崔利娜 姜得悅 辛雅萍

（鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 河南鄭州 450014）

妊娠期糖尿病（Gestational Diabetes Mellitus,GDM）作為妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，也是威脅母嬰生命安全的常見原因之一，易導(dǎo)致孕婦早產(chǎn)、畸形，甚至流產(chǎn)、難產(chǎn)。近年來GDM 發(fā)病率呈上升趨勢，給家庭和社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。然而，除了一些研究表明妊娠期胰島素抵抗可能引發(fā)GDM 外，其發(fā)病機(jī)制仍未明確，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為胰島素抵抗在GDM 的發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[1～2]。微小核糖核酸（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼RNA，在自然界廣泛存在于真核生物中。作為一類非編碼微小RNA，miRNA 轉(zhuǎn)錄后其水平與許多疾病的病理生理過程密切相關(guān)。近些年，多項研究均發(fā)現(xiàn)，miRNA 與多種代謝性疾病如肥胖、多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS）及糖尿病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[3～5]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 是胰島素抵抗中必不可少的生物調(diào)節(jié)因子之一，許多miRNA已被證明是GDM 的有效診斷標(biāo)志物。有研究表明miR-330-3p 在GDM 中表達(dá)上調(diào)，并與患者的胰島素抵抗有關(guān)，也有其他研究進(jìn)一步探討了miRNA在GDM 中的作用。還有學(xué)者發(fā)現(xiàn)miR-494 可保護(hù)胰島β 細(xì)胞功能，通過靶向磷酸酶基因（PTEN）調(diào)控GDM，miR-409-5p 已被證明在多種腫瘤中作為癌基因發(fā)揮作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-409-5p 在乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，抑制其表達(dá)可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長，也表明miR-409-5p 與糖尿病的發(fā)生有關(guān)。同時有研究證實miR-122 能夠在肝臟中高水平表達(dá)[6]，而肝臟又是糖脂代謝的核心，也是胰島素抵抗的關(guān)鍵位置。目前臨床已經(jīng)有關(guān)于miR-122 與胰島素抵抗的報道，但尚存爭議。本研究旨在探討miR-122 表達(dá)水平、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）與妊娠糖尿病及妊娠結(jié)局的關(guān)系，并分析miR-122 表達(dá)水平與HOMA-IR 的相關(guān)性?，F(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年4 月至2020 年10 月在我院診治的孕24～32 周GDM 孕婦52 例作為觀察組，另選取同期在我院產(chǎn)檢且口服葡萄糖耐量試驗（Oral Glucose Tolerance Test,OGTT）正常的孕24～32 周孕婦45 例作為對照組。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批（倫理號：2018012）。見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

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1.2 入組標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 符合《妊娠合并糖尿病診治指南（2014）》中GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，妊娠24～28 周行75 g OGTT 檢查，空腹、口服葡萄糖后1 h、口服葡萄糖后2 h 的血糖閾值分別為5.1 mmol/L、10.0 mmol/L、8.5 mmol/L，任何一個時間點血糖值達(dá)到或超過上述閾值即診斷為GDM；年齡20～36 歲；孕24～35 周；單胎妊娠；自然受孕；簽署知情同意書。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 妊娠前既有糖尿病者；入組前接受降糖藥物治療者；接受藥物治療或輔助生殖技術(shù)（ART）后妊娠者；同時合并有妊娠高血壓疾病、妊娠合并心臟病、先兆子癇等妊娠合并癥者；雙胎或多胎妊娠者；PCOS 者；合并有血液系統(tǒng)疾病、全身感染性疾病、自身免疫性疾病及內(nèi)分泌系統(tǒng)其他疾病者；入組前2 周內(nèi)有糖皮質(zhì)激素使用史者；肝、腎等重要臟器功能不全者。

1.3 測定方法

1.3.1 糖代謝及HOMA-IR 測定 治療前，抽取患者靜脈血約5 ml，其中2 ml 離心分離血清，采用全自動生化分析儀（美國Beckman Coulter 公司，型號：AU5800）檢測血清空腹血糖（Fasting Blood Glucos,FBG）、空腹血漿胰島素（Insulin, INS） 水平，HOMA-IR=FBG×INS/22.5。

1.3.2 miR-122 表達(dá)水平測定[8]血清miR-122：剩余3 ml 血液樣本進(jìn)行核糖核酸（RNA）提取和純化，所有操作按照miRcute miR-NA 提取分離試劑盒說明進(jìn)行；胎盤組織中miR-122：分娩后將胎盤迅速用生理鹽水反復(fù)沖洗干凈，切除適當(dāng)大小的胎盤組織塊（約4 mm×4 mm×4 mm）經(jīng)液氮速凍處理，冰箱-80℃保存，使用RNAiso Plus 試劑提取胎盤組織中總RNA。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物序列見表2。采用實時熒光定量PCR 儀檢測miR-122表達(dá)水平，內(nèi)容如下，反應(yīng)體系：cDNA 4 μl，上、下游引物（10 μmol/L）各0.4 μl，SYBR Green Master Mix 10 μl，50×ROX Reference Dye 20.4 μl，H2O 4.8 μl。反應(yīng)條件：95℃5 min，95℃30 s，94℃30 s，60℃20 s，共40 個循環(huán)。將每個cDNA 平均檢測3 次，取平均值得循環(huán)閾值。采用2-△△CT法分析miR-122 的相對表達(dá)水平。

表2 引物序列

1.4 臨床干預(yù)方案及控制標(biāo)準(zhǔn) 所有患者進(jìn)行飲食、運動等干預(yù)，必要時給予胰島素進(jìn)行降血糖治療。定期在院產(chǎn)前門診進(jìn)行產(chǎn)前檢查及隨訪，門診進(jìn)行降低血糖相關(guān)干預(yù)，指導(dǎo)患者每天監(jiān)測血糖水平，連續(xù)進(jìn)行3 d 的血糖檢測，空腹血糖（FBG）水平＜5.6mmol/L、餐后2 h 血糖＜6.7 mmol/L、糖化血紅蛋白（HbA1c）≤6.5%，為患者血糖控制有效。

1.5 觀察指標(biāo) （1）比較兩組糖代謝指標(biāo)水平、HOMA-IR 及血清和胎盤中miR-122 水平；（2）比較結(jié)局良好組和不良結(jié)局組上述指標(biāo)；（3） 分析miR-122 水平與HOMA-IR 的相關(guān)性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0 統(tǒng)計學(xué)軟件分析處理數(shù)據(jù)，計量資料以（±s）表示，組間比較采用獨立t檢驗；miR-122 水平與HOMA-IR 的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組糖代謝指標(biāo)及HOMA-IR 比較 觀察組FBG、INS 水平及HOMA-IR 均高于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組糖代謝指標(biāo)及HOMA-IR 比較（±s）

表3 兩組糖代謝指標(biāo)及HOMA-IR 比較（±s）

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2.2 兩組血清及胎盤miR-122 水平比較 觀察組血清及胎盤miR-122 水平均高于對照組（P＜0.05）。見表4、圖1 和圖2。

圖1 兩組患者血清miR-122 表達(dá)水平

圖2 兩組患者胎盤miR-122 表達(dá)水平

表4 兩組血清及胎盤miR-122 水平比較（±s）

表4 兩組血清及胎盤miR-122 水平比較（±s）

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2.3 不同妊娠結(jié)局GDM 患者miR-122 水平及HOMA-IR 比較 根據(jù)GDM 患者妊娠結(jié)局，將52例GDM 患者分為結(jié)局良好組34 例和不良結(jié)局組18 例，若出現(xiàn)流產(chǎn)、早產(chǎn)、巨大兒、死胎、死產(chǎn)、胎兒畸形、新生兒呼吸窘迫綜合征及新生兒死亡等任一情況均歸為不良結(jié)局組。結(jié)果顯示，不良結(jié)局組HOMA-IR 及血清和胎盤miR-122 水平均高于結(jié)局良好組（P＜0.05）。見表5。

表5 不同妊娠結(jié)局GDM 患者miR-122 水平及HOMA-IR 比較（±s）

表5 不同妊娠結(jié)局GDM 患者miR-122 水平及HOMA-IR 比較（±s）

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2.4 miR-122 水平與HOMA-IR 的相關(guān)性 經(jīng)Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，GDM 患者血清及胎盤miR-122 水平均與HOMA-IR 呈正相關(guān)（P＜0.05）。見表6。

表6 miR-122 水平與HOMA-IR 的相關(guān)性

3 討論

GDM 被認(rèn)為是妊娠期嚴(yán)重的糖耐量異常。近年來，越來越多的產(chǎn)婦被診斷為GDM，已成為常見的公共衛(wèi)生問題。對于許多患者來說，診治不及時必然會給母體和胎兒帶來嚴(yán)重的不良影響。多項研究[9～11]均認(rèn)為，GDM 的發(fā)生與妊娠后胰島β 細(xì)胞分泌胰島素功能相對不足及胰島素抵抗有關(guān)。妊娠后孕婦通常會進(jìn)補(bǔ)大量的營養(yǎng)物質(zhì)，超過母嬰需求后，就會造成體內(nèi)糖脂代謝出現(xiàn)異常，正常情況下可通過增加胰島素分泌來分解多余的葡萄糖，但若胰島β 細(xì)胞分泌胰島素功能下降或伴有胰島素抵抗時，則可導(dǎo)致糖代謝異常，進(jìn)而誘發(fā)GDM 的發(fā)生[12]。本研究結(jié)果顯示，觀察組FBG、INS 水平及HOMA-IR 均高于對照組，提示GDM 患者機(jī)體糖代謝紊亂，胰島素分泌減少，HOMA-IR 增加，有研究指出產(chǎn)生這種變化的原因或許與糖代謝的靶器官對胰島素的敏感性下降有關(guān)[13]。

miRNA 屬于非編碼單鏈RNA，與靶基因mRNA3'端的非編碼區(qū)結(jié)合后可調(diào)控基因的表達(dá)，與多種代謝性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，多項研究均顯示，miRNAs 在包括糖尿病在內(nèi)的許多疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[14～16]。miRNA 也可由胎盤分泌，進(jìn)入機(jī)體血液循環(huán)后，通過調(diào)控糖脂代謝過程參與胰島素抵抗及GDM 等的發(fā)生[17]。王雪梅等的一項研究發(fā)現(xiàn)，miR-200a 及miR-34a 在GDM患者體內(nèi)呈高水平表達(dá)，并指出其或許是通過調(diào)控胰島素相關(guān)調(diào)控基因的表達(dá)來引起血糖變化，進(jìn)而導(dǎo)致GDM 的發(fā)生[18]。張婧怡等研究發(fā)現(xiàn)，miR-101在GDM 患者胎盤中表達(dá)水平異常升高，并指出其或許是通過調(diào)控EZH2-H3K27me3 途徑，降低了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、遷移的能力，進(jìn)而導(dǎo)致GDM 的發(fā)生[19]。miR-122 是miRNA 的一種類型，前體基因位于18q21.31 位點，其表達(dá)水平與機(jī)體糖脂代謝有關(guān)，目前已經(jīng)證實miR-122 可調(diào)控胰島素抵抗、脂肪細(xì)胞分化等多種生物學(xué)過程[20]。觀察組血清及胎盤miR-122 水平均高于對照組，提示miR-122 在GDM患者體內(nèi)呈高水平表達(dá)，且其高水平表達(dá)與胰島素抵抗有關(guān)?？赡苁莔iR-122 作為肝臟富含的特異性RNA，可以有效激活固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c 以及二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶-2 等，進(jìn)而直接參與早期的肝臟代謝。肝臟早期代謝的異常改變能夠誘發(fā)胰島素抵抗、糖尿病等。還有研究報道利用軟脂酸誘導(dǎo)胰島素抵抗模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)下，miR-122 的表達(dá)明顯上調(diào)，并指出miR-122 參與胰島素抵抗的調(diào)控或許與下調(diào)AMPK 基因表達(dá)有關(guān)[21]。

GDM 孕婦不良妊娠結(jié)局如流產(chǎn)、早產(chǎn)、巨大兒、死胎、死產(chǎn)、胎兒畸形、新生兒呼吸窘迫綜合征及新生兒死亡等發(fā)生率明顯增加[22]。本研究依據(jù)GDM患者妊娠結(jié)局將其分為結(jié)局良好組和不良結(jié)局組，結(jié)果顯示，不良結(jié)局組患者HOMA-IR 及血清和胎盤miR-122 水平均高于結(jié)局良好組，提示miR-122或許參與了GDM 疾病的發(fā)生、發(fā)展，并可影響患者妊娠結(jié)局，這一結(jié)果與禤文婷等研究結(jié)果一致[8]。

綜上所述，GDM 患者伴有明顯的胰島素抵抗，miR-122 在GDM 患者體內(nèi)呈高水平表達(dá)，這可能是GMD 臨床診斷和治療GMD 的潛在靶點。然而，本研究也有一些不足之處，比如研究缺乏體內(nèi)和體外相關(guān)基礎(chǔ)實驗來支持研究結(jié)論。