張延赤,王 旭,吳秀麗,袁久彤,馬英偉,王利武,李明輝,高福紅,李丹丹,張 遠(yuǎn),孫利偉

(長春市兒童醫(yī)院,吉林 長春130061)

言語語言障礙(speech and languge disorders,SLD)是兒童時(shí)期常見的發(fā)育障礙性疾病之一[1]。言語是指人們經(jīng)口發(fā)聲表達(dá)思維活動(dòng)和意愿的語言實(shí)踐;語言是人類社會(huì)共同使用的代碼,同思維有密切的聯(lián)系,是人類形成和表達(dá)思想的手段,也是人類社會(huì)最基本的信息載體。言語障礙指言語發(fā)育偏離正常順序,出現(xiàn)語言感受、表達(dá)或應(yīng)用困難[2]。兒童中有3%～6%存在語言障礙[3]。SLD 給社會(huì)、家庭和個(gè)人造成極大的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān);倍受社會(huì)和家長的關(guān)注。近年有關(guān)維生素D受體(Vitamin D receptor,VDR)對(duì)神經(jīng)精神疾病關(guān)聯(lián)的報(bào)道較多[4-6],但是,VDR基因SNP多態(tài)性與兒童SLD 的關(guān)系罕見報(bào)道。本文對(duì)來我院就診的488例SLD兒童進(jìn)行VDR FokI (rs2228570)、BsmI(rs 1544410)、 ApaI(rs 7975232)和TaqI(rs 731236)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism,SNPs)檢測和分析;并與健康體檢兒童進(jìn)行對(duì)照。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象及標(biāo)本采集

觀察組為2021年7月—12月在我院康復(fù)科、心理科和神經(jīng)內(nèi)科以SLD就診的488例兒童?？祻?fù)科、心理科采集口腔頰粘膜脫落細(xì)胞;神經(jīng)內(nèi)科患兒留取末梢血標(biāo)本。對(duì)照組為同期來院健康體檢兒童,在向患兒家長告知,取得家長同意并簽署知情同意書后留取口腔頰粘膜脫落細(xì)胞標(biāo)本。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn) ①語言發(fā)育遲緩,兒童語言發(fā)育遵循正常順序,未達(dá)到與其年齡相應(yīng)的水平,表現(xiàn)為年幼兒童的語言特征。包括智力發(fā)育遲緩、特發(fā)性語言障礙、行為障礙和環(huán)境因素。②語言障礙,語言發(fā)育偏離了正常順序,存在表達(dá)性語言、感受性語言或應(yīng)用性語言方面的困難。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) ①重度精神發(fā)育遲滯;②腦外傷、腦腫瘤等獲得性SLD。

1.2 研究方法

1.2.1基因組DNA提取 口腔脫落細(xì)胞拭子DNA 提取,應(yīng)用 Tiangen Biotech 公司微量樣品基因組DNA提取試劑盒,按試劑說明書提取棉拭子樣本基因組DNA;血液樣本,應(yīng)用Tiangen Biotech公司血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒,按說明書提取血清樣本基因組DNA。

1.2.2SNP 位點(diǎn)選擇 在PubMed中檢索VDR基因多態(tài)性位點(diǎn)的文獻(xiàn),應(yīng)用haploview軟件檢索VDR常見基因標(biāo)簽,并且考慮功能位置的基因,在VDR基因外顯子和內(nèi)含子區(qū)各選取2個(gè)基因標(biāo)簽,分別為外顯子區(qū)Fok I(rs2228570)和Taq I(rs731236;內(nèi)含子區(qū)Bsm I(rs1544410)和Apa I(rs7975232)。多態(tài)性位點(diǎn)信息及引物序列見表1。

表1 言語語言障礙伴隨其他臨床診斷(例數(shù))

1.2.3聚合酶連反應(yīng)(PCR) DNA 擴(kuò)增試劑為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品。反應(yīng)體系包括:2 × Phanta Max Master Mix 12.5 μl,上下游引物[Forward Primer、Reverse Primer(10 μM)]各1 μl,模板(Template)1 μl,加超純水(ddH2O)補(bǔ)足25 μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性3 min;95℃變性15sec、55℃退火15sec、72℃延伸15sec,共計(jì)35個(gè)循環(huán);72℃保溫5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為:675 bp、608 bp、405 bp和608 bp。

1.2.4PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳;電泳目的條帶用美國Omega Bio-tek公司核酸純化試劑盒(Gel Extracttion Kit)回收正確的PCR產(chǎn)物。

1.2.5測序 委托吉林省庫美公司完成。應(yīng)用PCR擴(kuò)增的上游引物,在ABI 3730XL測序儀進(jìn)行測序分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn),計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析VDR SNP位點(diǎn)基因型、等位基因頻率,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)分析判斷哈迪溫伯格(Hardy-Weinberg,H-W)平衡;P>0.05為H-W平衡。

2 結(jié)果

2.1 一般狀況

本文觀察組納入488例SLD患兒,其中男性346例,女性142例,男女之比為2.44∶1。健康對(duì)照116,男性56例,女性60例,男女之比為1∶1.07。觀察組男性明顯多于女性,存在明顯差異,經(jīng)卡方檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=23.387,P=0.000)。觀察組平均年齡為(63.14±37.57)月齡,對(duì)照組年齡為(61.09±30.69)月齡,兩組比較年齡無明顯差異(t=0.539,P=0.590)。觀察組和對(duì)照組VDR基因多態(tài)性基因型、等位基因頻率均符合Hardy-Weinbeig平衡,卡方檢驗(yàn)P>0.05。

2.2 臨床診斷

488例患兒均表現(xiàn)為SLD。臨床診斷語言發(fā)育遲緩84例(17.21%),特發(fā)性SLD 228例(46.72%);240例(49.18%)患兒SLD伴有其他疾病,具體臨床診斷見表1。

2.3 VDR 基因多態(tài)性SNP分布

2.3.1VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點(diǎn)SNP多態(tài)性,PCR產(chǎn)物測序,核酸序列峰圖,見圖1。

圖1 VDR SNP測序峰圖

2.3.2VDR基因及等位基因頻率 488例SLD患兒BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點(diǎn)SNP多態(tài)性分布,基因型分布,見表2;等位基因分布,見表3。觀察組和對(duì)照組比較ApaI和FokI區(qū)rs 7975232和rs2228570位點(diǎn)基因型和等位基因分布存在明顯差異;BsmI和TaqI區(qū)rs 1544410和rs 731236位點(diǎn)基因型和等位基因分布無差異。

表2 VDR基因rs7975232、rs2228570、rs1544410和rs731236位點(diǎn)基因型分布(例數(shù))

表3 VDR基因rs 7975232、rs 2228570、rs 1544410和rs731236位點(diǎn)等位基因分布(例數(shù))

2.3.3不同SLD VDR基因rs 7975232和rs2228570位點(diǎn)SNP分布 將488例觀察組按疾病種類分4組,觀察組1為單純語言發(fā)育落后,患兒20例;觀察組2為特發(fā)性SLD組,患兒228例;觀察組3為心理障礙伴SLD,患兒114例;觀察組4為神經(jīng)系統(tǒng)疾病伴SLD,患兒126例。4組患兒ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)基因型及等位基因頻率見表4、表5。ApaI(rs 7975232)基因型,與對(duì)照組比較,觀察組1無差異;其他3組存在明顯差異;FokI(rs2228570)基因型,與對(duì)照組比較,4個(gè)觀察組均存在明顯差異。ApaI(rs 7975232)等位基因分布,與對(duì)照組比較,觀察組3存在明顯差異;FokI(rs2228570)等位基因分布,與對(duì)照組比較,觀察組1-4均存在差異,經(jīng)卡方檢驗(yàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表4 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位點(diǎn)基因型分布(例數(shù))

表5 VDR基因ApaI(rs 7975232)和FokI(rs2228570)位點(diǎn)等位基因分布(例數(shù))

2.4 VDR基因多態(tài)性與SLD的相關(guān)性

2.4.1ApaI(rs 7975232)多態(tài)性與SLD的相關(guān)性 在ApaI區(qū)rs 7975232位點(diǎn)基因型GA較GG/AA發(fā)生SLD的風(fēng)險(xiǎn)高,OR=2.246,95% CI(1.440～3.502)。G等位基因發(fā)生SLD的風(fēng)險(xiǎn)高,OR=1.461,95% CI(1.027～2.078)。

2.4.2FokI(rs2228570)多態(tài)性與SLD的相關(guān)性 在FokI區(qū),rs2228570位點(diǎn),基因型GA較GG/AA發(fā)生SLD的風(fēng)險(xiǎn)高,OR=3.068,95% CI為(1.968～4.785)。G等位基因發(fā)生SLD的風(fēng)險(xiǎn)高,OR=1.649,95% CI為(1.234～2.204)。

3 討論

語言是人類高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng)的一種形式,兒童自出生起便開始學(xué)習(xí)語言,語言發(fā)展的歷程是非常復(fù)雜的過程。語言發(fā)育影響因素包括:遺傳學(xué)因素、語言學(xué)因素、生理學(xué)因素、社會(huì)學(xué)因素。語言在人們認(rèn)知社會(huì)和發(fā)揮社會(huì)功能中具有重要作用。SLD是遺傳與環(huán)境交互作用的結(jié)果,具有復(fù)雜遺傳模式的多因素起源[7]。

近年,大量的研究證實(shí)VDR基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8-10]。VDR為親核蛋白,在神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中有較多表達(dá),屬于超家族成員。VDR 經(jīng)配體 1α,25(OH)2D3 激活后發(fā)揮核受體作用[11]。維生素D的許多生物學(xué)功能都是通過VDR介導(dǎo)調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄來實(shí)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn):維生素D在大腦發(fā)育、神經(jīng)傳遞、神經(jīng)保護(hù)和免疫調(diào)節(jié)中起著關(guān)鍵作用;VDR存在于發(fā)育中和成年的大腦中,介導(dǎo)維生素D對(duì)大腦發(fā)育和功能的影響[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)VDR在胚胎第12天就在大腦中出現(xiàn),第15天到第23天,VDR蛋白和mRNA的表達(dá)普遍增加,并且在大腦各個(gè)區(qū)域廣泛分布[13]。提示VDR在腦發(fā)育和語言發(fā)育中起重要作用。本文首次對(duì)SLD患兒VDR基因SNP多態(tài)性進(jìn)行檢測及分析,探討發(fā)生SLD的遺傳因素,為有效預(yù)防SLD提供科學(xué)依據(jù)。

VDR的變異可能在每個(gè)人群所發(fā)揮的作用不同,VDR這些多態(tài)性可能影響其活性和功能。本研究對(duì)488例SLD患兒檢測并分析VDR基因BsmI、ApaI 、TaqI和FokI區(qū),rs 1544410、rs 7975232、rs 731236和rs2228570位點(diǎn)SNP多態(tài)性。發(fā)現(xiàn)ApaI(rs 7975232,G→A)和FokI(rs2228570,A→G)與SLD發(fā)生相關(guān);rs 7975232 G/A基因型,rs2228570 A/G 基因型發(fā)生SLD風(fēng)險(xiǎn)高;rs 7975232 G和rs2228570 G等位基因是發(fā)生SLD的危險(xiǎn)因素;BsmI區(qū)rs 1544410位點(diǎn)和TaqI區(qū)rs 7975232位點(diǎn)與SLD無關(guān)。Can MS等研究發(fā)現(xiàn)Fok I 多態(tài)性與抑郁癥發(fā)生無相關(guān)性[14]。Taq I 位點(diǎn)的 T 等位基因以及 Apa I 位點(diǎn)的 a 等位基因與自閉癥發(fā)生率降低相關(guān)[15]。

國內(nèi)外研究均顯示SLD的發(fā)病率存在性別差異。本研究男性明顯多于女性,男女之比為2.44∶1。瑞典Schachinger-Lorentzon U的相關(guān)研究,男女之比為2∶1[7],周浩相關(guān)研究男女之比為4.42∶1[1]。提示人們對(duì)于男性嬰幼兒,應(yīng)加強(qiáng)言語交流,注重語言發(fā)育情況,及時(shí)發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)進(jìn)行相應(yīng)的檢查和治療。

兒童SLD種類多,發(fā)生原因復(fù)雜。早期明確病因,及時(shí)有效干預(yù),對(duì)于早期治愈和改善預(yù)后有積極意義。本文語言發(fā)育遲緩17.21%(84/488),特發(fā)性SLD 46.72%(228/488);接近陳煒報(bào)道特發(fā)性SLD比率46.90%[16],低于周浩報(bào)道的54.37%[1]。智力發(fā)育落后或障礙4.92%(24/488);本研究心理疾病伴SLD 占比為23.36%(114/488),神經(jīng)系統(tǒng)疾病伴SLD患兒占比為25.82%(126/488)。對(duì)于以SLD就診的兒童首先要明確病因,根據(jù)病因進(jìn)行相應(yīng)的治療,可避免貽誤病情,取得最佳療效和改善預(yù)后。