賁海燕 霍建飛 姚玉榮 高葦 王萬立 郝永娟 曲紅云 張雪巖

摘要：本試驗以茄病鐮刀菌（Fusarium solani）為研究對象，探索了Hoechst 33342及PI熒光染劑對病菌不同活性孢子的色澤差異，明確了病原菌經(jīng)Hoechst 33342染色后的活孢子發(fā)藍色熒光，最佳染色濃度和時間為1ug／mL、20 min；碘化丙啶（PI）染色后的死孢子發(fā)紅色熒光，最佳染色濃度和時間為3ug/mL、10 min。并由此建立了HoechsL 33342-PI熒光雙染技術(shù)，應用該技術(shù)可快速、清晰地甄別出不同濃度氰氫化鈣對茄病鐮刀菌孢子活性和萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的滅殺效果隨著濃度增高而增強，且與處理時間呈正相關(guān)。2 000 mg/L氰氫化鈣處理3h，孢子致死率高達83.97%；500-1000 mg/L處理3h，孢子致死率為7.15%-26.80%，孢子萌發(fā)率為2.40%～3.59%，處理48 h時，孢子致死率達92.07％～100%。250 mg/L氰氫化鈣對茄病鐮刀菌的致死效果微弱或沒有影響。本研究通過菌絲速率法和生物量法進一步驗證了應用Hoechst 33342-PI熒光雙染法評價氰氨化鈣對茄病鐮刀菌孢子活力的影響是可行的。這為突破植物病原微生物藥劑室內(nèi)常規(guī)篩選方法提供了新的思路和技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：Hoechst 33342-PI熒光雙染法；氰氫化鈣；茄病鐮刀菌；生物活性

中圖分類號：S432.4+4 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2023）02-0127-08

氰氨化鈣作為農(nóng)用化學肥料，已有100余年的使用歷史，我國在20世紀60年代主要將其用作氮肥。21世紀初期，大量田間數(shù)據(jù)顯示氰氨化鈣還是一種高效、環(huán)境友好型的土壤消毒劑，能有效防治蕓薹根腫菌（Plasmodiophora brassLcae）、尖孢鐮刀菌（Fusariurn

oxysporun）等引起的多種土傳病害，而關(guān)于茄病鐮刀菌（F.solani）引起的瓜類作物病害防治的相關(guān)報道較少。Bourbos等通過田間試驗表明，氰氨化鈣能有效控制由茄病鐮刀菌引起的黃瓜根腐病。

常規(guī)作用于微生物的藥劑篩選主要建立在室內(nèi)生物活性測定。熒光染色法是醫(yī)學方面檢測細胞凋亡和細胞壞死的重要手段。細胞凋亡的主要形態(tài)特征是細胞體積縮小、孢漿凝縮而不外漏，核染色質(zhì)固縮：而細胞壞死的主要形態(tài)特征是細胞腫脹，體積增大，或DNA降解，細胞破裂，胞漿外漏等。根據(jù)這些特征，選擇適合的熒光染料，可以準確判斷細胞的活力狀態(tài)。植物病原微生物細胞凋亡的表型和生理特征與動物細胞相似，而且細胞結(jié)構(gòu)和代謝過程更為簡單。目前，熒光染色法在植物微生物研究方面僅有少數(shù)報道。

本試驗以茄病鐮刀菌為研究對象，根據(jù)Hoechst 33342、碘化丙啶（propidine iodide，PI）熒光染劑對生物細胞活性的不同作用效果，研發(fā)快速甄別病原菌死活的熒光染色技術(shù)。并基于該技術(shù)檢測氰氨化鈣對茄病鐮刀菌孢子活性的影響，旨在創(chuàng)建快速、準確、靈敏的活性檢測方法，為植物病原微生物藥劑篩選的有效性提供新的思路和檢測技術(shù)手段。同時，依據(jù)藥劑篩選常用的室內(nèi)生物活性測定法，如菌落生長、菌絲生物量、孢子萌發(fā)等指標，設計測定了氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的抑制效果，為進一步開展氰氨化鈣防治由茄病鐮刀菌引起的作物病害提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試菌株：茄病鐮刀菌瓜類?；停‵usanum solani f.sp.cucurbitae），由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所菜病綜防組鑒定保存（菌株編號：HC0903150102）。

供試藥劑：氰氨化鈣（calcium cyanamide，CaCN2），直徑1-6 mm黑色粉末狀，氰氨化鈣含量50%，氮含量20％，鈣含量38%，由寧夏大榮實業(yè)集團有限公司提供。

供試試劑：NaCL、KCL、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4、丙酮、冰醋酸、松柏油等均購自北京化工廠有限責任公司。

儀器設備：HQ-60型旋渦混合器（北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司）：3K15型高速離心機（德國Sigma公司）；UV-1801型紫外可見分光光度計（北京瑞利分析儀器公司）；移液槍（德國Eppendorf公司）；DP72型奧林巴斯熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；XMTD-700水浴鍋（江蘇省金壇市漢康電子有限公司）。

熒光染料：Hoechst 33342、碘化丙啶（propidine iodide，Pl），購于Sigma公司。

1.2熒光染液配制

PBS緩沖液配制：K0 0.20 g/L，NaCl 8.00 g/L，NaH2P04 0.20g/L，Na2HPO4·12H2O 2.89 g/L，pH 7.4。

Hoechst 33342染液配制：稱取0.001 g Hoechst 33342，加入10 mL 0.01 mol/L PBS（ pH 7.4）緩沖液，配成100 ug/mL的母液，4℃避光保存。使用前用PBS（pH 7.4）將其稀釋成所需濃度。

碘化丙啶（PI）染液配制：稱取0.001 g PI，加入10 mL 0.01 mol/L的PBS（pH7.4）緩沖液，配成100 ug/mL的母液，4℃避光保存。使用前用PBS（pH 7.4）將其稀釋成所需濃度。

1.3茄病鐮刀菌孢子懸浮液的制備

在250 mL PD培養(yǎng)基中接種茄病鐮刀菌菌餅，26℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)4d，獲得分生孢子培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液經(jīng)滅菌4層紗布過濾，收集濾液經(jīng)5 000 r/min離心5 min，棄上清液，用無菌水重懸制成1x10個/mL孢子懸液備用。

1.4茄病鐮刀菌無活力孢子的制備

茄病鐮刀菌孢子致死處理采用恒溫水浴熱處理法，取1 mL新鮮孢子懸浮液于100℃沸水浴條件下熱處理10 min致死。

1.5熒光染料對茄病鐮刀菌染色效果評價

取新配制的有活力和無活力的茄病鐮刀菌孢子懸浮液各1 mL，5 000 r/min離心5 min，棄上清：將Hoechst 33342和Pl母液分別稀釋至3ug/mL后各取500 uL，重懸沉淀使孢子濃度為2x10個/mL;室溫下避光靜置染色20 min，分別吸取10 uL孢子染液于載玻片上，加蓋玻片后在熒光顯微鏡下觀察拍照，記錄各熒光染料孵育下死活孢子的染色特征。

1.6熒光雙染法對茄病鐮刀菌染色效果評價

Hoechst 33342-PI雙染法：取新配制的有活力和無活力的茄病鐮刀菌孢子懸浮液各1 mL，混勻后經(jīng)5 000 r/min離心5min，向孢子沉淀中加入500 uL濃度為1 ug/ml Hoechst 33342染液，常溫避光孵育5 min后，加入500 ul濃度為1ug/mL的PI染液，常溫避光染色5 min，吸取10 uL孢子染液于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.7Hoechst 33342和Pl最佳染色濃度及染色時間篩選

取新鮮有活力、濃度為1x10個/mL茄病鐮刀菌孢子懸浮液1 mL，5 000 r/min離心5 min，棄上清，分別重懸于濃度為1、3、6、9 ug/mL的染料500 uL，使孢懸液濃度為2x10個/mL。每個濃度分別染色5、10、15、20 min，每個處理重復3次。于20倍熒光顯微鏡下，每個處理觀察3個視野，每個視野不少于100個孢子，觀察并記錄孢子的染色效果并計算死亡率。

1.8氰氨化鈣對茄病鐮刀菌室內(nèi)生物活性的測定

1.8.1基于Hoechst 33342-PI雙染法評價氰氨化鈣對茄病鐮刀菌孢子活力的影響 將斜面保存的茄病鐮刀菌菌株進行活化，PDA平板上黑暗培養(yǎng)7天后，配制成有活力的茄病鐮刀菌孢子懸浮液（1x10個/mL）分裝到離心管中，每管10 mL備用；分別稱取氰氨化鈣0、0.005、0.01、0.02、0.04 g溶解于上述孢子懸浮液中，配制成氰氨化鈣濃度分別為0、500、1 000、2 000、4 000 ug/mL的孢子懸浮混合液，每個濃度3次重復。分別在藥劑處理0、10 min和3、9、48、72 h后，按1.7中的Hoechst 33342-PI雙染法進行染色，在20倍熒光顯微鏡下，依據(jù)孢子熒光顏色，記錄死、活孢子總量，其中死孢子發(fā)紅色熒光，活孢子發(fā)藍色熒光，凋亡孢子（處于死活之間）發(fā)藍粉色熒光。每個樣本觀察5個視野，每個視野內(nèi)孢子數(shù)量不少于100個，用以下公式計算孢子死亡率和萌發(fā)率。式中：a為顯微鏡視野中發(fā)紅色熒光孢子總數(shù)；b為顯微鏡視野中發(fā)藍色熒光孢子總數(shù)：c為顯微鏡視野中發(fā)藍色熒光且萌發(fā)的孢子總數(shù)。

1.8.2氰氫化鈣對茄病鐮刀茵菌落生長影響的研究 采用菌絲生長速率法測定。稱取氰氨化鈣0、0.002、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g分別溶解在20 mL 50-55℃的PDA培養(yǎng)基中，配制成0、100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的含藥培養(yǎng)基，充分混勻倒平板，待平板凝固后在平板中央接種茄病鐮刀菌菌餅（直徑5 mm），以不加氰氨化鈣的PDA培養(yǎng)基接種茄病鐮刀菌為對照。28℃黑暗培養(yǎng)，每隔48h測量一次菌落直徑，用十字交叉法計算菌落平均直徑，每處理3次重復。

抑菌率（%）=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）／（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100。

1.8.3氰氨化鈣對茄病鐮刀茵菌絲生長量和產(chǎn)孢量影響的研究

稱取不同劑量氰氨化鈣加入PD培養(yǎng)液中，得到終濃度分別為0、100、250、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 mg/L的100mL含藥培養(yǎng)液。在培養(yǎng)5d的茄病鐮刀菌菌落邊緣打取5 mm菌餅，每瓶接種3個菌餅，每個處理3次重復，以不加氰氨化鈣的培養(yǎng)液為對照。25℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)3d后，真空抽濾濾出菌絲，用滅菌水沖洗3次，除去菌餅，與事先烘干至恒重的濾紙一同置于80℃烘箱中烘干至恒重，稱量菌絲干重：收集過濾孢子懸浮液，用血球計數(shù)板記錄各處理的孢子濃度，明確氰氨化鈣對茄病鐮刀菌菌絲量和產(chǎn)孢量的影響。

1.9數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel進行整理，采用sPss26.0對數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA分析，P<0.05表示差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1各熒光染料對茄病鐮刀菌染色效果評價

新制備的茄病鐮刀菌孢子懸浮液經(jīng)Hoechst33342染色后，熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，有活力孢子均勻分散，發(fā)明亮的藍色熒光（圖1）。經(jīng)熱處理致死的孢子，在熒光顯微視野下不發(fā)熒光，該方法僅能觀察到有活力的孢子，不能檢測死亡孢子。

新制備的茄病鐮刀菌孢子懸浮液經(jīng)普通顯微鏡觀察無法區(qū)分死、活孢子（圖2A）：而經(jīng)PI染色，在熒光顯微鏡下觀察，有活力的孢子不發(fā)熒光，死亡孢子發(fā)紅色熒光（圖2B）。經(jīng)高溫處理致死的孢子，在熒光顯微鏡下觀察，細胞界限清晰，均勻分散，發(fā)出強烈的紅色熒光。該方法只能觀察到死孢子，不能檢測有活力的孢子。

2.2熒光雙染法對茄病鐮刀菌染色效果評價

茄病鐮刀菌死、活孢子混合懸浮液在普通顯微鏡下無法區(qū)分（圖3A）：而經(jīng)Hoechst 33342-PI雙染后，在熒光顯微鏡下觀察，有活力的孢子發(fā)藍色熒光，死亡孢子發(fā)紅色熒光，二者顏色反差強烈，且死亡孢子分散度較好，無聚集現(xiàn)象（圖3B）。該方法可將死、活孢子在同一視野中區(qū)分開，Hoechst 33342-PI熒光雙染可作為茄病鐮刀菌孢子活力檢測及評價的有效方法。

2.3Hoechst 33342-PI雙染法最佳染色條件

熒光染料有一定毒性，濃度過高或是染色時間過長可能對孢子活性產(chǎn)生不利影響。本研究發(fā)現(xiàn)茄病鐮刀菌孢子對Hoechst 33342和PI的敏感程度存在差異。

結(jié)果表明（表1），Hoechst 33342染液濃度1-3ug／mL對孢子的毒性較小，隨著染色時間的延長孢子死亡率差異不顯著，為0.51%-0.93%：染液濃度6 ug/mL在15 min時的死亡率顯著增加，染色20 min的死亡率為2.60％；染液濃度為9ug/mL對孢子表現(xiàn)出明顯的毒性，孢子死亡率顯著增加，染色5 min時死亡率為12.07％，20 min時達22.01%。結(jié)合熒光顯微鏡觀察，1 ug/mL染色效果明顯，孢子邊界清晰，較長時間染色效果更穩(wěn)定，綜合判定Hoechst 33342染液最佳濃度為1ug/mL，染色時間為20 min。

PI染液致死率與染液濃度和染色時間呈正相關(guān)（表1）。PI染液濃度1-3 ug/mL隨著染色時間的增加，孢子死亡率差異不顯著，其中染液濃度3 ug/mL染色10 min時染色清晰程度趨于穩(wěn)定，死亡率為0.81%；染色濃度6 ug/mL的致死率增加明顯，染色20 min的死亡率為5.21％；染液濃度9 ug/mL的死亡率高達19.57%-31.12%。綜合分析，PI染液最佳濃度為3 ug/mL，染色時間為10 min，此時死孢子發(fā)出強烈的紅色熒光，分散度較好。

2.4基于Hoechst 33342 -PI雙染法評價氰氨化鈣對茄病鐮刀菌孢子活力的影響

通過熒光顯微鏡能直觀監(jiān)測氰氨化鈣不同濃度處理對茄病鐮刀菌孢子死活和萌發(fā)的影響。結(jié)果表明，氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的殺滅效果與其處理濃度和處理時間呈正相關(guān)（圖4）。氰氨化鈣處理10 min，各處理的孢子致死效果不明顯，死亡率接近零；處理3h，氰氨化鈣1 000 mg/L和2 000mg/L的孢子致死率分別為26.80%和83.97％．250mg／L和500 mg/L的孢子致死率僅為9.20%和7.15％：隨著氰氨化鈣處理時間的延長，死亡孢子逐漸增多，處理48 h時，氰氨化鈣500-2 000mg/L時的孢子致死率高達92.07%-100%。250mg/L的致死效果微弱，處理72 h的孢子致死率僅為5.64％。

氰氨化鈣對茄病鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用隨著濃度和處理時間的增加而增強（圖5）。處理10 min，1 000-2 000 mg/L對孢子萌發(fā)已表現(xiàn)一定的抑制作用，萌發(fā)率為3.15％-3.33%；處理3h，2 000 mg/L的孢子萌發(fā)率為零，500-1 000mg/L的孢子萌發(fā)率為2.40%-3.59%，與對照相比降低56.54％-70.94%；隨著處理時間延長，氰氨化鈣的抑菌作用進一步增強，處理48 h，1 000mg/L時的孢子萌發(fā)率為零，500 mg/L時的孢子萌發(fā)率降至2.84%，與對照相比降低60.50%：處理72 h，500 mg/L時的孢子萌發(fā)情況與48 h相當，趨于穩(wěn)定。250 mg/L對孢子萌發(fā)幾乎沒有抑制作用，后期還有一定的促進作用，可能是低濃度氰氨化鈣在毒性微弱的情況下，為茄病鐮刀菌提供了氮源更有利于其萌發(fā)。

2.5氰氨化鈣對茄病鐮刀菌菌落生長的影響

在含有不同濃度氰氨化鈣的PDA培養(yǎng)基上進行抑菌試驗，結(jié)果表明除低濃度以外，氰氨化鈣的抑菌效果隨濃度的增加而增強，但隨著處理天數(shù)的延長，抑菌效果逐漸減弱（表2）。低濃度氰氨化鈣（100-500 mg/L）對茄病鐮刀菌的生長有一定的促進作用，比對照處理生長速率快，這可能是由于低濃度氰氨化鈣釋放的有毒物質(zhì)氰氨不足以對茄病鐮刀菌產(chǎn)生毒性，反而其提供的氮源被茄病鐮刀菌充分利用促其生長。培養(yǎng)2d時，氰氨化鈣1000-3 000 mg/L的抑菌效果逐漸增強，抑菌率為48.26％-100％；培養(yǎng)5d抑菌作用減弱，1 000-2 500mg/L的抑菌率為4.88%-25.66%，可能是氰氨有毒物質(zhì)分解完全，茄病鐮刀菌恢復生長。3 000mg/L氰氨化鈣為茄病鐮刀菌菌絲生長致死濃度，抑菌率為100%。

2.6氰氨化鈣對茄病鐮刀菌菌絲生長量和產(chǎn)孢量的影響

由圖6可知，100 mg/L氰氨化鈣對茄病鐮刀菌菌絲生長量沒有抑制作用，與對照處理差異不顯著，但其對病菌產(chǎn)孢抑制作用明顯，產(chǎn)孢量與對照相比降低40.43%（圖7）。隨著氰氨化鈣濃度增加，茄病鐮刀菌的菌絲生長量和產(chǎn)孢量逐漸降低，3 000 mg/L抑菌作用最強，菌絲生長量和產(chǎn)孢量與對照相比分別降低85.00％和97.32%。

3討論與結(jié)論

熒光染色技術(shù)已在醫(yī)學、神經(jīng)學、微生物學及遺傳學等研究學科得到了廣泛應用，然而該技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)以及食品安全領域的研究相對較少。不同熒光染料可對不同活性的細胞進行染色，因此，不同熒光染料合理的結(jié)合使用，可以達到檢測細胞活性的目的。本試驗采用Hoechst 33342和Pl熒光染料分別對茄病鐮刀菌孢子的活力進行了熒光顯微鏡觀察。其中熒光染料Hoechst 33342的染色機理是直接作用有活性細胞的DNA上，在熒光顯微鏡下孢子發(fā)藍色熒光，無聚集現(xiàn)象。PI染色機理是對失去細胞膜完整性的死細胞進行染色，并發(fā)強烈的紅色熒光，死細胞較多時會有少量聚集現(xiàn)象，但不影響觀察計數(shù)。

以上兩種熒光染料只能單純鑒定茄病鐮刀菌孢子的死或活，在同一顯微視野下無法對樣品中孢子死活區(qū)分開，在實踐應用中存在限制。本試驗對茄病鐮刀菌孢子進行Hoechst 33342-PI熒光雙染觀察，發(fā)現(xiàn)其能很好的區(qū)分茄病鐮刀菌孢子的死活，在熒光顯微視野下，活孢子發(fā)藍色熒光，死孢子發(fā)強烈的紅色熒光，凋亡孢子（處于死活之間）發(fā)藍粉色熒光。熒光染料是一種毒性試劑，濃度過高或是染色時間過長均會對生物細胞造成傷害，導致其死亡：染色時間過短或是濃度較低會影響染色效果，發(fā)出的熒光不強烈，這些因素均會干擾試驗檢測計數(shù)結(jié)果。為了更好地將Hoechst 33342-PI熒光雙染法應用于茄病鐮刀菌的檢測以及藥劑篩選等，本研究探索出其最佳染色技術(shù)參數(shù)，Hoechst 33342濃度在6ug/mL以上，染色超過10 min，對孢子表現(xiàn)出一定毒性作用，濃度1-3 ug/mL對孢子幾乎沒有毒性作用，且孢子發(fā)出明亮藍色熒光，界限清晰。綜合判定Hoechst 33342的最佳濃度為1 ug/mL，染色20min的效果最理想：Pl染料對孢子死活的影響較大，毒性更強，特別是濃度6 ug／mL以上表現(xiàn)出明顯毒性，從清晰度、穩(wěn)定性判斷3 ug／mL為最佳濃度，染色10 min即能達到較好的染色效果。

通過孢子染色比較試驗，可測定不同殺菌劑對病原菌的抑制作用。施竹鳳等采用臺盼藍孢子染色方法，發(fā)現(xiàn)19種藥劑對根腫病菌的致死效果差異明顯，其中明迪、福帥得等藥劑的致死率較高（55.99％～162.49%），且藥劑處理時間越長孢子死亡率越高。楊玲玉等對真菌孢子進行碘化丙錠染色發(fā)現(xiàn)，常溫條件下5 000 ug/mL殼聚糖對灰葡萄孢（BotrytLs cinerea）和擴展青霉（Penicillium， expansum，）孢子的質(zhì)膜均有明顯的破壞作用。本研究應用Hoechst 33342-PI熒光雙染技術(shù)結(jié)合熒光顯微鏡，可快速、清晰、直觀地觀測到氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的致死作用。試驗結(jié)果表明，高濃度氰氨化鈣（2 000 mg/L）處理3h，顯微視野中大部分孢子呈紅色熒光，致死率達83.97％，此時孢子幾乎不萌發(fā)，說明高濃度氰氨化鈣釋放了大量的有毒氰氨，在短時間內(nèi)就可對茄病鐮刀菌孢子有致死作用。氰氨化鈣500-1 000 mg／L的致死效果與處理時間呈正相關(guān)，隨著處理時間延長，視野中發(fā)紅色熒光的孢子增多，萌發(fā)孢子減少，處理48 h時的孢子致死率高達92.07％-100％。250 mg/L氟氨化鈣對茄病鐮刀菌的致死效果微弱。

室內(nèi)生物測定技術(shù)是利用靶標生物等對藥劑的反應來鑒別農(nóng)藥藥效的一種手段。本試驗通過菌絲生長速率法、生物量法進一步明確了氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的抑制作用。測定結(jié)果顯示，100-250 mg/L氰氨化鈣對茄病鐮刀菌有一定的促進作用。崔國慶等研究表明，100 mg/L氰氨化鈣對尖孢鐮刀菌（F.oxysporum，）有促進作用，250 mg/L的抑菌效果較微弱，而1 000 mg/L對尖孢鐮刀菌的抑制率達到97.02%，與本試驗結(jié)果一致。500-3 000 mg/L氰氨化鈣對茄病鐮刀菌的抑制效果增強，且隨著處理時間延長致死率增高。本試驗為拓寬氰氨化鈣在植物病害防治中的作用提供了借鑒，有助于進一步指導氰氨化鈣防治植物病害開展田間藥效試驗。