趙翠 趙效南 閆超 胡明 張慶 駱延波 劉玉慶

摘要：本研究利用分離自生鮮牛乳樣品中的金黃色葡萄球菌作為宿主菌，從污水中分離得到一株噬菌體，命名為RPCSa20091。對(duì)其生物學(xué)特性研究結(jié)果顯示，該噬菌體屬于微球形有尾目噬菌體；宿主譜較寬，裂解率為81.8%；在40℃條件下噬菌體相對(duì)穩(wěn)定，45℃條件下不生長(zhǎng)，pH值在3-10時(shí)較穩(wěn)定，pH值在1-2和11-12時(shí)噬菌體完全失活；其最佳感染復(fù)數(shù)為0.1；潛伏期為15 min．裂解周期為75 min。本研究結(jié)果為金黃色葡萄球菌噬菌體用于奶牛乳腺炎的治療提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：金黃色葡萄球菌；噬菌體；生物學(xué)特性

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.61+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2023）02-0135-05

金黃色葡萄球菌是一種重要的人畜共患病原菌，可導(dǎo)致人類(lèi)和動(dòng)物的多種疾病，例如敗血癥、心內(nèi)膜炎、乳腺炎以及腦膜炎等，嚴(yán)重威脅公共健康。同時(shí)金黃色葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎最常見(jiàn)的病原體之一。中國(guó)約有10%-40％奶牛乳腺炎是由金黃色葡萄球菌引起，受感染的動(dòng)物通常將金黃色葡萄球菌排入到乳汁中。目前治療金黃色葡萄球菌感染主要依靠抗生素，但金黃色葡萄球菌可以獲得賦予對(duì)不同抗生素耐藥性的基因。最廣泛且常見(jiàn)的耐藥菌株是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，對(duì)所有B-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物耐藥。盡管世界各國(guó)科學(xué)家在乳腺炎的病原、疫苗研發(fā)等方面取得大量研究成果，但目前還沒(méi)有很好的措施能夠達(dá)到滿(mǎn)意的防治效果。噬菌體作為一種寄生在細(xì)菌中的病毒，能夠有效裂解細(xì)菌，近年來(lái)被認(rèn)為具有替代抗生素治療金黃色葡萄球菌的潛在價(jià)值。

噬菌體是一種可以殺死目標(biāo)宿主細(xì)菌的病毒，能夠?qū)⑦z傳物質(zhì)注入細(xì)菌中并在其內(nèi)復(fù)制。與抗生素相比，噬菌體具有多種優(yōu)勢(shì)，例如，不會(huì)破壞宿主的正常微生物菌群、具有很強(qiáng)的宿主特異性、只在感染部位復(fù)制且無(wú)嚴(yán)重副作用，而且可以與抗生素進(jìn)行協(xié)同治療以達(dá)到更好的治療效果，是一種理想的抗生素替代品。目前已經(jīng)鑒定出200多種裂解性金黃色葡萄球菌噬菌體。同時(shí)金黃色葡萄球菌噬菌體體內(nèi)和體外治療試驗(yàn)結(jié)果表明其具有有效的抗菌活性。皮下注射金黃色葡萄球菌噬菌體可預(yù)防家兔和小鼠膿腫的形成。然而金黃色葡萄球菌噬菌體的研究和治療還有限，仍需要更多的科研探索來(lái)支持。

本研究以從生鮮牛奶樣品中分離的金黃色葡萄球菌為宿主進(jìn)行噬菌體分離鑒定，對(duì)篩選的噬菌體進(jìn)行生物學(xué)特性分析，以期為金黃色葡萄球菌噬菌體的研究和后續(xù)的治療防控提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)菌株

金黃色葡萄球菌分離自生鮮牛乳樣品，由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所公共衛(wèi)生研究室提供。

1.2噬菌體的分離與純化

從濟(jì)南市某奶牛場(chǎng)污水處理池內(nèi)采集20 mL污水樣品，4 000xg離心15 min后，取上清，用0.22 um濾膜過(guò)濾除菌后置于4℃?zhèn)溆?。取生長(zhǎng)到指數(shù)期的金黃色葡萄球菌500 uL與500 uL濾液混合，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中，200 r/min培養(yǎng)16 h?；旌衔? 000xg、4℃離心15 min，取0.1mL上清液與0.1 mL金黃色葡萄球菌在3 mL LB（0.7%瓊脂）軟瓊脂中混合均勻并傾倒平板，然后用1.5%瓊脂覆蓋在LB培養(yǎng)基表面，37℃培養(yǎng)過(guò)夜后，用注射器針從平板中挑取邊緣整齊、型體較大、色澤透亮的噬菌體斑塊接種到宿主菌培養(yǎng)液中，37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)3h后，過(guò)濾取上清，取10倍倍比稀釋的上清稀釋液與宿主菌混勻吸附后，采用雙層瓊脂平板法培養(yǎng)，重復(fù)3次以上，直至在同一個(gè)平板上噬菌斑形態(tài)大小基本一致，即得到純的噬菌體。

1.3噬菌體的電鏡觀察

噬菌體原液經(jīng)4 000×g、4℃離心40 min獲得效價(jià)為10 pfu/mL的噬菌體濃縮液，并將其懸浮在2％戊二醛中。靜置30 min后，4 000xg離心40 min，然后將沉淀懸浮在PBS中。將噬菌體樣品滴加到銅網(wǎng)上吸附10 min，用濾紙小心吸除噬菌體溶液。滴加1%乙酸雙氧軸溶液5 uL，染色2 min后吸除染液，室溫晾干后用透射電鏡觀察。

1.4噬菌體宿主譜測(cè)定

將121株金黃色葡萄球菌分離株培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，取100 uL菌液與100 uL噬菌體混勻后，37℃孵育15 min，然后通過(guò)雙層平板法觀察有無(wú)噬菌斑形成。

1.5噬菌體穩(wěn)定性

參照參考文獻(xiàn)[14]進(jìn)行。噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定：將噬菌體懸浮液（10 pfu/mL）在不同溫度下（4、37、50、60、70℃）孵育1h；噬菌體最適pH值測(cè)定：將噬菌體懸浮液（10 pfu/mL）放置在不同pH值（1-12）的SM緩沖液中，37℃孵育1h。噬菌體效價(jià)通過(guò)雙層平板法測(cè)定。

1.6噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)（MOI）的測(cè)定

參照Li等的方法。首先將宿主菌濃度調(diào)整為10 cfu/mL，然后將不同稀釋濃度的噬菌體按照不同的感染復(fù)數(shù)（MOI= 0.001、0.01、0.1、1、10）與等體積的菌液混合，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4h。將混合物4 000xg離心10 min后，通過(guò)雙層平板法測(cè)定噬菌體效價(jià)，效價(jià)最高的即為最佳感染復(fù)數(shù)。

1.7噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

參照Pajunen等的方法。將500 uL噬菌體（10 pfu/mL）和500 uL宿主菌（10 cfu/mL）在37℃條件下培養(yǎng)5min。將混合物以13 000xg離心1 min，棄上清，將沉淀物懸浮在3 mL LB培養(yǎng)液中，37℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)。每15 min取樣500 uL，連續(xù)取樣120 min，使用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)，并繪制噬菌體生長(zhǎng)曲線。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均使用統(tǒng)計(jì)分析系統(tǒng)SPSS 20.0進(jìn)行分析，使用Graphpad prism 5 software（Graphpad Software Inc.，San Diego，CA）作圖。

2結(jié)果與分析

2.1噬菌體的分離與純化

從奶牛場(chǎng)污水樣品中分離到一株金黃色葡萄球菌噬菌體，純化3代后，獲得直徑大小為1-2mm、邊緣整齊透亮的噬菌斑（圖1），命名為RPC-Sa20091。

2.2噬菌體的電鏡觀察

透射電鏡觀察結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)，噬菌體RPC-Sa20091為微球形有尾目噬菌體，由清晰的正二十面體頭部和細(xì)長(zhǎng)的尾部組成。頭部直徑約為56-59 nm，整個(gè)噬菌體長(zhǎng)度約在194-294 nm之間。

2.3噬菌體宿主譜測(cè)定

結(jié)果顯示，噬菌體RPCSa20091能在99株金黃色葡萄球菌的雙層瓊脂平板上產(chǎn)生噬菌斑，表明噬菌體能夠裂解99株金黃色葡萄球菌，具有很寬的宿主譜，其裂解率為81.8％。

2.4噬菌體穩(wěn)定性

噬菌體RPCSa20091的熱穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在40℃條件下噬菌體相對(duì)穩(wěn)定，在45℃條件下不生長(zhǎng)（圖3A）。噬菌體RPCSa20091的酸堿穩(wěn)定性結(jié)果顯示，當(dāng)pH值在3-10時(shí)，噬菌體比較穩(wěn)定，但當(dāng)pH值在1-2和11-12時(shí)完全失活（圖3B）。

2.5噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

噬菌體RPCSa20091最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定結(jié)果（圖4）顯示，當(dāng)MOI為0.1時(shí)，噬菌體效價(jià)最高。

2.6噬菌體一步生長(zhǎng)曲線

噬菌體RPCSa20091一步生長(zhǎng)曲線結(jié)果（圖5）顯示，噬菌體具有較短的潛伏期，約為15 min，裂解周期為75 min，裂解量為10 pfu/mL。

3討論與結(jié)論

奶牛乳腺炎被認(rèn)為是所有已知?jiǎng)游锛膊≈凶畎嘿F的疾病，已被確定是影響奶牛健康最主要的疾病，可帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。噬菌體療法為控制由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎提供了一種新的方法。本研究以生鮮牛乳中分離的金黃色葡萄球菌為宿主菌，從奶牛場(chǎng)污水中分離純化得到一株噬菌體RPCSa20091，繼而對(duì)其進(jìn)行一系列生物學(xué)特性分析。

通過(guò)電鏡觀察得知噬菌體RPCSa20091為長(zhǎng)尾噬菌體，與報(bào)道的大多數(shù)已知的金黃色葡萄球菌噬菌體屬于長(zhǎng)尾噬菌體相吻合，但王一帆等報(bào)道的噬菌體P42為短尾噬菌體，并且只能裂解宿主菌，宿主譜較窄。本研究中，噬菌體RPCSa20091具有較寬的宿主譜（81.8%），能夠裂解與奶牛相關(guān)的金黃色葡萄球菌，表明其具有潛在的噬菌體治療作用。噬菌體MSA6同樣具有寬的宿主譜，能夠裂解與牛乳腺炎相關(guān)的致病葡萄球菌以及與人類(lèi)感染相關(guān)的耐抗生素金黃色葡萄球菌。噬菌體RPCSa20091穩(wěn)定性結(jié)果顯示，在40℃條件下相對(duì)穩(wěn)定，但在45℃條件下基本上不生長(zhǎng)。蔡天舒等報(bào)道的噬菌體qdsa001在60℃條件下仍具有良好的耐受性，表明噬菌體RPCSa20091耐熱性較差。噬菌體RPCSa20091在pH值為3-10范圍內(nèi)穩(wěn)定存在，表明該噬菌體對(duì)酸堿溶液有一定的抵抗力，可以通過(guò)口服途徑進(jìn)行治療。通過(guò)研究噬菌體RPCSa20091的一步生長(zhǎng)曲線得知，該噬菌體與王倩等分離報(bào)道的噬菌體有著短潛伏期、長(zhǎng)爆發(fā)期及高裂解量的優(yōu)點(diǎn)一致。

綜之，噬菌體RPCSa20091具有高效裂解活性和較寬的宿主譜，通過(guò)了解其生物學(xué)特性，為用于由金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳腺炎及相關(guān)疾病的預(yù)防和治療奠定了基礎(chǔ)。