穗重，用電子秤稱重（量程0.00-120.00 kg，精確度0.05 kg）。出籽率為小區(qū)脫粒前與脫粒后重量的比值，產(chǎn)量為小區(qū)以14%標(biāo)準(zhǔn)含水量折算每667 m2產(chǎn)量。禿尖長(zhǎng)用游標(biāo)卡尺（量程0.0-180.0 mm，精確度0.1 mm）測(cè)量。穗行數(shù)直接計(jì)數(shù)，行粒數(shù)每穗隨機(jī)統(tǒng)計(jì)3行，取平均數(shù)。

1.2.6 數(shù)據(jù)與圖形處理 通過(guò)IBMSPSS25對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)和雙因素方差分析，用R語(yǔ)言繪制統(tǒng)計(jì)圖。

2 結(jié)果

2.1 改良母本CX1-lg1基因序列與表型分析

改良母本CX1-lg1具有明顯的緊湊表型（圖1-A）。靶點(diǎn)測(cè)序結(jié)果顯示CX1-lg1為純合“GTAG”四堿基缺失編輯類型（圖1-B）。對(duì)葉夾角進(jìn)行觀測(cè)，CX1-lg1穗上（圖1-C）、穗下（圖1-D）葉夾角平均值分別為4.78°和11.73°，CX1穗上、穗下葉夾角平均值分別為15.84°和27.79°。統(tǒng)計(jì)分析表明CX1-lg1穗上（圖1-E）、穗下（圖1-F）葉夾角比CX1均極顯著的減小。

圖1 CX1 和 CX1-lg1基因型與株型Fig. 1 Plant and genotype of CX1 and CX1-lg1

2.2 改良母本CX1-lg1制種效率評(píng)估

為了進(jìn)一步驗(yàn)證株型的改良是否影響雜交制種的效率，我們?cè)?000株/667 m2的密度條件下對(duì)CX1-lg1制種情況進(jìn)行評(píng)估（圖2-A、B）。結(jié)果表明改良母本CX1-lg1的小區(qū)平均有效穗數(shù)和折算平均產(chǎn)量分別為355穗和425.93 kg，CX1的平均有效穗數(shù)和折算平均產(chǎn)量為321.5穗和407.05 kg。與CX1相比，CX1-lg1具有更多有效穗（圖2-C）和更高產(chǎn)量（圖2-D）。

圖2 改良母本的雜交制種產(chǎn)量Fig. 2 Seed production yield of improved maternal parent

2.3 改良雜交種中單88M不同密度的株型表現(xiàn)

我們分別對(duì)南口、順義、通遼3個(gè)環(huán)境中，不同密度水平下的雜交種進(jìn)行株型觀測(cè)發(fā)現(xiàn)，中單88M在這3個(gè)環(huán)境下都表現(xiàn)出更緊湊的株型（圖3-A）。在南口5000、6000、7000株/667 m2水平下，中單88M穗上葉夾角平均值分別是21.35°、20.27°、20.98°，穗下葉夾角平均值分別是25.60°、25.63°、24.00°；對(duì)照中單88在5000、6000、7000株/667 m2三個(gè)密度水平下，穗上葉夾角平均值分別是26.39°、27.64°、27.13°，穗下葉夾角平均值分別是30.20°、30.47°、30.33°。在相應(yīng)密度水平下，中單88M穗上和穗下葉夾角均比中單88極顯著減小。順義和通遼兩個(gè)環(huán)境中情況類似，在不同栽培密度下，中單88M穗上（圖3-B）和穗下（圖3-C）葉夾角均小于中單88。

圖3 改良母本使改良雜交種中單88M株型緊湊Fig. 3 Improved maternal parent grants a compact plant type for hybrid Zhongdan88M

2.4 改良雜交種中單88M不同密度下的產(chǎn)量表現(xiàn)

我們測(cè)量了南口、順義、通遼3個(gè)環(huán)境條件下不同密度水平的雜交種產(chǎn)量（圖4-A）。結(jié)果表明，在南口5000、6000、7000株/667 m2三個(gè)密度水平下，中單88M的平均折算畝產(chǎn)依次是592.10 kg、659.10 kg、689.10 kg，中單88的折算畝產(chǎn)依次是598.80 kg、704.60 kg、649.10 kg，中單88M在7000株/667 m2密度下增產(chǎn)（圖4-B）。在順義5000、6000、7000株/667 m2三個(gè)密度水平下，中單88M的平均折算畝產(chǎn)依次是689.80 kg、709.80 kg、787.50 kg，中單88的折算畝產(chǎn)依次是671.20 kg、696.70 kg、715.50 kg，前者在7000株/667 m2密度下增產(chǎn)最多（圖4-B）。在通遼5000、6000、7000株/667 m2三個(gè)密度水平下，中單88M的平均折算畝產(chǎn)依次是781.50 kg、896.40 kg、790.10 kg，中單88的折算畝產(chǎn)依次是852.00 kg、853.00 kg、710.30 kg，前者在6000和7000株/667 m2密度下有增產(chǎn)效應(yīng)（圖4-B）。

圖4 改良雜交種中單88M在增密栽培條件下產(chǎn)量增加Fig. 4 Improved hybrid Zhongdan88M grants an increased yield in dense-planting cultivation

2.5 株型和產(chǎn)量受密度、材料、環(huán)境及互作效應(yīng)影響

對(duì)雜交種密度試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析，結(jié)果表明：（1）在葉夾角方面，穗上葉夾角、穗位葉夾角和穗下葉夾角在不同環(huán)境、材料之間F值均達(dá)到顯著水平，說(shuō)明葉夾角的大小受到環(huán)境和材料的影響。而在不同密度下，穗上葉夾角有極顯著差異，穗位葉夾角有顯著差異，穗下無(wú)顯著差異，說(shuō)明葉夾角不同層次受密度影響的情況不同，表現(xiàn)出從冠層到底層受到密度的影響逐漸減小。此外穗上葉夾角和穗下葉夾角在環(huán)境和材料互作下F值達(dá)到極顯著水平，穗位葉夾角達(dá)到顯著水平（表1）。方差分析表明，中單88M穗上葉夾角受環(huán)境影響較??；穗下葉夾角受環(huán)境材料互作影響較大。密度和材料的互作效應(yīng)，僅影響穗上葉夾角的大?。ū?），中單88M受到密度材料互作效應(yīng)較小。（2）在產(chǎn)量方面，環(huán)境影響禿尖長(zhǎng)、收獲量、出籽率、有效穗數(shù)和產(chǎn)量等性狀，且均達(dá)到極顯著水平；密度極顯著影響禿尖長(zhǎng)、有效穗數(shù)，顯著影響收獲量；環(huán)境和材料互作效應(yīng)極顯著影響禿尖長(zhǎng)和有效穗數(shù)（表2）。兩種材料受環(huán)境材料互作效應(yīng)影響不同：中單88M禿尖長(zhǎng)、收獲量、出籽率受環(huán)境材料互作效應(yīng)影響比中單88大，有效穗數(shù)和產(chǎn)量比中單88受影響小；密度材料互作效應(yīng)顯著影響禿尖長(zhǎng)（表2），中單88M受該互作效應(yīng)影響較小。

表1 株型相關(guān)性狀方差分析 F 統(tǒng)計(jì)量Table 1 F statistic analysis of variance for plant type related traits

表2 產(chǎn)量相關(guān)性狀方差分析 F 統(tǒng)計(jì)量Table 2 F statistic analysis of variance for yield related traits

3 討論

3.1 編輯ZmLG1基因?qū)X1株型與制種效率的影響

ZmLG1基因減小玉米葉夾角的作用是明確和顯著的［17]，并且通過(guò)基因編輯技術(shù)編輯不同作物的LG1均有類似的表型［18-20]。借助于DTM策略，通過(guò)雜交的方式將基因編輯元件導(dǎo)入目標(biāo)自交系是可以發(fā)揮功能的［15]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，我們獲得的改良材料CX1-lg1比CX1具有更小的上部和下部葉夾角，株型更緊湊。并且CX1-lg1在5000株/667 m2的密度下，有更高的制種產(chǎn)量。

3.2 改良雜交種中單88M株型和產(chǎn)量的表現(xiàn)

前人研究證明，對(duì)親本特定性狀的改良能夠通過(guò)遺傳在雜種一代表現(xiàn)［23]。為此我們通過(guò)改良母本獲得了ZmLG1Zmlg1的改良雜交種中單88M。在不同環(huán)境不同密度下，中單88M穗上與穗下葉夾角與對(duì)照中單88相比均顯著的減小，表現(xiàn)為緊湊的株型。3個(gè)環(huán)境中，在7000株/667 m2的密度水平下，中單88M與對(duì)照中單88相比有更高的產(chǎn)量，在較低密度水平下，并沒有明顯變化規(guī)律。因此株型改良的雜交種比原先更適應(yīng)密植栽培。

3.3 基因編輯結(jié)合雜交育種技術(shù)改良雜交種株型

綜合來(lái)看，改良雜交種中單88M和其改良母本中單88M-lg1在株型上具有相似表現(xiàn)，其遺傳規(guī)律符合前人對(duì)葉夾角遺傳規(guī)律的解析［12,24]。我們的實(shí)驗(yàn)證明通過(guò)基因編輯精確的調(diào)控目標(biāo)性狀是可行的。結(jié)合傳統(tǒng)的雜交育種，通過(guò)對(duì)親本目標(biāo)性狀的改良，能夠提升雜交種的表現(xiàn)，使其更好地發(fā)揮雜種優(yōu)勢(shì)。由于株型改良對(duì)作物增產(chǎn)的正向貢獻(xiàn)［6]，未來(lái)創(chuàng)制理想株型的雜交種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。我們?cè)诟牧既~夾角的過(guò)程中，對(duì)非目標(biāo)性狀倒伏也產(chǎn)生了影響，可能由于LG1基因參與調(diào)控的未知通路受到影響，改變了雜種中相關(guān)通路的相互作用，需要進(jìn)一步研究。隨著株高、葉夾角、根系、花序等株型形成相關(guān)基因的克隆和更具體的功能解析，借助于精確的基因編輯工具，我們可以編輯基因編碼序列或調(diào)控元件的特定堿基，更精確地改變蛋白序列或更精細(xì)的調(diào)控表達(dá)，實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的表型調(diào)控。

4 結(jié)論

通過(guò)基因編輯技術(shù)結(jié)合DTM策略成功改良了雜交種母本株型，提升其制種效率；并創(chuàng)制了株型緊湊的雜交種中單88M，不同栽培密度和試驗(yàn)環(huán)境與材料互作，但兩種材料不同性狀受材料密度和材料環(huán)境的兩種互作效應(yīng)影響的大小不同。綜合比較認(rèn)為，通過(guò)母本改良獲得的雜交種中單88M能在高密度（7000株/667 m2）下實(shí)現(xiàn)增產(chǎn)。