王麗,趙子龍,劉振*,毛相朝,3

1(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,青島市食品生物技術(shù)重點實驗室,山東 青島,266404) 2(中國輕工業(yè)水產(chǎn)品生物加工重點實驗室,山東 青島,266404) 3(青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室,海洋藥物與生物制品功能實驗室,山東 青島,266237)

酶,是一種極為高效的特殊催化劑,其化學(xué)本質(zhì)是具有催化活性的蛋白質(zhì)或核酸[1-2]。由于酶的基因在長達(dá)數(shù)萬年的進(jìn)化過程中不斷地復(fù)制與突變,因此出現(xiàn)了諸多同源酶[3],大部分的同源酶氨基酸序列相似度較高,但催化的反應(yīng)可能不同。在類胡蘿卜素合成過程中,將番茄紅素環(huán)化生成β-胡蘿卜素的番茄紅素β-環(huán)化酶(lycopene β-cyclase,LCYB)[4],和將紫黃質(zhì)環(huán)化為新黃質(zhì)的新黃質(zhì)合酶(neoxanthin synthase,NSY)[5]序列高度相似,但是功能不盡相同。在普遍認(rèn)為的原生質(zhì)體祖先——藍(lán)藻中僅含有LCYB,且這兩種酶發(fā)揮活性還均結(jié)合有相同的輔酶和相似的活性中心[6-8],因此有研究認(rèn)為NSY和LCYB存在進(jìn)化關(guān)系,屬于同源酶[4-5,9-10]。但對導(dǎo)致LCYB和NSY功能差異的原因,此前從未有報道。因此本研究旨在探究LCYB和NSY對番茄紅素環(huán)化功能差異的原因。LCYB是生成β-胡蘿卜素的關(guān)鍵酶之一,在代謝通路中處于上游,對LCYB的研究較多,已經(jīng)鑒定識別的不同來源的LCYB超過500個。LIU等[11]通過大腸桿菌異源表達(dá)證明來自寧夏枸杞的番茄紅素β-環(huán)化酶(LyLCYB)可以將番茄紅素催化生成β-胡蘿卜素。相較于LCYB,關(guān)于下游類胡蘿卜素合成途徑中將紫黃質(zhì)催化生成新黃質(zhì)的NSY研究較少[12],被鑒定識別的NSY遠(yuǎn)不如LCYB多。BOUVIER等[9]從番茄中克隆了大小為56 kDa的新黃質(zhì)合酶(SoNSY),SoNSY和LyLCYB氨基酸序列相似性高達(dá)88.2%,且實驗證明其不具備催化番茄紅素的能力。

LCYB和NSY的底物均是對光、熱等敏感的具有抗氧化性的類胡蘿卜素[13],實現(xiàn)催化作用還需要有輔酶FAD和NADPH的參與[8],相較于在體內(nèi)構(gòu)建酶的表達(dá)系統(tǒng),體外表達(dá)需要考慮底物的快速氧化以及輔酶的添加,更為困難且具有不穩(wěn)定性,故構(gòu)建體內(nèi)類胡蘿卜素代謝通路是理想的研究手段。因此本研究選擇了枸杞來源的LyLCYB和番茄來源的SoNSY作為研究對象,全基因合成LyLCYB基因lyLCYB和SoNSY基因soNSY,通過構(gòu)建嵌合體和點突變的方式將改造后的基因在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達(dá),HPLC分析工程菌株發(fā)酵后的產(chǎn)物,以此發(fā)掘?qū)е翷yLCYB和SoNSY中番茄紅素環(huán)化功能差異的關(guān)鍵氨基酸位點。

1 材料與方法

1.1 試劑材料

lyLCYB、soNSY、crtE、crtB、crtI由華大基因全基因合成;高保真DNA聚合酶試劑Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶試劑2×TaqMaster Mix (Dye Plus)、重組克隆試劑ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit購于諾唯贊生物公司;PCR回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒購于天根生化科技公司;SSCS感受態(tài)細(xì)胞制備液購于上海捷瑞生物公司;番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)品、β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品、IPTG、酵母粉、蛋白胨、瓊脂粉、氨芐青霉素、卡那霉素均購于索萊寶科技公司。其他試劑未作特殊說明均為國藥化學(xué)試劑分析純。PCR引物由青島擎科公司提供。

1.2 培養(yǎng)基配方

LB液體培養(yǎng)基:稱取1.0 g胰蛋白胨,0.5 g酵母提取物,1.0 g氯化鈉,溶于100.0 mL純水中,115 ℃滅菌30 min[若需配制LB固體培養(yǎng)基,則在此基礎(chǔ)上添加1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉]。

氨芐青霉素溶液:稱取0.1 g的氨芐青霉素粉末放置于1.5 mL的離心管中,用1.0 mL的超純水溶解,在超凈臺中過孔徑0.22 μm的水相濾膜,放于-20 ℃冰箱備用,且添加量為0.1%(體積分?jǐn)?shù))。

100.0 mg/mL卡那霉素溶液:方法同上[稱取1.0 g 卡那霉素粉末,添加量為0.05%(體積分?jǐn)?shù))]。

1.3 生物信息學(xué)分析

利用如下生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及軟件分析序列,目標(biāo)序列的基因查找網(wǎng)址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/;蛋白質(zhì)序列轉(zhuǎn)運肽預(yù)測網(wǎng)址[14]:http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/;判定目的蛋白是否具有膜結(jié)合域網(wǎng)站:http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析網(wǎng)站:http://smart.embl-heidelberg.de/;實驗過程中用到蛋白質(zhì)序列分析軟件:Jalview(氨基酸序列比對)[15]、SnapGene(質(zhì)粒構(gòu)建)。

1.4 構(gòu)建嵌合體雙質(zhì)粒菌株

目的片段的擴(kuò)增以及質(zhì)粒載體構(gòu)建選用了高保真酶,并使用同源重組的方法使得各片段連接處留有15～20 bp同源序列。各種不同嵌合體構(gòu)建的方式是將soNSY基因的部分片段替換為lyLCYB基因?qū)?yīng)位置的片段。本實驗室將crtE、crtB、crtI基因搭載到氨芐青霉素抗性的pTrc99a載體上構(gòu)建了產(chǎn)番茄紅素質(zhì)粒[16];lyLCYB、soNSY及嵌合體基因搭載到以卡那霉素為抗性的pTac15K載體上用以探究原酶和重組酶的活性。構(gòu)建質(zhì)粒所需引物如表1所示,利用重組克隆試劑進(jìn)行重組連接,將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌(Escherichiacoli)TreliefTM5α感受態(tài)中,涂布至對應(yīng)抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃ 過夜培養(yǎng)約12 h后挑菌測序,并將測序結(jié)果正確的菌株接種至LB試管中培養(yǎng)6～8 h,OD600≈0.6時,用快速質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒備用。

將提取的pTrc99a-crtEBI質(zhì)粒利用水浴法轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)中,37 ℃過夜培養(yǎng)后,挑取單菌落,經(jīng)過PCR驗證正確后,接種到LB試管中,添加氨芐青霉素抗性過夜培養(yǎng),取1.0 mL 接種到含有氨芐青霉素抗性的50.0 mL LB錐形瓶培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至OD600值為0.5～0.6左右,利用SSCS感受態(tài)細(xì)胞制備液,制備產(chǎn)番茄紅素的感受態(tài)細(xì)胞,隨后再次利用水浴法將第二個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到自制的產(chǎn)番茄紅素感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于氨芐青霉素和卡那霉素雙抗性的LB固體平板,過夜培養(yǎng),挑取單菌落,PCR驗證,最終構(gòu)建好的菌株如表2所示。

表2 實驗所需菌株

1.5 發(fā)酵培養(yǎng)嵌合體雙質(zhì)粒菌株

將所需發(fā)酵菌株按照1%的添加量接種到裝液量為33%(體積分?jǐn)?shù))的含有相應(yīng)抗性的LB試管培養(yǎng)基中,在37 ℃,200 r/min搖床培養(yǎng)3～4 h,至菌體OD600≈0.6時,按照0.1%(體積分?jǐn)?shù))的添加量加入100 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)菌株高效表達(dá)蛋白,隨后37 ℃,200 r/min搖床繼續(xù)培養(yǎng)10～12 h后終止發(fā)酵,檢測產(chǎn)物。

1.6 HPLC分析

建立完備的檢測方法有助于分析發(fā)酵產(chǎn)物的組成和目標(biāo)產(chǎn)物的含量,雙質(zhì)粒工程菌株發(fā)酵完成后,依次經(jīng)過預(yù)處理和HPLC對產(chǎn)物進(jìn)行分析,具體操作如下:

a)制備發(fā)酵樣品:取發(fā)酵完成的菌液2.0 mL至2.0 mL離心管中,12,000 r/min離心3 min,重復(fù)操作1次,在離心管中富集到4.0 mL菌液的菌體,移液槍吸取500.0 μL色譜級丙酮[17]至離心管中,用滅菌后的牙簽混合均勻,并到渦旋儀上渦旋5 min,后放置于37 ℃水浴鍋中,靜置20 min,將樣品盡可能多的萃取到溶劑丙酮中。隨后12,000 r/min離心5 min,將上清液過孔徑0.22 μm的尼龍濾膜后取200 μL到含有內(nèi)襯管的液相小瓶中,做好標(biāo)記,等待檢測。

b)HPLC檢測:HPLC以液體為流動相,采用高壓輸液系統(tǒng),將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱,在柱內(nèi)各成分被分離后,進(jìn)入檢測器進(jìn)行檢測,從而實現(xiàn)對試樣的分析。本實驗中利用YMC Carotenoid(C-30)[17-19]類胡蘿卜素分析色譜柱對樣品進(jìn)行分析檢測,吸光度476 nm,總流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量20 μL,柱溫35 ℃,流動相為色譜級甲醇和甲基叔丁基醚,采用二元高壓梯度洗脫25 min,具體的洗脫方法如表3所示。

表3 HPLC檢測產(chǎn)物方法

2 結(jié)果與分析

2.1 LyLCYB和SoNSY番茄紅素β-環(huán)化功能驗證

全合成lyLCYB和soNSY基因后,通過基因重組技術(shù)構(gòu)建了質(zhì)粒pTac15K-LyLCYB和pTac15K-SoNSY,且在產(chǎn)番茄紅素的E.coliBL21(DE3)中進(jìn)行了異源表達(dá),經(jīng)過發(fā)酵,如圖1所示,在含有l(wèi)yLCYB基因的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到了β-胡蘿卜素,而含有soNSY基因的菌種發(fā)酵產(chǎn)物中,僅發(fā)現(xiàn)番茄紅素,沒有產(chǎn)生β-胡蘿卜素,由此判斷,LyLCYB可以使番茄紅素環(huán)化成β-胡蘿卜素,而SoNSY不可以。

圖1 LyLCYB和SoNSY番茄紅素β-環(huán)化功能分析結(jié)果

2.2 LyLCYB和SoNSY的結(jié)構(gòu)域劃分

因本研究要在大腸桿菌中實現(xiàn)異源表達(dá),大腸桿菌屬原核生物,缺少膜狀細(xì)胞器無法結(jié)合具有膜結(jié)合域的酶,因此難以使具有膜結(jié)合域的蛋白質(zhì)產(chǎn)生酶活力[20-21]。而本研究所選的研究對象LyLCYB和SoNSY來源于具有膜狀細(xì)胞器的真核高等植物,可能具有膜結(jié)合域,故首先對LyLCYB和SoNSY進(jìn)行了膜結(jié)合域分析。預(yù)測的結(jié)果如圖2-a所示,二者都不具備膜結(jié)合域。這對LyLCYB和SoNSY的大腸桿菌異源表達(dá)是十分有利的。

a-TMHMM-2.0預(yù)測LyLCYB和SoNSY的膜結(jié)合域;b-SMART預(yù)測LyLCYB和SoNSY結(jié)構(gòu)域;c-敲除cTP的QlyLCYB基因番茄紅素β-環(huán)化功能分析

接下來對含有498個氨基酸的LyLCYB和SoNSY序列進(jìn)行了結(jié)構(gòu)域劃分。如圖2-b所示,通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)兩個序列都含有自E2到C51的葉綠體轉(zhuǎn)運肽(chloroplast transport peptide, cTP);且Q81-P114肽段均為兩基因的FAD結(jié)合區(qū)域(FAD_binding domain);LyLCYB和SoNSY都包含兩個環(huán)化保守基序(279～301Cyclase motif Ⅰ和353～367Cyclase motif Ⅱ)和蛋白N端非保守區(qū)域(477～498 NB)。考慮到cTP主要起引導(dǎo)作用,在真核生物中cTP完成轉(zhuǎn)運職責(zé)后會被切除[22],因此真正發(fā)揮活性的天然酶中并不具備cTP,而原核生物體內(nèi)不具備切除葉綠體轉(zhuǎn)運肽功能的此類肽酶,因此我們敲除了lyLCYB基因中編碼cTP的部分,構(gòu)建了編碼QLyLCYB的QlyLCYB突變基因(圖2-b)。如圖2-c所示,敲除cTP后,QlyLCYB仍舊具備番茄紅素β-環(huán)化活性。且基于HPLC結(jié)果,含有基因QlyLCYB的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中,β-胡蘿卜素產(chǎn)物的峰面積高于含有l(wèi)yLCYB基因,因此相較于原基因,敲除cTP的QlyLCYB基因環(huán)化能力提高。這可能是由于cTP在大腸桿菌中會阻礙酶發(fā)揮功能,所以去除了cTP以后,QLyLCYB對番茄紅素的環(huán)化能力提高。因此本研究后續(xù)的實驗均在敲除掉cTP的基因上進(jìn)行。

2.3 影響番茄紅素環(huán)化功能關(guān)鍵氨基酸的發(fā)掘

如圖3-a所示,對LyLCYB和SoNSY進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)除cTP外,LyLCYB和SoNSY共有59個差異氨基酸位點。因此,本研究采用構(gòu)建嵌合體的方式,將QSoNSY序列的部分肽段替換為對應(yīng)的QLyLCYB氨基酸序列,分區(qū)域判斷關(guān)鍵氨基酸位點所在的位置,逐步縮小范圍。構(gòu)建了如圖3-b所示的4個嵌合體質(zhì)粒,分別是pTac15K-QLyLCYBa、pTac15K-QLyLCYBb、pTac15K-QLyLCYBc、pTac15K-QLyLCYBd,將這4個嵌合體質(zhì)粒導(dǎo)入產(chǎn)番茄紅素的E.coliBL21(DE3)中,經(jīng)過發(fā)酵分析后,在含有pTac15K-QLyLCYBa、pTac15K-QLyLCYBb、pTac15K-QLyLCYBd這3個質(zhì)粒的菌株中均檢測到了番茄紅素和β-胡蘿卜素,而含有pTac15K-QLyLCYBc質(zhì)粒的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中,僅發(fā)現(xiàn)了番茄紅素(圖3-c)。上述實驗結(jié)果表明,導(dǎo)致QLyLCYB和QSoNSY對番茄紅素環(huán)化差異的關(guān)鍵氨基酸位點在pTac15K-QLyLCYBd質(zhì)粒替換的這一部分上,將這部分肽段命名為CL(N120～K277)。

a-LyLCYB和SoNSY序列比對結(jié)果;b-嵌合體構(gòu)建示意圖;c-含嵌合體基因菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC結(jié)果

在CL肽段內(nèi)QLyLCYB和QSoNSY共有19個差異氨基酸位點,因此為了進(jìn)一步縮小影響環(huán)化功能的關(guān)鍵氨基酸范圍,又將CL肽段進(jìn)行了分段替換,分別構(gòu)建了pTac15K-QLyLCYB-FH、pTac15K-QLyLCYB-MID、pTac15K-QLyLCYB-TSH這3個質(zhì)粒(圖4-a),將這3個質(zhì)粒進(jìn)行了轉(zhuǎn)化發(fā)酵分析后,如圖4-b所示,含有這3個質(zhì)粒的菌株中,僅含有pTac15K-QLyLCYB-FH質(zhì)粒的菌株發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到了β-胡蘿卜素,其他2個在發(fā)酵產(chǎn)物中沒有發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素。依據(jù)上述的實驗結(jié)果,將含有關(guān)鍵氨基酸的肽段范圍縮小至FH處,即影響番茄紅素環(huán)化功能的關(guān)鍵氨基酸在209～279。然而在FH肽段內(nèi)仍舊有10個差異氨基酸位點(圖4-c),因此后續(xù)采用定點突變的策略對這10個差異位點的功能進(jìn)行探究。

a-嵌合體構(gòu)建示意圖;b-含嵌合體基因菌株發(fā)酵產(chǎn)物HPLC結(jié)果;c-FH片段中10個差異氨基酸位點分布

2.4 關(guān)鍵氨基酸位點219的發(fā)掘

為了進(jìn)一步確定差異的氨基酸位點,將QSoNSY和QLyLCYB在FH區(qū)域中的10個差異氨基酸位點209、210、219、223、229、230、241、243、256和276進(jìn)行突變構(gòu)建點突變蛋白,即將QSoNSY上的差異位點突變QLyLCYB的對應(yīng)位置的氨基酸,隨后將改造后的基因轉(zhuǎn)化到產(chǎn)番茄紅素的大腸桿菌中,經(jīng)過HPLC檢測發(fā)酵產(chǎn)物,如圖5所示,在含有soNSY-D219G基因的菌株中,檢測到了β-胡蘿卜素,這表明改造后的soNSY-D219G基因具備了番茄紅素β-環(huán)化功能。而剩余9個突變位點的發(fā)酵產(chǎn)物均只檢測到了番茄紅素,并未發(fā)現(xiàn)β-胡蘿卜素,這表明這9個突變體蛋白仍不具備環(huán)化番茄紅素的能力。在此基礎(chǔ)上,突變了LyLCYB的219位點,構(gòu)建了pTac15K-LyLCYB-G219D質(zhì)粒,在轉(zhuǎn)化分析后發(fā)現(xiàn)其失去了番茄紅素的環(huán)化功能,在發(fā)酵產(chǎn)物中僅檢測到了番茄紅素(圖5)。上述實驗結(jié)果表明,219位點是導(dǎo)致LyLCYB和SoNSY對番茄紅素環(huán)化功能差異的關(guān)鍵氨基酸位點。

圖5 基因QlyLCYB-G219D和QsoNSY-G219D番茄紅素β-環(huán)化活性分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過在E.coliBL21(DE3)中構(gòu)建類胡蘿卜素的異源表達(dá)系統(tǒng),利用嵌合體和定點突變的方式探究類胡蘿卜素合成酶LyLCYB和SoNSY中影響番茄紅素環(huán)化功能的氨基酸位點,并且將關(guān)鍵氨基酸位點的范圍鎖定到FH(209～279)肽段范圍內(nèi),為進(jìn)一步探究兩個基因的差異位點將FH區(qū)域中LyLCYB和SoNSY的10個差異位點進(jìn)行點突變,最終發(fā)現(xiàn)了含有突變體SoNSY-D219G的菌株具備了環(huán)化番茄紅素的能力,而含有突變體LyLCYB-G219D的菌株環(huán)化功能消失,這表明219位點是影響LyLCYB和SoNSY番茄紅素環(huán)化功能差異的關(guān)鍵位點。本研究為繼續(xù)探究LyLCYB和SoNSY紫黃質(zhì)催化功能差異提供了理論基礎(chǔ),同時也為LyLCYB和SoNSY酶作用機制的研究提供參考。